一种重组人促红素的无血清培养基，其应用以及重组人促红素的制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物制药领域，具体讲，涉及一种重组人促红素的无血清培养基，其应用以及重组人促红素的制备方法。培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂中含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3和大豆蛋白水解液；还含有正丁酸钠、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺。本发明提高了CHO细胞在无血清培养阶段表达量、提高了提高CHO细胞在无血清培养阶段表达高活性EPO的比例、延长了细胞在无血清状态下存活的时间，提高了EPO的产量。
【专利说明】一种重组人促红素的无血清培养基，其应用以及重组人促红素的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，具体讲，涉及一种重组人促红素的无血清培养基，其应用以及重组人促红素的制备方法。
【背景技术】
[0002]促红细胞生成素(简称促红素Erythropoietin, ΕΡ0)是由肾脏和肝脏分泌的一种糖蛋白激素类内源性生理物质，能够促进自身红细胞的生成。1989年6月，美国FDA正式批准由安进公司研制的重组人促红素(r-HuEPO)上市，r-HuEPO由165个氨基酸组成，通过DNA重组技术获得。重组人促红素与人体内源性EPO具有相同的生理活性。重组人促红素，主要适应症为治疗因慢性肾衰所引起的贫血症、外科围手术期的红细胞动员，目前也有报道应用于治疗癌症病人接受化学药物治疗(简称化疗)引起的贫血、纠正多发性骨髓瘤(MM)相关的贫血、早产儿贫血和孕妇妊娠期及产后贫血、艾滋病患者治疗引起的贫血，类风湿关节炎、红斑狼疮及严重的寄生虫病患者的慢性贫血、骨髓增生异常综合性贫血、血红蛋白病的镰状红细胞贫血及地中海贫血、炎症性肠疾患相关性贫血。还可应用于增强运动耐力，减少高原反应和需输血的心绞痛患者。
[0003]重组人促红素是由基因重组的CHO细胞经过复苏、扩增培养和无血清培养后，无血清培养液经过过滤、超滤、多步层析纯化后制得。
[0004]重组人促红素由165个氨基酸组成的单链多肽和肽链上连接的糖基组成。分子量约为30，400道尔顿，其中肽链骨架约为18KD，肽链上有两个二硫键位于Cys7和Cysl61，Cys29和Cys33之间；三个N-和一个O-糖基化位点位于Asn24、Asn38、Asn83和Serl26。肽链通过四个糖基化位点与四个富含唾液酸的糖链相连。基因重组CHO细胞的制备方法是，将EPOcDNA转染到CHO细胞后，经克隆筛选(ELISA法)，初选表达阳性的克隆细胞系，再MTX加压筛选，获得B4、C3、F1(1、G7、4个高表达EPO细胞系。对上述4系细胞系进行进一步检测，证实Fltl细胞系无支原体污染。且表达量为四株中最高。对其进行亚克隆纯化，获得分泌量最高的Fich6亚克隆株。对Fich6细胞株做进一步亚克隆鉴定，共获得15个亚克隆系，分别测定表达EPO水平，结果15个亚克隆系表达EPO水平相差不大，说明Fich6细胞株纯度可
O
[0005]完全或部分失去唾液酸的重组人促红素，进入体液循环后，被肝脏中的半乳糖受体结合并迅速降解，从而影响其在体内的半衰期；二、四分枝糖链形式的rHuEPO其体内外活性有很大的区别，二分枝糖链的EPO的体内活性只有标准EPO的1/7，而体外活性却有其3倍。
[0006]为了进一步提高重组人促红素的活性，已公开一些现有技术:
[0007]专利申请201110265828.6公开了一种重组人促红素-CTP融合蛋白的生产工艺方法，其特点是重组工程细胞株的培养方式采用微载体悬浮灌注培养技术或无血清悬浮流加培养技术。
[0008]专利201110192509.7公开了一种用于CHO细胞表达促红素的无血清培养基以及CHO细胞中高效表达促红素的培养方法。无血清培养基中含有添加剂D-葡萄糖和正丁酸钠，还含有添加剂D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一种或多种。
[0009]专利ZL201310116456.X公开了一种重组人促红素的工业化生产方法，包括扩增培养和分离纯化，扩增培养采用无血清培养基，无血清培养基为在DMEM中添加有2-4%Ultroser G和250_300mg/L正丁酸钠以及2_3mg/L核黄素形成的培养基。该发明在细胞培养时全程采用无血清培养。上述两种方法均采用罐培养技术，所需仪器复杂，投入成本高。
[0010]为了克服现有技术的缺陷，进一步提高重组人促红素的产量和活性，特提出本发明。
【发明内容】
[0011]本发明的首要发明目的在于提出了一种重组人促红素高表达高活性的无血清培养基。
[0012]本发明的第二发明目的在于提出了该重组人促红素的无血清培养基的应用。
[0013]本发明的第三发明目的在于提出了一种重组人促红素的制备方法。
[0014]为了实现本发明的目的，采用的技术方案为:
[0015]一种重组人促红素的无血清培养基，培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂中含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3和大豆蛋白水解液。
[0016]本发明的第一优选技术方案为:所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为2.0~3.0g/L, NaHCO3的浓度为0.08~0.16g/L，大豆蛋白水解液的添加量为100~400ml/L ;优选为:4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为2.3~2.7g/L,NaHCO3的浓度为0.10~0.13g/L，大豆蛋白水解液的添加量为200~400ml/L。
[0017]本发明的第二优选技术方案为:添加剂中还含有正丁酸钠、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺。
[0018]本发明的第三优选技术方案为:正丁酸钠的浓度为0.03g/L~0.2g/L，优选
0.08~0.12g/L ；D-葡萄糖的浓度为1.0g/L~5.0g/L,优选1.5~3.5g/L ；D-甘露糖的浓度为0.4g/L~2.5g/L，优选0.5~1.5g/L ；D-半乳糖的浓度为0.4g/L~2.5g/L，优选
0.5~1.5g/L ；N-乙酰葡萄糖胺的浓度为0.4g/L~2.5g/L,优选0.5~1.5g/L。
[0019]本发明的第四优选技术方案为:基础培养基选自CHO SFM培养基，浓度为10~20g/L，优选 13 ~15g/L。
[0020]本发明的第五优选技术方案为:所述培养基的pH为6.9~7.3,优选6.9~7.2,渗透压摩尔浓度为300~380m0smol.kg'优选320~360m0smol.kg4。
[0021]本发明的第六优选技术方案为:大豆蛋白水解液的制备方法为:取大豆蛋白粉10gJn 80~85°C热水800mL，保持恒温20~30分钟，调节PH为5.0~7.0，加入2%的木瓜蛋白酶100ml，升温至90~93°C保持20~30分钟，用5 μ m的滤器过滤，加水至含氮量为 1.0wt % ο
[0022]本发明还涉及该无血清培养基在表达促红细胞素中的应用。
[0023]本发明还涉及一种重组人促红素的制备方法，将CHO细胞经过复苏、传代、采用含血清的培养基增殖培养后，除去有血清培养液，接种于装有本发明的培养基的转瓶中进行无血清培养，收获上清液经纯化即得。培养的流程图如图2所示。
[0024]下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。
[0025]本发明通过研究得到了一种重组人促红素的无血清培养基，培养基包括基础培养基和添加剂，添加剂中含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3、大豆蛋白水解液、正丁酸钠、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。其中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为2.0~3.0g/L、NaHCO3的浓度为0.08~0.16g/L、大豆蛋白水解液的添加量为100~400ml/L、正丁酸钠的浓度为0.03g/L~0.2g/L、D-葡萄糖的浓度为1.0g/L~5.0g/L、D-甘露糖的浓度为0.4g/L~2.5g/L、D-半乳糖的浓度为0.4g/L~2.5g/L、N-乙酰葡萄糖胺的浓度为
0.4g/L~2.5g/L。优选为:4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为2.3~2.7g/L, NaHCO3的浓度为
0.10~0.13g/L，大豆蛋白水解液的添加量为200~400ml/L、正丁酸钠的浓度为0.08~
0.12g/L、D-葡萄糖的浓度为1.5~3.5g/L、D-甘露糖的浓度为0.5~1.5g/L、D-半乳糖的浓度为0.5~1.5g/L、N-乙酰葡萄糖胺的浓度为0.5~1.5g/L。其中，基本培养基采用GIBCO公司生产的302CH0 SFM培养基。
[0026]本发明中大豆蛋白水解液的制备方法为:所述大豆蛋白水解液的制备方法为:取大?蛋白粉(蛋白质> 50%水份< 7%脂肪< 1%灰分< 4%纤维总量< 4% ) 10g,加80~85°C热水800mL，保持恒温20~30分钟，调节PH为5.0~7.0,加入2wt%的木瓜蛋白酶100ml，升温至90~93°C保持20~30分钟，用5 μ m的滤器过滤，加水至含氮量为
1.0wt 优选为取大豆蛋白粉100g，加85°C热水800mL，保持恒温30分钟，调节PH为5.0~7.0，加入2wt%木瓜蛋白酶100ml，升温至90°C保持30分钟。
[0027] 本发明的重组人促红素的无血清培养基的制备方法为:称取CHO SFM培养基，按比例加入碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、正丁酸钠、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺，加一定量水溶解后，加一定量的上述方法制备的大豆蛋白水解液并定容。将配制的培养基经过0.22 μ m滤膜过滤，即得。培养基的渗透压摩尔浓度为300~38OmOsmoI.kg \ pH 为 6.9 ~7.3。
[0028]本发明在无血清培养基中加入一定比例的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、D_葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和大豆蛋白水解物，可控制CHO细胞的表达水平和表达产物的糖基化，同时有利于延长细胞在无血清状态下存活的时间，从而可以保持细胞一次培养的不脱落时间由96小时延长至168小时。加入葡萄糖的作用是提供细胞代谢的能量和糖基生物合成的原料；加入甘露醇、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺的作用是提供细胞糖基和唾液酸合成的原料；加入大豆蛋白水解物的作用是提供细胞代谢和生物合成所必须的氨基酸、多糖和生胞生长及生物合成的各种细胞因子。加入4-羟乙基哌嗪乙磺酸，提高碳酸氢钠的缓冲能力，保持细胞生长的适宜PH值范围。
[0029]重组人促红素为不同异构体的混合物，通过等电聚焦和免疫印迹的方法可以分离出CHO细胞无血清上清培养液中的各种异构体。研究表明，不同异构体的等电点越低，即表明糖基化程和唾液酸含量越高，相应的异构体的体内活性越高。EPO的糖基化程度决定了EPO在体内的生物学活性和疗效，不同的宿主细胞培养、纯化过程和培养基成分，其糖基形式存在着明显差异，它对糖蛋白的理化性质和生物学功能等方面起着较大影响，体现在蛋白的稳定性、溶解性、免疫原性、体内外生物活性、药物动力学和生物分配等。EPO糖基化的形成主要在无血清培养中的表达阶段，控制无血清培养条件，可改善和提高CHO表达分泌EPO的产量和质量。通过等电聚焦和免疫印迹的方法可以从无血清上清培养液中分离出11种异构体，而可利用的相对活性较高的异构体为8个(即等电点在4.3以下的异构体)，其中酸性条带的异构体所占的比例越高，体内活性越高。体内活性低的异构体在后续的纯化阶段会被去除。通过调整CHO细胞在无血清阶段的培养条件可改善CHO细胞产出的EPO的产量和质量，增加有效的EPO的产量，提高纯化收率。
[0030]在重组人促红素的无血清培养阶段，为细胞的维持培养，不含促进细胞增殖的血清成分。细胞在维持培养阶段需要大量的能量及有效代谢产物(重组人促红素)所需的各种糖、氨基酸及调控因子。通过调整培养液的成份，可延长细胞在维持培养阶段的存活率和存活时间。
[0031]蛋白水解物是蛋白质经过酶、酸或者碱水解之后得到的产品，其主要成分为肽类。此外，还包括含少量氨基酸、糖、脂类、矿物质和维生素等物质。蛋白水解物可优化动物细胞培养基的组成，并且其中所含部分肽段可作为外部分子信号对细胞代谢、生物合成、生长、凋亡及产物表达等生命活动产生特殊的调控作用，广泛应用于动物细胞培养领域。在无血清培养基中加入某些蛋白水解物，可从根本上改善细胞培养系统的整体性能，进而影响细胞代谢、增殖、生物合成及蛋白表达。
[0032]本发明的有益效果为:
[0033]1.本发明提高了 CHO细胞在无血清培养阶段表达量，表达量可由原来的10000IU/ml提高至18000IU/ml以上。
[0034]2.本发明提高了 CHO细胞在无血清培养阶段表达高活性EPO的比例，使用高活性的EPO比例由30%提高至50%，使纯化的收率提高至少60%。
[0035]3.本发明延长了细胞在无血清状态下存活的时间，从而可以保持细胞总的不脱落时间由8天延长至21~22天。细胞培养液收获次数由2次延长至3次，提高了单位CHO细胞的EPO表达量。
[0036]4.本发明采用转瓶细胞培养工艺，无需特殊设备，投入成本低，适合工业化生产。并且采用本发明的转瓶培养技术，收获得到的细胞培养液中EPO的浓度高，获得单位EPO所需的培养液用量低，可为企业节约成本，提高收益。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为本发明的上清收获液等电聚焦/免疫印迹图谱。
[0038]图2为本发明的细胞培养流程。
[0039]图3为一个培养周期中表达量与培养时间关系图。
[0040]本发明的【具体实施方式】仅限于进一步解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。
【具体实施方式】
[0041]实施例1~7:
[0042]无血清培养基的制备方法为:按表1所示称取CHO SFM培养基，按比例加入碳酸氢钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、正丁酸钠、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰葡萄糖胺，加一定量水溶解后，加一定量的上述方法制备的大豆蛋白水解液并定容至1L。将配制的培养基经过0.22 μ m滤膜过滤，即得,培养基的渗透压摩尔浓度为320~360m0smol.kg-1, pH为 6.9 ~7.2。
[0043]其中:原型培养基采用GIBCO公司生产的302CH0 SFM培养基。大豆蛋白水解液的制备方法为:取大?蛋白粉10g(蛋白质> 50%水份< 7%脂肪< I %灰分< 4%纤维总量≤4% )，加85°C热水800mL，保持恒温30分钟，调节PH为5.0~7.0，加入木瓜蛋白酶(2% ) 100ml，升温至90°C保持30分钟，用0.5um的滤膜过滤，加水至含氮量为1.0%。
[0044]表1
【权利要求】
1.一种重组人促红素的无血清培养基，其特征在于，所述的培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂中含有4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaHCO3和大豆蛋白水解液。
2.根据权利要求1所述的重组人促红素的无血清培养基，其特征在于，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为2.0~3.0g/L, NaHCO3的浓度为0.08~0.16g/L，大豆蛋白水解液的添加量为100~400ml/L ;优选为:4_羟乙基哌嗪乙磺酸的浓度为2.3~2.7g/L, NaHCO3的浓度为0.10~0.13g/L，大豆蛋白水解液的添加量为200~400ml/L。
3.根据权利要求1所述的重组人促红素的无血清培养基，其特征在于，所述添加剂中还含有正丁酸钠、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺。
4.根据权利要求1所述的重组人促红素的无血清培养基，其特征在于，所述的正丁酸钠的浓度为0.03g/L~0.2g/L,优选0.08~0.12g/L ;D_葡萄糖的浓度为1.0g/L~5.0g/L，优选1.5~3.5g/L ；D-甘露糖的浓度为0.4g/L~2.5g/L，优选0.5~1.5g/L ；D-半乳糖的浓度为0.4g/L~2.5g/L，优选0.5~1.5g/L ；N-乙酰葡萄糖胺的浓度为0.4g/L~2.5g/L，优选 0.5 ~1.5g/L。
5.根据权利要求1所述的重组人促红素的无血清培养基，其特征在于，基础培养基选自CHOSFM培养基，浓度为10~20g/L，优选13~15g/L。
6.根据权利要求1所述的重组人促红素的无血清培养基，其特征在于，所述培养基的PH为6.9~7.3，优选为6.9~7.2，渗透压摩尔浓度为300~380m0smol.kg'优选为320 ~360m0smol.kg 1O
7.根据权利要求1所述的重组人促红素的无血清培养基，其特征在于，所述大豆蛋白水解液的制备方法为:取大豆蛋白粉10gJp 80~85°C热水800mL，保持恒温20~30分钟，调节PH为5.0~7.0，加入2wt%的木瓜蛋白酶100ml，升温至90~93°C保持20~30分钟,用5μπι的滤器过滤，加水至含氮量为1.0wt%。
8.一种如权利要求1~7任一权利要求所述的重组人促红素的无血清培养基在表达重组人促红素中的应用。
9.一种重组人促红素的制备方法，其特征在于，将CHO细胞经过复苏、预培养、采用含血清的培养基增殖培养后，除去有血清培养液，接种于权利要求1~7任一权利要求所述培养基的培养瓶进行无血清 培养，收获上清液经纯化即得。
【文档编号】C12N5/071GK104130971SQ201410393381
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】闫亚梅, 韩飞宇 申请人:山西威奇达光明制药有限公司