一种适于中国人表皮黑素细胞体外培养的chmm1培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种适于中国人表皮黑素细胞体外培养的CHMM1培养基，所述CHMM1培养基以适用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，所述基质中添加有下列组分：(1)体积浓度5％～20％的血清、(2)1～100ng/mL?bFGF和1～100ng/mL?GM-CSF(3)1～100μg/mL的异甲基黄嘌呤(IBMX)和3～3000ng/mlα-MSH；本发明提供了适于中国人表皮黑素细胞的体外培养的培养基，可用于培养增殖能力和黑素合成能力增强的表皮黑素细胞，以更好的应用于移植治疗色素减退或无色素性皮肤病患者。
【专利说明】-种适于中国人表皮黑素细胞体外培养的CHMM1培养基 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种适于中国人表皮黑素细胞体外培养的CHMM1培养基。 (二）
【背景技术】
[0002] 人类皮肤颜色的变化是黑素体的数目、大小、类型和分布有着直接的关系。皮肤颜 色主要由皮肤制造的色素和皮肤表层所含天然色素的组合所决定。皮肤上皮层表面的表皮 中含有能制造皮肤色素（即黑色素）的表皮黑素细胞。色素减退或无色素性皮肤病患者的 皮肤黑素细胞缺失、被破坏或无功能，从而在身体各部位出现白斑。
[0003] 黑素是一种蛋白衍生物，由表皮的黑素细胞产生。目前认为参与皮肤黑素的形成 和代谢的尚有表皮的角质形成细胞，黑素细胞和角质形成细胞合称为表皮黑素单位，它是 由一个黑素细胞与其邻近的约36个角质形成细胞所组成的。黑素细胞通过树突分泌黑素 进入邻近的角质形成细胞，随着角质形成细胞的代谢（表皮细胞向上移行），黑素也不断向 上转运，逐渐降解，最终脱落于表皮。黑素代谢中，这样的一个动态的过程，全是由无数具有 此功能的结构单位--表皮黑素单位来完成。
[0004] 黑素生成的过程中，各种因素都可影响其生成的速度及种类。其中体内的各种细 胞因子、微量元素、酶活性、神经激素水平及黑素细胞周围的物理化学环境均可影响黑素的 生物合成。
[0005] 酪氨酸酶是黑素代谢中目前唯一已明确的酶，是一种含铜需氧酶，其活性与铜离 子含量成正比例。酪氨酸酶家族包括TYR、TRP-1和TRP-2,它们编码的蛋白质一级结构相 似，却在黑素合成的调控上起着不同的作用。此酶活性过程与体内生化过程和物理环境有 密切联系，因而影响黑素合成的机制是相当复杂的，除遗传（酪氨酸酶先天性缺陷）因素 夕卜，其他较明确和重要的有以下几方面：
[0006] 1)微量元素微量元素在黑素代谢中主要起触酶作用，其中以铜离子和锌离子较为 重要，若缺乏均可使动物毛变白。铜离子参与黑素合成过程时，需借泛酸将其与酪氨酸酶结 合，以便黑素形成过程能正常进行。某些重金属（如砷、铋、银、金等）引起皮肤色素沉着， 可能是通过与巯基结合，使酪氨酸酶的活性增强所致。
[0007] 2)氨基酸及维生素动物实验中表明，酪氨酸、色氨酸及赖氨酸等在黑素形成中是 必需的。泛酸、叶酸、生物素、对氨苯甲酸等也可能参与黑素的形成。维生素 C系还原剂在 黑素代谢中可使深色氧化型醌式产物还原，从而使色素转淡。维生素 A缺乏引起的毛囊角 化过度而是巯基减少，引起色素沉着。烟酸缺乏可对光敏感而出现色素沉着。
[0008] 3)内分泌因素如垂体中叶分泌的促黑素激素（MSH)可能是通过提高血中铜离子 水平而使酪氨酸酶的活性增高而促进黑素的形成；肾上腺皮质激素则通过抑制垂体分泌 MSH而减少黑素的形成；性激素可使皮肤色素增加，特别是雌激素能刺激黑素细胞分泌黑 素体，而孕激素促使期转运扩散，连着的联合作用往往更明显；甲状腺可作为氧化剂而使黑 素形成增多。
[0009] 4)细胞因子角质形成细胞表面所表达的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)是人类 黑素细胞的天然丝裂原，可直接作用与黑素细胞，促进期增殖并合成黑素。
[0010] 影响黑素合成的主要分子信号通路一cAMP/PKA通路：激活剂与膜受体结合之后， 腺苷酸环化酶通过细胞内三聚体G蛋白被激活，并且AMP转化为cAMP，激活cAMP依赖蛋白 激酶（PKA)。PKA的活性可被cAMP依赖蛋白酶抑制剂（PKI)所抑制。在活体或培养的色素 细胞，黑素生成可被α-MSH或cAMP提高因子，如二丁酰cAMP、forskolin (毛喉素，一种腺 苷酸环化酶直接激活剂）和IBMX (-种磷酸二酯酶抑制剂）所刺激。它是通过增强酪氨酸 酶蛋白和信使数量，刺激酪氨酸酶活性。并且黑素细胞的特殊转录因子（MITF)，结合一些调 节因子共同调节酪氨酸酶启动因子的转录活性，从而cAMP提高因子调节黑素的生成。
[0011] 黑色素不但具有保护作用，在皮肤美学上也至关重要。某些疾病可引起局部黑素 细胞破坏、缺失或细胞功能受抑制，影响皮肤色素制造系统，从而导致皮肤色素减退或者色 素缺失。此种异常会造成患者心理学和社会学的严重损害。
[0012] 白癜风是一种特殊的皮肤色素性疾病，以出现白斑和表皮黑素细胞缺失为主要特 征。当前治疗包括光敏剂（如补骨脂素）联合UVA照射、窄波UVB照射或者局部使用（肾 上腺）皮质类固醇，但疗效低，并伴随一定副作用（Shaffali and Gawkrodger，2000，Clin Exp Dermatol25:575)〇
[0013] 外科移植技术已经应用于白癜风治疗，如负压吸疱移植、刃厚皮片移植或微小 皮片移植，甚至是移植人造表皮（Koga et al.，1988，Arch Dermatoll24:1656;Gupta et al.,1999, Dermatol Surg25:955 ；Falabella, 1984, J Dermatol Surg Oncol10:136； Suvanprakorn et al., 1985,J Am Acad Derm 13:968 ；Sarkar et al.,2001, J Dermatol28:540 ;Pai et al·, 2002, J.Eur Acad Dermatol Venereoll6:604)。这些治疗在 局限性和小面积病损的患者中有效，但对白斑面积大或者白斑数量多的患者，获得足够的 移植皮片具有一定困难（Van Geel, N. et al·，2001，Dermatology202:162)。人造表皮可以 治疗大面积白癜风，但是黑素细胞活性难以保证，复色不佳，目前仅适用于个别白癜风适应 症。
[0014] 目前可通过细胞培养大量扩增自体黑素细胞用于移植。这种方法需要从病人健康 皮肤取得黑素细胞，在体外将其培养在合适环境中（可促进细胞增殖和黑素制造）使之大 量扩增，再在合适条件下将细胞移植至病人病变处皮肤，使之恢复正常颜色。
[0015] Lerner等（1987, J Invest Derm89:219)介绍了黑素细胞移植治疗斑驳病（一种 遗传疾病，以先天性缺乏黑色素细胞导致皮肤白斑和白发为特点）。通过皮切活检术获得一 小块皮肤，用含有 TPA (12-〇-tetradecanoyl-phorbol-13_acetate)，异甲基黄噪呤（3_iso butyl-l_methylxanthine，IBMX)，霍乱毒素及新生牛血清的培养基培养表皮黑素细胞。虽 然细胞成功地移植到了色素减退区域，但由于培养基中含有TPA，使这种培养基不适合用于 人类移植。目前国内外在临床使用的培养基主要有M2、TIC、Hul6、MK、MBM、MCDB153等，上 述培养基虽然以bFGF替代了有潜在致癌性的TPA，但由于bFGF的浓度低，且缺少cAMP的激 动剂，因此培养的黑素细胞活性差（培养的细胞只有50%可以用来移植），从而导致临床疗 效低；同时培养基中添加了有毒的霍乱毒素（CT)，临床使用缺乏安全性。
[0016] Olsson等（1992，Lancet340:981)报告的表皮黑色素细胞培养基配方，包含PC-1， bFGF，丁酰环腺苷酸（dbcAMP)，青霉素-链霉素。该培养基用于在自体黑素细胞移植中扩增 分离到的表皮黑色素细胞。此培养基不包含促进黑色素细胞生长和分化必需的血清。此外， bFGF的浓度（5ng/ml)太低，不能刺激表皮黑色素细胞作足够的生长。而dbcAMP不是一种 天然物质，作用时间也很短。另外，对所培养细胞的数量和黑素含量均无量化指标报道，因 此，很难评价这一培养基的效率。值得注意的是，Olsson等后来己使用非培养的表皮黑色 素细胞移植治疗白癒风（Olsson and Juhlin，1998，Br J Dermatoll38:644)。Czajkowski 等（2006，Med Sci Monit，CR63-69.)运用无血清培养基培养黑素细胞，成功建立了原代培 养，但有一半的患者无法获得移植所需的足够的细胞株。无 TPA/CT和胎牛血清（FCS)的培 养基虽然能获得用于临床移植的安全细胞株，但同时减少了黑素细胞的增殖率，这大大延 长了培养时间，有时甚至导致培养失败。
[0017] 另外的培养基，如HU16(FIC培养基）已被我们用于培养表皮黑素细胞。HU16培 养基包括F12培养基（一种商品化的基础培养基），补充有效浓度的bFGF、IBMX，霍乱毒 素和胎牛血清。该培养基已经在台湾成功应用于120例白癜风患者黑素细胞移植治疗 中的黑素细胞培养（〇^116七31.，1999,511〇￥(^^11]^(1了1:85 ;〇16116七31.，2000，工 Dermatol27:434 ；Chen et al. ；2001)〇
[0018] 虽然培养表皮黑素细胞的培养基很多，但都不是最佳的。迄今为止，国际上所有黑 素细胞培养基的设计均以白种人的黑素细胞作为研究与测试对象，任何改进也是为改善白 种人黑素细胞的生长及黑素制造为目的。因此目前国内外缺少一种安全、高效的黑素细胞 培养基，尤其是适合中国人的黑素细胞培养基。
[0019] 因此，一些患者因为细胞生长不佳，必须长时间等待；另一小部分患者细胞生长 差，达不到移植需要（Chen et al. 1999，Show Chwan Med J19991:85 ;Chen et al.，2000，J. Dermatol27:434)。课题组从2008-2011年在Hul6培养基的基础改良了培养基的配方，研 制了 HX1培养基（申请了发明专利：200910157043. X)。我们提高了 bFGF的浓度，去除了有 毒成分CT，增加了 FGF20和cAMP的激动剂（IBMX和L-肾上腺素）。与Hul6和M2培养基 相比，HX1能更好的促进黑素细胞增殖和黑素合成。但由于Hul6完全是从西方人黑素细胞 营养需要设计的，并且Hul6与HX1是应用西方人的黑素细胞株研发而成。近年研究，发现 黄种人黑素细胞不仅黑素含量远高于白种人，而且黑素种类与白种人有本质上的区别。黄 种人黑素细胞的黑素以正黑色素为主，棕黑色素相对很少；而白种人黑素细胞的黑素中正 黑色素很少，棕黑色素相对很多。
[0020] 因此，建立一种在体外培养的适合中国黄种人表皮黑素细胞的新培养基是必要 的，该培养基应是由非毒性和/或天然和/或生理学谐调的物质组成，能促进表皮黑素细胞 增殖，并能表达正常表皮黑素细胞特性，（正黑素含量与合成）。最近发现有些生长因子能 刺激不同种类细胞的生长。其中，角质形成细胞表面所表达的bFGF是人类黑素细胞的天然 丝裂原，可直接作用于黑素细胞，促进期增殖并合成黑素。bFGF刺激丝裂原激活的蛋白激酶 (MAPK)和转录因子Ca+/cAMP应答元件结合蛋白（CREB)，通过MAPK级联反应使黑素细胞由 G1期进入S期，促进黑素细胞增殖。bFGF不仅是黑素细胞的促分裂剂，还是酪氨酸酶受体 和蛋白激酶C(PKC)的激活剂，通过形成bFGF-激活酪氨酸激酶一激活酪氨酸酶一黑素生 成这一级联反应，刺激黑素细胞色素的生成及树突生长。
[0021] MSH是一种神经内分泌激素，在哺乳动物由脑垂体中间叶、前叶及包括巨噬细胞在 内的其它多种外周细胞产生。MSH在鱼类、两栖类动物有使黑色素聚集的效应，在哺乳类动 物使皮肤、毛发颜色变深。其中a -MSH是一种13肽，序列为丝-酪-丝-蛋-谷-谷-苯 丙-精-色-甘-赖-脑 -纟颜），其C端的3个氨基酸（11?13 :赖-脑-纟颜）被认为是 产生α-MSH效应的氨基酸信号序列。MSH可能是通过提高血中铜离子水平而使酪氨酸酶 的活性增高而促进黑素的形成；肾上腺皮质激素则通过抑制垂体分泌MSH而减少黑素的形 成；性激素可使皮肤色素增加，特别是雌激素能刺激黑素细胞分泌黑素体，而孕激素促使期 转运扩散，连着的联合作用往往更明显。GM-CSF由角质形成细胞分泌，与特定受体GM-CSFR 结合，通过激活信号转导蛋白及转录活化剂（STAT-USTAT-3和STAT-5)或者MAPK，诱导黑 素细胞增殖必需蛋白的增量调节，参与调节黑素细胞的增殖与分化。Hirobe等将小鼠黑素 细胞置于加入GM-CSF的培养基中培养，GM-CSF诱导了黑素细胞的增殖和分化。 (三）
【发明内容】
[0022] 本发明目的是针对现有技术中缺乏适合中国黄种人表皮黑素细胞体外培养的培 养基，提供一种用于培养适合中国人表皮黑素细胞体外培养的培养基新配方。
[0023] 本发明采用的技术方案是：
[0024] -种适于中国人表皮黑素细胞体外培养的CHMM1培养基，所述CHMM1培养基以适 用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，所述基质中添加有下列组分：（1)体积 浓度5%?20%的血清、（2) 1?100ng/mL bFGF(成纤维细胞生长因子）和1?100ng/mL GM-CSF (人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）；（3) 1?100 μ g/mL的异甲基黄嘌呤（IBMX) 和 3 ?3000ng/mla -MSH。
[0025] 本发明中的CHMM1培养基包括基础培养基，血清、生长因子和cAMP激活剂为补充 成份。基础培养基可以是任何一种本领域常规的适用于细胞培养的稳定的培养基，满足细 胞生长的最低需求。这样的基础培养基包括但不仅限于基础氨基酸/盐混合液液如Ham's F12、RPMI或DMEM。基础培养基中其他添加物可包括葡萄糖、谷氨酰胺、维生素以及微量元 素等所属领域技术人员所熟知的一些添加剂。任何一种动物血清都可使用，包括但不仅限 于胎牛血清、牛血清或人血清。
[0026] 本发明所述基础培养基优选为下列之一：Ham's F12培养基、RPMI培养基或DMEM 培养基。
[0027] 本发明是在明确了 bFGF是人类黑素细胞的天然丝裂原，可直接作用于黑素细胞， 促进其增殖并合成黑素的基础上，发现GM-CSF可以进一步协同刺激表皮黑素细胞生长。同 时添加 GM-CSF和bFGF的培养基可增强表皮黑素细胞的增殖能力，提示GM-CSF在与bFGF 联合应用是对细胞具有额外的生长刺激作用。GM-CSF通过激活信号转导蛋白及转录活化剂 (STAT-1、STAT-3和STAT-5)或者MAPK，诱导黑素细胞增殖必需蛋白的增量调节，参与调节 黑素细胞的增殖与分化。因此，培养基中添加 GM-CSF可进一步刺激表皮黑素细胞在体外的 生长，从而缩短病人等待移植的时间。
[0028] 本发明中的CHMM1培养基还含有一种或多种无毒性，可通过提高细胞内cAMP水 平，促进表皮黑素细胞生长及黑素合成的物质。IBMX和α-MSH在cAMP缺乏的培养基中可 刺激表皮黑素细胞的生长和黑素合成。
[0029] 本发明提供的含有天然或者生理学成分的培养基为表皮黑素细胞的孵育提供了 更符合生理状态的微环境。除了为移植提供细胞来源，发明中的培养体系还为各种生物学 物质（如药品、中药和化妆品等）对表皮黑素细胞生长、黑素合成、迁移能力和其他功能影 响的检测提供了体外模型。
[0030] 优选的，所述基质中添加有下列组分：
[0031] (1)体积浓度10 %?15 %的血清；
[0032] (2) 30?100ng/mL的bFGF和30?100ng/mL的GM-CSF ;优选为两者的混合，在含 有bFGF的培养基中加入GM-CSF对体外培养的黑素细胞生长具有额外的刺激作用。
[0033] (3) 10 ?100 μ g/mL 的异甲基黄嘌呤（IBMX)和 30 ?300ng/ml a -MSH。
[0034] 更为优选的，所述基质中添加有下列组分：
[0035] (1)体积浓度10 %的血清；
[0036] (2) 30ng/mL 的 bFGF 和 30ng/mL 的 GM-CSF ;
[0037] (3) 30 μ g/mL 的异甲基黄嘌呤和 100ng/mL 的 a -MSH。
[0038] 所述培养基中还添加有细胞生长及存活所需的0. 1?5mM谷氨酰胺和防止细菌污 染的终浓度为l〇〇U/ml青霉素和100μ g/ml链霉素。
[0039] 优选的，所述CHMM1培养基终浓度组成如下：
[0040] 胎牛血清 体积浓度10%
[0041] bFGF 30 ng/mL GM-CSF 30 ng/mL 异甲基黄噪呤 30 pg/'niL α-MSH lOOng/mL 谷氨酰胺 2 rnM 链霉素 10(^g/ml 身褐素 lOOU/ml
[0042] 溶剂为Ham's FI2培养基。
[0043] 本发明中的培养基与以往报道过的培养基不同，它以筛选适合中国人黑素细胞 体外培养的培养基为目标，采用严格筛查的优质黑素细胞源为实验对象，研究在既往的工 作基础上更适合黄种人黑素细胞产生正黑色素以及快速增殖的培养基培养。我们优选的 GM-CSF和a -MSH都是无毒性的生理性物质，在临床其他方面已有应用，但目前尚未以复合 因子的形式作用于黑素细胞培养。本发明的基础是分离和培养在本发明培养基中的表皮黑 素细胞具有更强的增殖和黑素合成能力。
[0044] 采用本发明培养基培养的表皮黑素细胞可应用于需要皮肤色素形成的个体。培养 的表皮黑素细胞可以直接移植至受体，形成具有正常颜色的新的皮肤组织。
[0045] 以足量表皮黑素细胞移植于受体，可达到预期治疗目的。具体地说，足量是指足以 使皮肤色素和功能恢复正常的细胞数量，从而缓解因基因异常或者组织受损引起的病症。 可通过肉眼观察，评估细胞覆盖和皮肤色素形成以判断移植受体的情况。达到本发明目的 所需的细胞数量取决于皮肤受损程度和范围。判断细胞数量是否足够，是本领域技术人员 应具有的能力。
[0046] 供移植用的培养的表皮黑素细胞可用各种分离剂（例如胰酶-EDTA)从培养瓶脱 下，将细胞悬液离心后用不含血清的F12培养基重悬。然后移植至己除去表皮层的皮肤表 面。
[0047] 可在接受移植的区域加用生长因子或激素（移植前或移植后），从而形成一个合 适的微环境，可支持细胞生长和（或）细胞分化和（或）细胞迁移和（或）黑素形成。 [0048] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了适于中国人表皮黑素细胞的体外培 养的培养基，可用于培养增殖能力和黑素合成能力增强的表皮黑素细胞，以更好的应用于 移植治疗色素减退或无色素性皮肤病患者。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1为GM-CSF对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0050] 图2为SCF对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0051] 图3为bFGF对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0052] 图4为HGF对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0053] 图5为细胞因子组合对黑素细胞生长和黑素形成的作用，B为bFGF，H为HGF，C为 CT，S 为 SCF，BH 为 bFGF+HGF，BS 为 bFGF+SCF，HC 为 HGF+CT，HS 为 HGF+SCF，CS 为 CT+SCF， C0N为对照。
[0054] 图6为IBMX对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0055] 图7为间羟异丙肾上腺素对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0056] 图8为a -MSH对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0057] 图9为CT对黑素细胞生长和黑素形成的作用。
[0058] 图10为cAMP激动因子组合对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用，I为 IBMX，C为CT，L为L-肾上腺素，Μ为a -MSH，1C为IBMX+CT，IL为IBMX+L-肾上腺素，頂 为 ΙΒΜΧ+ a -MSH，CL 为 CT+L-肾上腺素 ，CM 为 CT+ a -MSH，LM 为 L-肾上腺素 + a -MSH，C0N 为对照。
[0059] 图11为HX1与CHMM1培养基分别培养中国人表皮黑素细胞的显微图，A为HX1培 养基，B为CHMM1培养基。 (五）
【具体实施方式】
[0060] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0061] 实施例1 :
[0062] 1. 1材料和方法
[0063] 1. 1. 1培养基的配制
[0064] 谷胺酰胺加入Ham's F12 (GIBCO, Carlsbad, Calif.)至终浓度为2mM ;青霉素-链 霉素终浓度为l〇〇U/ml和100μ g/ml ;胎牛血清（FBS，GIBCO, Carlsbad，Calif.)加至终浓 度10% (体积/体积），得到含有FBS和青霉素 -链霉素的培养基A，4°C保存，每两周新鲜 配制一次。
[0065] bFGF (PeproTech, Rocky Hill, N. J.)在 Ham's F12 培养基 (GIBCO，Carlsbad，Calif.)中溶解，浓度为2500ng/ml，分装后-70°C保存。每周一次，将 bFGF存储液加入培养基A中至bFGF终浓度30ng/ml。
[0066] GM-CSF(P印roTech, Rocky Hill, N. J.)在 Ham' s F12 培养基中溶解，浓度为 3000ng/ml，分装后-70°C保存。每周一次，将GM-CSF存储液加入培养基A中至GM-CSF终浓 度 30ng/ml。
[0067] SCF(PeproTech, Rocky Hill, Ν· J.)(干细胞生长因子）和 HGF(PeproTech, Rocky Hill，N. J.)(肝细胞生长因子）在Ham' s F12培养基中溶解，浓度为3000ng/ml，分装 后-70°C保存。每周一次，将SCF存储液加入培养基A中至SCF终浓度30ng/ml。
[0068] IBMX粉剂（Sigma, St. Louis, Mo.)用细胞培养用水溶解至浓度1000 μ g/ml，室温 保存。每周一次，将IBMX存储液加入培养基A中至IBMX终浓度20 μ g/ml。
[0069] a -MSH(Sigma, St. Louis, Μο·)用 F12 培养基溶解至 5mg/ml 后 _70°C保存。每周 一次加入培养基A中至a -MSH终浓度为50ng/ml。
[0070] L-肾上腺素（L-E pinephrine, Sigma, St. Louis, Μο·)用 PBS (pH 值为 7. 4)溶解 至 lmM,加入抗坏血酸钠（10μ g/ml) (Sigma, St. Louis,Mo.)后 _70°C保存。
[0071] CT(霍乱肠毒素）用Ham' s F12培养基溶解至5mg/ml后，-70°C保存。
[0072] 因子缺失培养基：
[0073] (1)无生长因子培养基；（培养基Α+20 μ g/ml IBMX)
[0074] (2)无 cAMP激动剂培养基；（培养基A+25ng/ml bFGF)
[0075] 将不同检测物质加入上述因子缺失培养基中，包括bFGF，SCF，GM-CSF，HGF， a -MSH，CT，IBMX和L-肾上腺素。不含测试物质的因子缺失培养基为对照。
[0076] 实施例中所用培养基组成：
[0077] (1)无生长因子培养基中添加 GM-CSF至终浓度为l、3、10、30、100、300ng/ml (图 1)，以无生长因子培养基为对照。
[0078] (2)无生长因子培养基中添加 SCF至终浓度为l、3、10、30、100、300ng/ml (图2)， 以无生长因子培养基为对照。
[0079] (3)无生长因子培养基中添加 bFGF至终浓度为1、3、10、30、100、3001^/1111(图3)， 以无生长因子培养基为对照。
[0080] (4)无生长因子培养基中添加邪？至终浓度为1、3、10、30、100、3001^/1111(图4)， 以无生长因子培养基为对照。
[0081] (5)无生长因子培养基中分别添加终浓度30ng/ml bFGF、30ng/ml HGF、30ng/ ml CT、30ng/ml SCF、30ng/ml bFGF+30ng/ml HGF、30ng/ml bFGF+30ng/ml CT、30ng/ ml bFGF+30ng/ml SCF、30ng/ml HGF+30ng/ml CT、30ng/ml HGF+30ng/ml SCF、30ng/ml CT+30ng/ml SCF (图5)，以无生长因子培养基为对照。
[0082] (6)无 cAMP激动剂培养基添加 IBMX至终浓度为0.3、l、3、10、30、100、300yg/ ml (图6)，以cAMP激动剂培养基为对照。
[0083] (7)无 cAMP激动剂培养基添加 L-肾上腺素至终浓度为0· 01、0· 03、0· 1、0· 3、1、3、 10 μ g/ml (图7)，以cAMP激动剂培养基为对照。
[0084] (8)无 cAMP激动剂培养基添加 α-MSH至终浓度为3、10、30、100、300、1000、 3000ng/ml (图8)，以cAMP激动剂培养基为对照。
[0085] (9)无 cAMP激动剂培养基添加 CT至终浓度为0. 3、l、3、10、30、100、300ng/ml (图 9)，以cAMP激动剂培养基为对照。
[0086] (10)无 cAMP激动剂培养基分别添加终浓度30 μ g/ml IBMX、10ng/ml CT、1 μ g/ ml L-肾上腺素、100ng/ml α -MSH、30 μ g/ml IBMX+10ng/ml CT、30 μ g/ml IBMX+1 μ g/ml 1^-肾上腺素、3(^8/1111181?+10〇1^/1111〇-]\〇1、10叩/1111(^+1以8/11111^-肾上腺素、10叩/ ml CT++100ng/ml a -MSH、10 μ g/ml L-肾上腺素 +100ng/ml a -MSH (图 10)，以 cAMP 激动 剂培养基为对照。
[0087] CHMM1培养基终浓度组成为：
[0088] 胎牛血清 体积浓度10% bFGF 30 ng/mL GM-CSF 30 ng/mL 异甲基黄卩票呤 30 pg/mL α-MSH 100ng/mL 谷氨酰胺 2 mM 链霉素 ΙΟΟμ^ιηΙ 青霉素 lOOU/ml
[0089] 溶剂为Ham's FI2培养基。
[0090] 1· 1· 2表皮黑素细胞的分离和培养
[0091] 含表皮的人类皮肤样本取自手术包皮组织。样本在0. 25 % (w/v)胰酶 (GIBCO, Carlsbad, Calif.)中 37 度孵育 15 分钟，0· 2 % (w/v)EDTA (Sigma, St. Louis, Μο·) 继续孵育10分钟。用镊子小心的将皮片上的表皮细胞分离下来，形成表皮细胞悬液。表皮 细胞离心后，种植在25cm 2的培养瓶中。培养瓶放置在37度的0)2培养箱中（95%空气，5% C02)。3天后，加入100 μ g/ml基因素（Sigma, St. Louis, Mo.)以去除角质形成细胞和成纤 维细胞。每3天换液一次。黑素细胞一般在2周后基本融合。细胞融合后，用胰酶-EDTA 溶液脱下，离心，稀释，传代培养。在移植时，黑素细胞用胰酶-EDTA溶液脱下，离心后用F12 培养基重悬。
[0092] 1. 1. 3培养的表皮黑素细胞的细胞生长检测
[0093] 测试物质对表皮黑素细胞生长的影响，通过细胞计数进行评估。表皮黑素细胞以 2X104/孔的密度接种于24孔板。24h后，用测试培养基替代原有培养基。每3天换液一 次。6天后，用胰酶-EDTA脱下细胞，以血清终止消化。细胞悬液离心后，用200μ 1的Ham's F12培养基重悬沉淀，用Pasteur移液管转移20 μ 1的细胞悬液至血球计数器，在光学显微 镜下观察计数。计数以缺失对照组细胞数为100%。计数4个1_3区域中的细胞。细胞 数量用公式 1 计算（Freshney, Culture of Animal Cells. Wiley-Liss, Inc.，New York, 2nd edition)。四次计数，取平均值。所有实验样本重复三次。公式l:c = 0. 2XnX104c=细 胞量（cells/ml) ;n =细胞计数。
[0094] 1. 1. 4培养的表皮黑素细胞的黑素含量检测
[0095] 黑素细胞用胰酶-EDTA脱下并用血球计数器进行计数。再将细胞悬液离心，沉淀 用1M的NaOH溶液溶解。通过分光光度计在475nm处检测溶液的光密度值，对照用合成的 黑色素（Sigma, St. Louis, Mo.)所做的标准曲线（M = 0D475*162. 5,0D475 是指 475nm 的吸 光值，Μ为黑素总含量，单位是μ g)算出黑素总含量。黑素相对含量以缺失对照组细胞数 为 100% (Hu et al·，1995, Invest. Ophthalmol Vis Sci36:931)。
[0096] 1. 1. 5培养基对细胞生长的短期作用
[0097] 在三个不同细胞株中进行CHMM1培养基对细胞生长的短期作用研究。每株黑素细 胞在首次传代时用CHMM1培养基接种于培养瓶，每3天换液一次。6天后，用胰酶-EDTA脱 下细胞，用血清终止消化。细胞数和黑素含量用上述方法检测。细胞的倍增时间（DOT)用 公式2加以计算。
[0098] 公式 2 :D = (tX log2)/(log Nt - log No)D = DOT. ;Nt =传代时细胞数；No =接 种的细胞数；t =培养天数。
[0099] 1. 1. 6培养基对细胞生长的长期作用
[0100] 在三个不同细胞株中进行CHMM1培养基对细胞生长的长期作用研究。每株黑素细 胞在首次传代时用CHMM1培养基接种于培养瓶，细胞连续培养，直至衰老。细胞的每一代的 扩增数（E)用公式4加以计算。
[0101] 公式4 :E = NT/No。NT =培养结束时细胞数；No =开始培养时细胞数。
[0102] 累积细胞扩增数（CE)=第一代EX第二代EX……最后一代E。
[0103] 细胞株在所用培养基中的累积倍增数（CPD)可以用公式5进行计算。
[0104] 公式5 :CPD = logCE/log2, CE为累积细胞扩增数。
[0105] (Hu et al. , 1992, Invest Ophthalmol Vis Sci33:2443 ；Hu, 2008, Photochem Photobiol. 84:645)。
[0106] 1.2 结果
[0107] 1. 2. 1GM-CSF对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0108] 细胞在无生长因子培养基中（对照）或含不同浓度GM-CSF(ng/ml)培养基中培养 6天。作细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果以实验组和对照组的百分比 表示（每组3重复，Mean土SD)。结果显示：表皮黑素细胞在无生长因子的培养基中生长缓 慢。加入1?l〇〇ng/mlGM-CSF可剂量依赖性的刺激细胞生长（图1)。在含有GM-CSF的培 养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组（P < 0. 05,10?100ng/ml)。但是GM-CSF 对黑素细胞的黑素含量没有明显影响（P > 〇. 05)。
[0109] 1. 2. 2SCF对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0110] 细胞在无生长因子培养基中（对照）或者含不同浓度SCF(ng/ml)培养基中培养 6天。作细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果显示：表皮黑素细胞在无生长 因子的培养基中生长缓慢。加入1?l〇〇ng/mlSCF可剂量依赖性的刺激细胞生长（图2)。 在含有SCF的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组（P < 0. 05,1?300ng/ml)。 但是SCF对黑素细胞的黑素含量没有明显影响（P > 0. 05)(图2)。
[0111] 1. 2. 3bFGF对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0112] 细胞在无生长因子培养基中（对照）或者含不同浓度bFGF(ng/ml)培养基中培养 6天。表皮黑素细胞在无生长因子的培养基中生长缓慢。加入1?100ng/ml bFGF可剂量 依赖性的刺激细胞生长（图3)。在含有bFGF的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于 对照组（P < 0. 05,10?100ng/ml)。但是bFGF对黑素细胞的黑素含量没有明显影响（P > 0· 05)。
[0113] 1. 2. 4HGF对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0114] 细胞在无生长因子培养基中（对照）或者含不同浓度HGF(ng/ml)培养基中培养6 天。黑素细胞加入1?l〇〇ng/ml HGF可剂量依赖性的刺激细胞生长（图4)。在含有HGF 的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组（P < 〇. 05,10?100ng/ml)。但是HGF 对黑素细胞的黑素含量没有明显影响（P > 〇. 05)。
[0115] 1. 2. 5细胞因子组合对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0116] 在同时含有两种细胞因子的培养基中，相对于单一因子的促细胞的生长作用有进 一步的增加，BS和BC组细胞在数量上显著多于仅含bFGF培养基培养的细胞（P < 0. 05) (图5)。细胞在无生长因子培养基中（对照）或含不同浓度组合因子培养基中培养6天。 结果显示：表皮黑素细胞在无生长因子的培养基中生长缓慢。加入30ng/ml bFGF可剂 量依赖性的刺激细胞生长（图5)。在含有bFGF(30ng/ml)+SCF(30ng/ml)和bFGF(30ng/ ml) +GM-SCF (30ng/ml)的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组和bFGF (P < 0. 05,10?100ng/ml)。但是各组间对黑素细胞的黑素含量没有明显影响（P > 0. 05)。
[0117] 1. 2. 6IBMX对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0118] 细胞在无 cAMP激动剂培养基中（对照）或者含不同浓度ΙΒΜΧ(0. 3?SOOyg/ml) 培养基中培养6天。细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果以实验组和对照 组的百分比表示（每组3重复，Mean土SD)。结果显示：表皮黑素细胞在无 cAMP激动剂的 培养基中生长缓慢，黑素含量较低。加入〇. 3?100 μ g/ml IBMX可剂量依赖性的刺激细胞 生长（图6)。在含有IBMX的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组（P < 0. 05， 10?lOOyg/ml)。IBMX同时刺激黑素的合成。用含IBMX培养基培养的黑素细胞，其黑素 含量显著高于对照组（P < 〇· 05,1?100 μ g/ml)(图6)。
[0119] 1. 2. 7L-肾上腺素对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0120] 细胞在无 cAMP激动剂培养基中（对照）或者含不同浓度L-肾上腺素培养基中培 养6天。细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果以实验组和对照组的百分比 表示（每组3重复，Mean土SD)。结果显示：表皮黑素细胞在无 cAMP激动剂的培养基中生 长缓慢，黑素含量较低。加入〇. 01?1 μ g/ml L-肾上腺素显著刺激细胞生长，呈剂量依赖 性（图7)。L-肾上腺素同时刺激黑素的合成，用含L-肾上腺素培养基培养的黑素细胞黑 素含量显著高于对照组（P <〇· 05,0· 01?1 μ g/ml)(图7)。
[0121] 1. 2. 8 a -MSH对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0122] 细胞在无 cAMP激动剂培养基中（对照）或者含不同浓度a -MSH(3?3000ng/ml) 培养基中培养6天。相对于无 cAMP激动剂培养基的缓慢生长，加入3?1000ng/ml a -MSH 培养6天后，细胞呈剂量依赖性生长趋势（P < 0. 05)。但黑素细胞的含量并无显著增加，只 有3000ng/ml时刺激黑素合成，黑素含量显著高于其他组（图8)。
[0123] 1. 2. 9CT对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0124] 细胞在无 cAMP激动剂培养基中（对照）或者含不同浓度CT (0· 3?300ng/ml)培 养基中培养6天。相对于无 cAMP激动剂培养基的缓慢生长，加入0. 3?300ng/mlCT培养 6天后，显著促进黑素细胞生长（P < 0. 05)，在0. 3?30ng/ml范围内细胞呈剂量依赖性。 CT显著增强黑素细胞的黑素合成能力，用含CT培养基培养的黑素细胞黑素含量显著高于 对照组（P < 〇· 05,0· 01 ?1 μ g/ml)(图 9)。
[0125] 1. 2. IOcAMP激动因子组合对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用
[0126] 在同时含有两种cAMP激动剂因子的培养基中，相对于单一因子的促细胞的生长 作用有进一步的增加，增加更明显的还有黑素合成能力。在含有30μ g/ml IBMX的培养 基中，再加入l〇〇ng/mla-MSH可进一步刺激细胞生长和黑素合成。在同时含有IBMX和 a -MSH的培养基中培养的细胞在数量上显著多于仅含IBMX培养基培养的细胞和对照组 (P < 0. 05)，在同时含有IBMX和a -MSH的培养基中培养的细胞黑素含量也显著高于仅含 IBMX培养基培养的细胞（P < 0. 05)(图10)。
[0127] 1. 2. 11CHMM1与HX1培养基培养中国人黑素细胞对比研究
[0128] 在6cm培养皿中分别以CHMM1与HX1两种培养基单独培养表皮黑素细胞，细胞以 20000个/ml接种。待培养7天后，CHMM1组细胞收获黑素细胞数量达到6. 23 X 105个，显 著高于HX1组的4. 56X 105个（P < 0. 01)。单皿的黑素总含量CHMM1组接近HX1组的2倍 (122VS68)，其单细胞黑素含量远超HX1培养基组，CHMM1组为196±16pg/cell，相对于HX1 组的149±12pg/ Cell差异明显（P<0.01)。细胞镜下所见数量与状态同实验数据（见图 llhHXl 培养基组成为：体积浓度 10%胎牛血清、25ng/ml bFGF、30ng/ml FGF20、20yg/ml IBMX、30 μ Μ间羟异丙肾上腺素、5 μ g/ml抗坏血酸钠、2mM谷氨酰胺、50 μ g/ml庆大霉素，溶 剂为Ham's F12培养基。
[0129] 表 1
[0130]
【权利要求】
1. 一种适于中国人表皮黑素细胞体外培养的CHMM1培养基，所述CHMM1培养基以适用 于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，所述基质中添加有下列组分：（1)体积浓 度 5 % ?20 % 的血清；（2) 1 ?100ng/mL 的 bFGF 和 1 ?100ng/mL 的 GM-CSF ; (3) 1 ?100 μ g/ mL的异甲基黄嘌呤和3?3000ng/ml a -MSH。
2. 如权利要求1所述CHMM1培养基，其特征在于所述基础培养基为下列之一 ：Ham' s F12培养基、RPMI培养基或DMEM培养基。
3. 如权利要求1所述CHMM1培养基，其特征在于所述基质中添加有下列组分：（1)体积 浓度 10 % ?15 % 的血清；（2) 30 ?100ng/mL 的 bFGF 和 30 ?100ng/mL 的 GM-CSF ; (3) 10 ? 100 μ g/mL的异甲基黄噪呤和30?300ng/ml a -MSH。
4. 如权利要求1所述CHMM1培养基，其特征在于所述基质中添加有下列组分：（1)体积 浓度10 %的血清；（2) 30ng/mL的bFGF和30ng/mL的GM-CSF ; (3) 30 μ g/mL的异甲基黄嘌呤 和 100ng/mla -MSH。
5. 如权利要求1?4之一所述CHMM1培养基，其特征在于所述基质中还添加有0. 1? 5mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μ g/ml链霉素。
6. 如权利要求1所述CHMM1培养基，其特征在于所述CHMM1培养基终浓度组成为： 胎牛血清 体积浓度10% bFGF 30 ng./mL GM-CSF 30 ng/mL 异甲基黄卩票呤 3 0 pg/mL α-MSH 100ng/mL 谷氨酰胺 2 ηιΜ 链祥索 1 OO^ig/ml 身褐索 100U/ml 溶剂为Ham's FI2培养基。
【文档编号】C12N5/071GK104152401SQ201410418119
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】许爱娥, 林福全 申请人:许爱娥