一种miRNA检测试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及miR-148、miR-22、miR-185和miR-221联合使用在诊断食管癌中的应用；miR-148在预测食管癌肿瘤大小变化中的应用；miR-148、miR-185和miR-22联合使用在预测食管癌肿瘤转移中的应用；miR-221或miR-148中的一种或两种在预测食管癌患者生存率中的应用；miR-148、miR-22、miR-185、miR-221和miR-39联合使用在制备食道癌miRNA检测试剂盒中的应用，其中miR-39作为内参；以及相应的检测试剂盒。本发明的miRNA检测试剂盒检测快速方便、准确率高，可以实现食管癌早期诊断及疗效预测。
【专利说明】—种m i RNA检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种miRNA的检测产品以及miR-148、miR-22、miR-185或miR-221在食管癌早期诊断及疗效预测中的应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]我国是世界上食管癌高发地区之一，发病率甚至位居世界第一，每年平均病死约15万人。一旦临床诊断，往往已处于中晚期，5年生存率低于20% ;而早期食管癌手术后5年生存率可达70%~90%。因此，早期诊断和提前预防是食管癌的重点研究方向。现今，临床诊断已由传统地依赖于病理诊断方式转为更大程度上依据分子检测结果，分子检测更成为早期临床诊断的必要检测手段；从基因水平寻找特定的分子标记物，对标志物进行准确快速检测已成为肿瘤早期防治的重要手段之一。越来越多的证据显示，miCToRNA (miRNA)的表达异常参与了食管癌的发生和发展，可作为一种新型的分子标记物。
[0003]microRNA广泛存在于动植物和病毒中，是一类长度约为20~24个核苷酸的非编码的单链RNA分子，通过miRNA剪切和抑制蛋白翻译的方式负调控靶基因，参与多种生物学信号通路的调节。研究表明，miRNA与肿瘤的诊断、分期、预后等密切相关。miRNA被发现可独立存在于细胞之外，而不被血液中内源性的RNA降解酶(endogenous RNase)所破坏,故血中肿瘤特异性miRNA可作为疾病的诊断标志物。另外在肿瘤放射治疗领域，在基础和临床研究中均显示某些miRNA可反映肿瘤放射治疗敏感性，并与肿瘤乏氧密切相关。分析血液中食管癌特异miRNA的表达，筛选出特异性强、灵敏度高、可作为特定肿瘤分子标志物的miRNA，这种利用miRNA分子标记进行疾病诊断、预测疾病发生及预后的非侵入式检测方式为建立食管癌早期筛查及疗效预测等体系及开发相关产品提供了契机。
[0004]鉴于miRNAs在食管癌的发生、发展、侵袭、转移的过程中的重要作用，在食管癌的诊断、治疗和预后等研究领域miRNA也越来越引起重视。Guo Y等研究51例食管鳞癌组织miRNA 的表达发现，miR-25、miR-424 和 miR-151 表达上调，miR-100, miR-99a, miR-29c 及miR-140则表达下调，这些表达异常的miRNA能够准确区分食管鳞癌和正常组织(参见外文文献 Guo Y, Chen ZL, Zhang L et al.Distinctive microRNA profiles relating topatient survival in esophageal _3_ squamous cell carcinoma.Cancer Res, 2008，68(1): 26-33.)Akagi I等的研究表明miR-21和miR-205在食管鳞癌组织中高表达(参见外文文献 Akagi I，Miyashita Mj Ishibashi O et al.Relat1nship between alteredexpress1n levels of MIR21，MIR143，MIR145，and MIR205 and cl inicopathologicfeatures of esophageal squamous cell carcinoma.2011，24(27)，523-30)。Kurashige等检测了 71例食管鳞癌患者血清中miRNA变化，显示miR-21在所有食管鳞癌样本中高表达(参见外文文献 Kurashige Jj Kamohara H，Watanabe Mj et al.Serum microRNA-21is a novel b1marker in patients with esophageal squamous cell carcinoma.J SurgOncol, 2012，106(2): 188-192)。
[0005]如何将上述这些食管癌基础研究领域的成果迅速应用于临床，需要精确核准检测的最有效分子标记物，并建立快捷简便的应用体系，引导相关产品开发。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种检测快速方便、准确率高，可以实现食管癌早期诊断及疗效预测的miRNA检测试剂盒，以及提供miR-148、miR-22、miR-185或miR-221中的一种或多种在食管癌早期诊断及疗效预测中的应用。
[0007]本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是:miR-148、miR_22、miR-185、miR-221和miR-39联合使用在制备食道癌miRNA检测试剂盒中的应用，其中miR-39作为内参。
[0008]基于上述应用本发明提出的具体技术方案是:一种miRNA检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、RCR反应体系和内参体系,所述RCR反应体系中包含分别针对miR-148、miR-22、miR-185、miR-221的正向引物和反向通用引物；所述内参体系包括内参miRNA-39和针对miR-39的正向引物；针对所述miR-148的正向引物的核苷酸序列如SEQID N0.1所示；针对所述miR-22的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；针对所述miR-185的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；针对所述miR-221的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；针对所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0009]用于配制所述RCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。
[0010]上述RCR反应体系的总体积为?ομL ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5μ1，所述正向引物液的体积是?μL，所述反向通用引物液的体积是?μL，所述DNA模板?μL，其余是纯水；所述正向引物液的使用浓度为2μΜ，所述反向通用引物液的使用浓度为2μΜ ;所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释五倍获得的。
[0011]上述反转录反应体系的总体积为12.5μ1 ;其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的体积是5μ1,所述反转录酶混合液的体积是5μ1,所述反转录缓冲液的体积是2.5μ1,所述miRNA样品的加入量是20ng，其余是无核酸酶纯水；所述多聚腺苷酸聚合酶的使用浓度为2.5υ/μ1 ；所述miRNA样品中含有内参miRNA-39。
[0012]上述内参miRNA-39是在抽提miRNA样品过程中加入的体积是2 μL的内参miRNA-39液，其使用浓度为0.2μΜ。
[0013]本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:miR-148、miR-22、miR-185和miR-221联合使用在诊断食管癌中的应用。
[0014]判断公式为:Y1=9.270XAmiK_185-0.665XBmiK_221-1.078XCmiK_148-0.082XDmiK_22-29.771。
[0015]其中AmiK_185是放疗前miR-185的表达量(2_ΛΛετ值)，BmiE_221是放疗前miR-221的表达量(2_6^1值)，0^_148是放疗前miR-148的表达量(2_ΛΛετ值)，DmiK_22是放疗前miR-22的表达量(2^^值)。
[0016]当Y1值>0.5时，则判断为食管癌患者。
[0017] 本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:miR_148在预测食管癌肿瘤大小变化中的应用。
[0018]判断公式为:Y2=放疗后miR-148的表达量(2_^°7值)-放疗前miR-148的表达量(2_δμτ 值)。
[0019]当Υ2>-4.4850时，判断为疗效较好；否则，判断为疗效不佳。
[0020]本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:miR-148、miR-185和miR-22联合使用在预测食管癌肿瘤转移中的应用。
[0021]判断公式(回归方程)为:Y3=0.05AmiE_185+0.09CmiE_148+0.02DmiK_22_3.122。
[0022]其中AmiK_185是放疗前miR-185的表达量(2_ΛΛσ值)，CmiK_148是放疗前miR-148的表达量(2_ΔΔ CT值)，DmiE_22是放疗前miR-22的表达量(2_ΔΔ CT值)。
[0023]当Y3X).4409时，判断为肿瘤转移发生率高；否则，判断为肿瘤转移发生率低。
[0024]本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是:miR_221或miR-148中的一种或两种在预测食管癌患者生存率中的应用。
[0025]判断公式为:
Y4=放疗前miR-148的表达量(2_ΛΛετ值)-放疗后miR-148的表达量(2_ΛΛετ值)。
[0026]Y5=放疗前miR-221的表达量(2_6夂7值)-放疗后miR-221的表达量(2_6夂7值)。
[0027]通过ROC曲线分析，当Y4〈4.25或Y5〈_2.37时，判断为食管癌患者放疗后生存率较高；否则，生存率较低。
[0028]本发明具有积极的效果:
(I) miR-148、miR-22、miR-185和miR-221作为独立或组合分子标记物，经过大数据临床验证实验，首次应用于上述miRNA检测试剂盒的开发，实现了 I) miR-148、miR-22、miR-185和miR-221作为组合分子标志物在早期诊断食管癌中的应用；2) miR-148作为独立分子标记物在预测食管癌放疗疗效(肿瘤大小变化)中的应用；3) miR-148、miR-22和miR-185作为组合分子标志物在预测食管癌转移发生率中的应用；4)miR-148或miR-221在预测食管癌患者生存率中的应用。
[0029](2)本发明的miRNA检测试剂盒选择了特异性强、灵敏度高的miR-148、miR-22、miR-185和miR-221这四个miRNA标记物进行组合，开发成检测试剂盒，检测快速方便、准确率高、一个试剂盒实现四方面的应用，满足不同肿瘤病人的检测需求，应用范围极广，经临床验证预测准确率高。
[0030](3)本发明的miRNA检测试剂盒针对血清中作为定量反应的内参,不同样本中差异很大的因素，特别引入稳定的外源RNA序列miR-39(来源于线虫)作为内参对照RNA，并优化设计了针对miR-39的内参正向引物，极大提高了进行miRNA检测时相对定量的准确度。
[0031](4)本发明的试剂盒运用实时荧光定量PCR方法，研究血清中食管癌患者和正常对照组的miRNA表达水平的变化，miR-148、miR-22、miR-185和miR-221均高表达可以很好地预测食管癌的发生，进行辅助诊断；miR-148放疗前后表达量的变化可预测肿瘤大小的变化，评估食管癌放疗疗效；miR-148、miR-185和miR-22放疗前的表达量可以用于预测食管癌肿瘤转移的发生率;miR-221或miR-148放疗前的表达量可以预测食管癌患者的生存率。本发明的miRNA检测试剂盒通过检测miR-148、miR-22、miR-185和miR-221的表达量，使得食管癌的早期诊断及疗效预测变得可行。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是采用本发明的试剂盒检测出的放疗前肿瘤病人四种miRNA的平均表达量图表;
图2是采用本发明的试剂盒检测出的放疗前后肿瘤病人miR-148的表达量与放疗疗效相关性的图表；
图3是采用本发明的试剂盒检测出的放疗前肿瘤病人四种miRNA的表达量与肿瘤转移相关性的图表；
图4是采用本发明的试剂盒检测出的放疗前肿瘤病人miR-148的表达量与病人生存率相关性的图表；
图5是采用本发明的试剂盒检测出的放疗前肿瘤病人miR-221的表达量与病人生存率相关性的图表； 图6是采用本发明的试剂盒检测出的放疗前后肿瘤病人miR-148的表达量与病人生存率相关性的图表；
图7是采用本发明的试剂盒检测出的放疗前后肿瘤病人miR-221的表达量与病人生存率相关性的图表。
【具体实施方式】
[0033]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
[0034]实施例1
一、试剂盒的组成。
[0035]本实施例的miRNA检测试剂盒，包括用于配制反转录反应体系的试剂、用于配制PCR体系的试剂和内参体系。
[0036]1、内参体系:
内参体系的试剂包括内参miRNA-39液和针对miR-39的正向引物液。
[0037]内参miRNA-39 液为现虫 cel-miR-39 (Access1n Number:AJ487564)溶液，为英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，封装在一个小瓶中，配制的浓度为20μΜ，共10μ1，使用浓度为0.2μΜ。
[0038]针对miR-39的正向引物液封装在一个小瓶中，体积是100μΙ，使用浓度为2μΜ。
[0039]2、反转录反应体系:
用于配制反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶(polyA polymerase,供应商:GeneCopoeia,商品号:Cat#A02030B)、反转录酶混合液(RTase Mix,供应商:GeneCopoeia,商品号:Cat#C02020B)、反转录缓冲液(5XPAP/RT buffer,供应商:GeneCopoeia,商品号:Cat#C02022B)和无核酸酶纯水(RNase and DNase free H2O,供应商:GeneCopoeia,商品号:Cat#C10230A)。用于配制反转录反应体系的试剂逐瓶封装，使用时按一定的比例配置成反转录反应体系，反转录反应体系为12.5μ1/次,封装的体积是100次的用量,如表1所示。
[0040]表1反转录反应体系组分表
【权利要求】
1.miR-148、miR-22、miR-185和miR-221联合使用在诊断食管癌中的应用。
2.miR-148在预测食管癌肿瘤大小变化中的应用。
3.miR-148、miR-185和miR-22联合使用在预测食管癌肿瘤转移中的应用。
4.miR-221或miR-148中的一种或两种在预测食管癌患者生存率中的应用。
5.miR-148,miR-22,miR-185,miR-221 和 miR-39 联合使用在制备食道癌 miRNA 检测试剂盒中的应用，其中miR-39作为内参。
6.如权利要求5所述应用的miRNA检测试剂盒，其检测体系包括反转录反应体系、RCR反应体系和内参体系，其特征在于:所述RCR反应体系中包含分别针对miR-148、miR-22、miR-185、miR-221的正向引物和反向通用引物；所述内参体系包括内参miRNA_39和针对miR-39的正向引物；针对所述miR-148的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；针对所述miR-22的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；针对所述miR-185的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示；针对所述miR-221的正向引物的核苷酸序列如SEQID N0.4所示；针对所述miR-39的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示；所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
7.根据权利要求6所述的miRNA检测试剂盒，其特征在于:用于配制所述RCR反应体系的试剂包括SYBR Green混合液、正向引物液、反向通用引物液和纯水；用于配制所述反转录反应体系的试剂包括多聚腺苷酸聚合酶、反转录酶混合液、反转录缓冲液和无核酸酶纯水。
8.根据权利要求7所述的miRNA检测试剂盒，其特征在于:所述RCR反应体系的总体积为ΙΟμΙ ;其中，所述SYBR Green混合液的体积是5μ1，所述正向引物液的体积是?μL，所述反向通用引物液的体积是?μL，所述DNA模板?μL，其余是纯水；所述正向引物液的使用浓度为2μΜ，所述反向通用引物液的使用浓度为2μΜ ;所述DNA模板是所述反转录反应体系反应后的产物稀释五倍获得的。
9.根据权利要求7所述的miRNA检测试剂盒，其特征在于:所述反转录反应体系的总体积为12.5μ1 ;其中，所述多聚腺苷酸聚合酶的体积是5μ1，所述反转录酶混合液的体积是5μ1,所述反转录缓冲液的体积是2.5μ1,所述miRNA样品的加入量是20ng,其余是无核酸酶纯水；所述多聚腺苷酸聚合酶的使用浓度为2.5υ/μ1 ;所述miRNA样品中含有内参miRNA-39。
10.根据权利要求7所述的miRNA检测试剂盒，其特征在于:所述内参miRNA-39是在抽提miRNA样品过程中加入的体积是2 μL的内参miRNA-39液，其使用浓度为0.2μΜ。
【文档编号】C12Q1/68GK104131113SQ201410417907
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年8月22日
【发明者】赵新泰, 王明, 吕慧锋 申请人:上海赛安生物医药科技有限公司