利用ube3基因构建核苷酸分子式鉴定植物品种的方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定植物品种的方法。本发明提供了鉴定紫薇品种的方法，包括如下步骤：1)以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；2)将所述PCR产物测序，根据测序结果列出所述待测紫薇的核苷酸分子式；3)将步骤2)所得的核苷酸分子式与对应的若干个紫薇品种的核苷酸分子式进行比对，从而确定所述待测紫薇的品种。实验证明，该方法精确、操作简捷，可以提高相关产业的生产效率和质量监控水平，有效弥补以往方法的不足；另外，该方法同时实现了非花期(如苗期)的鉴定。本方法对于促进紫薇的新品种选育、紫薇花木产业与城市园林绿化事业的发展以及环境保护具有重要意义。
【专利说明】利用UBE3基因构建核苷酸分子式鉴定植物品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种鉴定或辅助鉴定植物品种的方法，特别涉及 一种利用泛素连接酶基因 （Nuclear DNA E3 ubiquitin ligase gene, UBE3)构建核苷酸分 子式鉴定植物品种的方法。
【背景技术】
[0002] 植物品种是指经过人工选育而形成的种性基本一致、遗传性比较稳定、具有人类 需要的某些经济性状：如观赏性状、药用性状或其它经济性状，作为特殊生产资料用的栽培 植物群体。如牡丹品种、核桃品种、苹果品种、紫薇品种等。
[0003] 植物品种一般利用表型性状进行鉴定和识别。但是，植物品种在特征表现上存在 季节差异，在有的季节可能表现不出品种间有差异的性状。例如，紫薇品种通常按照花型和 花色进行分类，花期以外的时间存在品种鉴定难的问题。
[0004] 品种的准确鉴定和纯度分析一直是经济植物和资源植物（如花卉）产业发展上的 重要课题。在规模化生产领域，以某种具体植物品种为生产资料和/或产品进行大规模生 产的企业等，需要借助灵敏度高的DNA分子分形检测技术进行精确鉴定和分析。
[0005] 紫薇（Lagerstroemia indica L.)又名百日红、满堂红等，为千屈菜科 (Lythraceae)紫薇属的灌木或乔木，是中国有名的盛夏观赏花木。紫薇的叶能吸附空气中 的烟尘，是优良的环保树种，在城市园林绿化和荒山绿化中应用前景广阔。
[0006] 全世界紫薇栽培品种约500多个，以美国、中国及日本的品种最多，其中美国有 200多个品种，中国有100多个品种，日本有80多个品种。紫薇在中国已有1500多年的栽 培历史，唐代就已经盛栽紫薇作为观赏花木。目前，紫薇在北京、天津、上海、重庆、广东、海 南、广西、福建、湖南、湖北、四川、云南、浙江、山东、陕西、吉林及香港、澳门、台湾均有生长 或栽培。紫薇种质资源的精确鉴定对于新品种培育、生理学、生态学等众多领域开展科学研 究以及对推动紫薇在园林绿化中的应用是至关重要的基础工作。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法。
[0008] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，是利用泛素连接酶基 因序列中的变异位点构建核苷酸分子式进而鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，具体包 括如下步骤：
[0009] (1)以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单 链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0010] (2)将所述PCR产物测序后截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5'末端起的前76 个核苷酸（所述76个核苷酸为PCR产物5'端的保守序列；当然也可以同时截掉PCR产物 3'端的保守序列），剩余序列作为待比对序列（非保守区）；
[0011] (3)将所述待比对序列与DNA序列数据库中的全部序列放在一起，利用ClustalX 或Mega等软件进行比对，自动生成一个DNA比对序列矩阵；
[0012] 所述DNA比对序列矩阵是根据特定的计分规则，将两个或多个序列按位置比较排 列后产生的数据集，最大限度地反映了序列间的相似性（如图1所示）。其中涉及到的特定 的计分规则和算法等相关常识和原理在"生物序列分析"方面的专著中均有记载。所述DNA 比对序列矩阵可直接反映在同一核苷酸位点上各序列之间是否存在差异，以及存在怎样的 差异。找到核苷酸字母有差异的列在所述DNA比对序列矩阵中的位置，核准该位置位于所 述DNA比对序列矩阵5'端起的位置顺序编号，即确定了一个多态位点。
[0013] 所述DNA序列库为如下（al)或（a2):
[0014] (al)由序列表中序列3和/或序列4组成；
[0015] (a2)由序列表中序列3和序列4中的至少一种，和序列5至序列10中的至少一种 组成；
[0016] 其中，序列3和序列4为长度620bp的序列；序列5至序列10为长度61 lbp或 614bp的序列。
[0017] (4)根据所述DNA比对序列矩阵列出所述待测紫薇的核苷酸分子式；
[0018] 所述待测紫薇的核苷酸分子式的通式为：
[0019] B152B161B173B215B221B 245B294B299B426B431B 440B462B527B551B557 ;
[0020] 在所述通式中，所述b152、所述b161、所述b 173、所述b215、所述b221、所述b245、所述b 294、 所述b299、所述b426、所述b431、所述b 44(i、所述b462、所述b527、所述b551和所述b 557，依次表示在所 述 DNA 比对序列矩阵中的第 152、161、173、215、221、245、294、299、426、431、440、462、527、 551和557个位点（即多态核苷酸位点的位置顺序编号以比对序列为基础进行确定，才合 理，符合科学，否则没有规律可循）；
[0021] 在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种或两种；
[0022] 当所述待测紫薇为纯合型时，在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种， 在测序时显示单一峰；当所述待测紫薇为杂合型时，在所述通式中，每一个B可能为A、T、C 和G中的两种，在测序时会得到明显的叠加双峰。
[0023] (5)将步骤（4)所得所述待测紫薇的核苷酸分子式与核苷酸分子式组I进行比 对；
[0024] 所述核苷酸分子式组I由如下al)_a8)共8种核苷酸分子式组成：
[0025] al) Y152G161C173Y215R221G 245R294C299C426C431A 44(IA462C527A551G557 ;
[0026] a2) Y152K161Y173Y215G221G 245G294C299C426Y431R 44(IA462Y527A551G557 ;
[0027] a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 44(IG462C527A551A557 ;
[0028] a4) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C426Y431R 44(IR462T527A551G557 ;
[0029] a5) Y152G161C173C215R221G 245G294C299C426C431R 44(IR462C527A551R557 ;
[0030] a6) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C426Y431R 44(IR462Y527A551R557 ;
[0031] a7) C152G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 44(IA462C527A551G557 ;
[0032] a8) C152K161Y173C215G221G 245G294C299C426Y431G 44(IA462Y527A551G557 ;
[0033] 在al) _a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A 和T (即所述待测紫薇的相应位点为杂合型）；
[0034] (6)根据步骤（5)的比对结果，按照如下方法对所述待测紫薇进行品种鉴定：
[0035] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为al)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'翠盘红粉'；
[0036] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a2)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'红环直枝紫'；
[0037] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a3)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'小花杂种粉'；
[0038] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a4)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'宝庆淡紫'；
[0039] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a5)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'大白花'；
[0040] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a6)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'芙蓉面'；
[0041] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a7)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'建民粉'；
[0042] 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a8)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为 或候选为紫薇品种'多花紫云'。
[0043] 当然，所述方法中，步骤（1)中采用的引物对不限于序列表中序列1和序列2组成 的引物对，位于保守区的其他的引物对也可以，只要能够扩增得到步骤（2)中的所述待比 对序列（非保守区）即可。
[0044] 再有，在所述方法中，进行比对的所述待比对序列（非保守区），其两端保守区序 列的去除不限于以上步骤（2)中所述，只要能够涵盖用于供试样品（如紫薇品种）鉴定的 核苷酸分子式中的多态位点即可；相应的，步骤（4)中通式中B的右下角的编号也会因为 5'端保守区序列取舍的多少而相应地发生变化，但是，多态位点之间的相对位置不变。
[0045] 进一步，以上本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，其操作步骤 可转化为如下 ：
[0046] (1)以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单 链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；
[0047] (2)将所述PCR产物测序，将测序结果与核苷酸序列组I进行比对；
[0048] 所述核苷酸序列组I由序列表中序列3-10共8个序列组成；
[0049] (3)根据步骤（2)的比对结果，按照如下方法对所述待测紫薇进行鉴定：
[0050] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列3,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'宝庆淡紫'；
[0051] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列4,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'芙蓉面'；
[0052] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列5,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'翠盘红粉'；
[0053] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列6,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'小花杂种粉'；
[0054] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列7,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'大白花'；
[0055] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列8,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'多花紫云'；
[0056] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列9,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'红环直枝紫'；
[0057] 若所述PCR产物的核苷酸序列中含有序列10,则所述待测紫薇为或候选为紫薇品 种'建民粉'。
[0058] 在上述方法中，所述待测紫薇为如下8个品种中的任一种：'宝庆淡紫'、'芙蓉 面'、'翠盘红粉'、'小花杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝紫'、'建民粉'。
[0059] 本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的试剂盒。
[0060] 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的试剂盒，具体可包括引物 对、记载有核苷酸分子式组I的对比卡；
[0061] 所述引物对具体由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成；
[0062] 所述核苷酸分子式组I具体由如下al)_a8)共8种核苷酸分子式组成：
[0063] al) Y152G161C173Y215R221G 245R294C299C426C431A 44(IA462C527A551G557 ;
[0064] a2) Y152K161Y173Y215G221G 245G294C299C426Y431R 44(IA462Y527A551G557 ;
[0065] a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C4 26^431-^-440^462^527-^-551-^-557 ?
[0066] a4) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C4 26^431^440^462^527-^-551^557 ；
[0067] a5) Y152G161C173C215R221G 245G294C299C4 26^431^440^462^527-^-551^557 ?
[0068] a6) Y152K161Y173C215R221G 245G294C299C 426^431^440^462^527-^-551^557 ?
[0069] a7) C152G161C173C215G221G 245G294C299C4 26〇431〇44〇Α462〇527Α5516557 ;
[0070] a8) C152K161Y173C215G221G 245G294C299C426Y431G 44(IA462Y527A551G557 ;
[0071] 在al)_a8)中，M表示A和C;K表示G和T ;Y表示T和C;R表示A和G;W表示A 和T (即所述待测紫薇的相应位点为杂合型）；
[0072] 所述待测紫薇可为如下8个品种中的任一种：'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'翠盘红粉'、 '小花杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝紫'、'建民粉'。
[0073] 所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0074] 所述待测紫薇为如下8个品种中的任一种：'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'翠盘红粉'、 '小花杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝紫'、'建民粉'。
[0075] 本发明的再一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测植物品种的方法。
[0076] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测植物品种的方法，具体可包括如下步骤：
[0077] (1)通过比对属于同一植物的多个品种的泛素连接酶基因序列，选取所述多个品 种的泛素连接酶基因序列中存在单核苷酸多态位点的区域作为目的DNA区域；
[0078] (2)利用所述目的DNA区域两侧保守区域的序列，设计能够扩增得到含有所述目 的DNA区域的DNA片段的引物；
[0079] (3)用所述引物对所述多个品种中的每个品种的基因组DNA分别进行PCR扩增，从 每个品种中得到含有所述目的DNA区域的DNA片段；
[0080] (4)对步骤（3)从每个品种中获得的含有所述目的DNA区域的DNA片段进行测序， 从而获得每个品种的所述目的DNA区域的核苷酸序列；
[0081] (5)将所述多个品种的所述目的DNA区域的核苷酸序列放在一起进行比对，得到 DNA比对序列矩阵，根据所述DNA比对序列矩阵确定单核苷酸多态位点，列出每个品种的鉴 定用核苷酸分子式；
[0082] 所述核苷酸分子式由根据所述DNA比对序列矩阵从5'末端到3'末端或从3'末 端到5'末端依次列出所有的所述单核苷酸多态位点的核苷酸种类及其在所述DNA比对序 列矩阵中的位置顺序编号组成；所述核苷酸分子式通式为Bx1Bx2Bx3……B xn，通式中，B为单核 苷酸多态位点上的核苷酸种类，为A、T、C、G四种中的任一种或两种；xl为第1个单核苷酸多 态位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起的位置顺序编号， x2为第2个单 核苷酸多态位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起的位置顺序编号，x3为 第3个单核苷酸多态位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起的位置顺序编 号，类推， xn为第η个单核苷酸多态位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起 的位置顺序编号；
[0083] 所述Βχ1Βχ2Βχ3……Β χη为将所有的所述单核苷酸多态位点按照在所述DNA比对序列 矩阵中从5'末端或3'末端起依次列出；当然在实际操作中，区分效果相同的位点，可以只 保留一个，用于构建核苷酸分子式；
[0084] (6)将具有相同所述核苷酸分子式的品种组成一个谱系，具有不同核苷酸分子式 的品种作为不同的谱系，所有谱系构成核苷酸分子式谱系表；
[0085] 所述核苷酸分子式谱系表中，每一种核苷酸分子式对应来自一个谱系的植物品 种；
[0086] (7)将属于步骤⑴中所述同一植物的待测植物品种按照步骤（3)-(5)重复操作， 用所述待测植物品种替代步骤（3)-(5)中的所述每个品种，得到所述待测植物品种的核苷 酸分子式；将所述待测植物品种的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的所有核苷 酸分子式进行比较，按照如下方法确定所述待测植物品种的名称及其隶属的谱系：若所述 待测植物品种的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的一个核苷酸分子式相同，则 所述待测植物品种为或候选为所述一个核苷酸分子式对应的所述谱系中的任意一个品种。 [0087] 所述方法灵敏度高，适用于鉴定某一种植物的不同品种。
[0088] 在本发明中，所述植物具体为紫薇的不同品种。
[0089] 在所述方法中，所述目的DNA区域具体可来自于所述植物的基因组内的泛素连接 酶基因区。
[0090] 在本发明中，步骤（2)中，所述引物具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条 单链DNA分子组成的引物对；所述目的DNA区域具体来自于采用所述引物对对所述植物的 基因组DNA进行PCR扩增所得的PCR产物。
[0091] 进一步，所述紫薇的多个品种及其对应的所述目的DNA区域为如下：
[0092] 所述紫薇的多个品种为如下8个品种中的至少两种：'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'翠 盘红粉'、'小花杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝紫'、'建民粉'。
[0093] 所述紫薇品种'宝庆淡紫'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列3 ;
[0094] 所述紫薇品种'芙蓉面'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列4 ;
[0095] 所述紫薇品种'翠盘红粉'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列5 ;
[0096] 所述紫薇品种'小花杂种粉'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列6 ;
[0097] 所述紫薇品种'大白花'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列7 ;
[0098] 所述紫薇品种'多花紫云'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列8 ;
[0099] 所述紫薇品种'红环直枝紫'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列9 ; [0100] 所述紫薇品种'建民粉'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列10。
[0101] 更加具体的，所述紫薇品种'翠盘红粉'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152G 161 C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557 ;
[0102] 所述紫薇品种'红环直枝紫'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152K 161Y173Y215G221 G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ;
[0103] 所述紫薇品种'小花杂种粉'的所述DNA区域的核苷酸分子式为T152G 161C173C215A221 G245G294C299C426C431A440G462C527A551A557 ;
[0104] 所述紫薇品种'宝庆淡紫'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152K161Y 173C215R221G245 G294C299C426Y431R440R462T527A551G557 ;
[0105] 所述紫微品种'大白花'的所述DNA区域的核昔酸分子式为Y152G161C 173C215R221G245G2 94C299C426C431R440R462C527A551R557 ;
[0106] 所述紫微品种'芙容面'的所述DNA区域的核昔酸分子式为Y152K161Y 173C215R221G245G2 94C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ;
[0107] 所述紫薇品种'建民粉'的所述DNA区域的核苷酸分子式为C152G161C 173C215G221G245G2 94C299C426C431G440A462C527A551G557 ;
[0108] 所述紫微品种'多花紫z?'的所述DNA区域的核昔酸分子式为C152K 161Y173C215G221G245 G294C299C426Y431G440A462Y527A551G557 ;
[0109] 其中，Μ表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T (即 所述待测紫薇的相应位点为杂合型）。
[0110] 本发明以紫薇品种的鉴定过程为例，实验证明，本发明所提供的利用该分子式鉴 定植物（如紫薇）品种的方法较为精确、操作简捷，可以提高相关产业的生产效率和质量监 控水平，有效弥补以往方法的不足；另外，该方法同时实现了非花期（如苗期）的精准鉴定。 本方法对于促进紫薇的新品种选育、紫薇花木产业和城市园林绿化事业的发展以及环境保 护具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0111] 图1为将8个紫薇品种的zw_UBE3序列进行序列比对后得到的DNA比对序列矩阵 的局部示意图。其中，数字"397"和"502"即表示相应核苷酸位点在该DNA比对序列矩阵中 的位置顺序编号；有*标注的列即表示8个紫薇品种在该位点的核苷酸种类完全相同；-表 示相应位点处核苷酸缺失。由于品种间实际测序得到的DNA序列长度略有差异，比对后，有 的品种的序列内会出现核苷酸位点缺失。
【具体实施方式】
[0112] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0113] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0114] 紫薇（Lagerstroemia indica L.)品种'翠盘红粉'、'红环直枝紫'、'小花杂种 粉'、'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'大白花'、'建民粉'、'多花紫云'和'红爪深紫'的幼叶采自湖 南省邵阳市紫薇花木研究所的紫薇品种资源圃。
[0115] 实施例1、利用核苷酸分子式鉴定紫薇品种的方法的建立及其应用
[0116] 为了构建能够用于有效鉴定紫薇品种的核苷酸分子式，本发明的发明人从以下紫 薇品种系列中获得泛素连接酶基因的一段非保守区DNA序列，并对其中的多态位点进行了 统计分析。作为供试材料的紫薇品种共8种，具体如下：'翠盘红粉'、'红环直枝紫'、'小花 杂种粉'、'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'大白花'、'建民粉'和'多花紫云'。
[0117] 一、引物设计
[0118] 根据泛素连接酶基因的一段非保守区DNA序列两端的保守区，设计如下引物：
[0119] 正向引物：5' -GTCCCCGTGATGTTTGA-3'（序列 1);
[0120] 反向引物：5 ' -GGTCCTTTGCCCGTAG-3 '（序列 2)。
[0121] 二、PCR扩增及PCR产物的序列测定
[0122] 以作为供试材料的8个紫薇品种的幼嫩叶片为实验材料，采用植物基因组DNA提 取试剂盒（中国天根生物技术（北京）有限公司产品，其产品目录号为DP305)提取各样品 材料的基因组DNA。以所得基因组DNA为模板，采用步骤一设计的引物对进行PCR扩增。结 果显示，每个紫薇品种均可得到一条长度为771-780bp的PCR产物。
[0123] 对纯化后的各PCR产物进行测序，获得了含有若干多态位点的长度为620bp的DNA 序列（记为zw_UBE3)。根据供试的8个紫薇品种的测序结果，将zw_UBE3序列定义为所述 PCR产物的核苷酸序列自5'端起的第77-696位^20bp)或为所述PCR产物的核苷酸序列 自5'端起的第77-687位（611bp)或为所述PCR产物的核苷酸序列自5'端起的第77-690 位（614bp)。将所述PCR产物的核苷酸序列自5'端起的第77个核苷酸记为第1位，当第 468-488位的这21个核苷酸为7个GGC重复单元时，所述zw_UBE3序列为所述PCR产物的 核苷酸序列自5'端起的第77-696位（记为zw_UBE3序列A);当第468-488位的这21个 核苷酸为4个GGC重复单元和9个缺失碱基位点时（即与上述zw_UBE3序列A相比缺失3 个GGC重复单元），所述zw_UBE3序列为所述PCR产物的核苷酸序列自5'端起的第77-687 位；当第468-488位这21个核苷酸为5个GGC重复单元和6个缺失碱基位点时（即与上述 zw_UBE3序列A相比缺失2个GGC重复单元），所述zw_UBE3序列为所述PCR产物的核苷酸 序列自5'端起的第77-690位。（这个第468-488位的GGC重复单元属于变异的高频率发 生区域，未来的待测紫薇品种的测序结果中也可能出现较长或较短的序列变化，可能会因 待测样品的不同而略有变化，届时可根据实际情况获得比对序列矩阵，确定后面的多态位 点的位置顺序编号。）
[0124] 结果显示，紫薇品种'宝庆淡紫'的zw_UBE3序列为序列表中序列3 ;
[0125] 紫薇品种'芙蓉面'的zw_UBE3序列为序列表中序列4 ;
[0126] 紫薇品种'翠盘红粉'的zw_UBE3序列为序列表中序列5 ;
[0127] 紫薇品种'小花杂种粉'的zw_UBE3序列为序列表中序列6 ;
[0128] 紫薇品种'大白花'的zw_UBE3序列为序列表中序列7 ;
[0129] 紫薇品种'多花紫云'的zw_UBE3序列为序列表中序列8 ;
[0130] 紫薇品种'红环直枝紫'的zw_UBE3序列为序列表中序列9 ;
[0131] 紫薇品种'建民粉'的zw_UBE3序列为序列表中序列10。
[0132] 三、序列比对
[0133] 将步骤二所得的8个紫薇品种的zw_UBE3序列进行比对，获得DNA比对序列矩阵 (aligned sequence matrix)。进而获得如表1中的紫薇品种鉴定用15个单核苷酸多态位 点。
[0134] 表1 8个紫薇品种的zw_UBE3序列中的单核苷酸多态位点
[0135]
【权利要求】
1. 一种鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的方法，包括如下步骤： (1) 以待测紫薇的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链 DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物； (2) 将所述PCR产物测序后，截掉所述PCR产物的核苷酸序列自5'末端起的前76个核 苷酸，剩余序列作为待比对序列； (3) 将所述待比对序列与DNA序列库中的全部序列放在一起进行比对，得到DNA比对序 列矩阵； 所述DNA序列库为如下（al)或（a2): (al)由序列表中序列3和/或序列4组成； (a2)由序列表中序列3和序列4中的至少一种，和序列5至序列10中的至少一种组 成； (4) 根据所述DNA比对序列矩阵列出所述待测紫薇的核苷酸分子式； 所述待测紫薇的核苷酸分子式的通式为： B152B161B173B215B221B245B294B299B426B431B440B462B527B551B557 ; 在所述通式中，所述B152、所述B161、所述B173、所述B 215、所述B221、所述B245、所述B294、所 述B299、所述B426、所述B431、所述B44Q、所述B 462、所述B527、所述B551和所述B557，依次表示在所 述 DNA 比对序列矩阵中的第 152、161、173、215、221、245、294、299、426、431、440、462、527、 551和557个位点； 在所述通式中，每一个B为A、T、C和G中的任一种或两种； (5) 将步骤（4)所得所述待测紫薇的核苷酸分子式与核苷酸分子式组I进行比对； 所述核苷酸分子式组I由如下al) _a8)共8种核苷酸分子式组成： a!) Y152G161C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557; a2) Y152K161Y173Y215G221G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 440G462C527A551A557 ; a4) Yl52Ki6lYl73C2i5R22lG245G294C299C426Y431R 440R462T527A551G557 ; a5) Y152G161C173C215R221G245G294C299C426C431R440R462C527A551R557 ; a6) Y152K161Y173C215R221G245G294C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ; a?) Ci52G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 440A462C527A551G557 ; a8)。152〖161丫173。215〇221〇245〇294。299。426丫431〇44〇八462丫527八 5516557 ; 在al)-a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T ; (6) 根据步骤（5)的比对结果，按照如下方法对所述待测紫薇进行品种鉴定： 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为al)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫薇品种'翠盘红粉'； 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a2)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫微品种'红环直枝紫'； 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a3)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫薇品种'小花杂种粉'； 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a4)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫薇品种'宝庆淡紫'； 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a5)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫微品种'大白花'； 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a6)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫微品种'芙容面'； 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a7)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫薇品种'建民粉'； 若所述待测紫薇的核苷酸分子式为a8)所示的核苷酸分子式，则所述待测紫薇为或候 选为紫薇品种'多花紫云'。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测紫薇为如下8个品种中的任一 种：'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'翠盘红粉'、'小花杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝 紫'、'建民粉'。
3. -种用于鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种的试剂盒，包括引物对、记载有核苷酸分子 式组I的对比卡； 所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成； 所述核苷酸分子式组I由如下al) _a8)共8种核苷酸分子式组成： a!) Y152G161C173Y215R221G245R294C299C426C431A440A462C527A551G557; a2) Y152K161Y173Y215G221G245G294C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; a3) T152G161C173C215A221G 245G294C299C426C431A 440G462C527A551A557 ; a4) Yl52Ki6lYl73C2i5R22lG245G294C299C426Y431R 440R462T527A551G557 ; a5) Y152G161C173C215R221G245G294C299C426C431R440R462C527A551R557 ; a6) Y152K161Y173C215R221G245G294C299C426Y431R440R462Y527A551R557 ; a?) Ci52G161C173C215G221G 245G294C299C426C431G 440A462C527A551G557 ; a8)。152〖161丫173。215〇221〇245〇294。299。426丫431〇44〇八462丫527八 5516557 ; 在al)-a8)中，M表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T ; 所述待测紫薇为如下8个品种中的任一种：'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'翠盘红粉'、'小花 杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝紫'、'建民粉'。
4. 权利要求3所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测紫薇品种中的应用； 所述待测紫薇为如下8个品种中的任一种：'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'翠盘红粉'、'小花 杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝紫'、'建民粉'。
5. -种鉴定或辅助鉴定待测植物品种的方法，包括如下步骤： (1)通过比对属于同一植物的多个品种的泛素连接酶基因序列，选取所述多个品种的 泛素连接酶基因序列中存在单核苷酸多态位点的区域作为目的DNA区域； ⑵利用所述目的DNA区域两侧保守区域的序列，设计能够扩增得到含有所述目的DNA 区域的DNA片段的引物； ⑶用所述引物对所述多个品种中的每个品种的基因组DNA分别进行PCR扩增，从每个 品种中得到含有所述目的DNA区域的DNA片段； (4) 对步骤（3)从每个品种中获得的含有所述目的DNA区域的DNA片段进行测序，从而 获得每个品种的所述目的DNA区域的核苷酸序列； (5) 将所述多个品种的所述目的DNA区域的核苷酸序列放在一起进行比对，得到DNA比 对序列矩阵，根据所述DNA比对序列矩阵确定单核苷酸多态位点，列出每个品种的核苷酸 分子式； 所述核苷酸分子式由根据所述DNA比对序列矩阵从5'末端到3'末端或从3'末端到 5'末端依次列出所有的所述单核苷酸多态位点的核苷酸种类及其在所述DNA比对序列矩 阵中的位置顺序编号组成；所述核苷酸分子式通式为B x1Bx2Bx3……Bxn，通式中，B为单核苷酸 多态位点上的核苷酸种类，为A、T、C、G四种中的任一种或两种 ；xl为第1个单核苷酸多态 位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起的位置顺序编号，x2为第2个单核 苷酸多态位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起的位置顺序编号， x3为第3 个单核苷酸多态位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起的位置顺序编号， 类推， xn为第η个单核苷酸多态位点在所述DNA比对序列矩阵中从5'末端或3'末端起的 位置顺序编号； 所述Βχ1Βχ2Βχ3……Βχη为将所有的所述单核苷酸多态位点按照在所述DNA比对序列矩阵 中从5'末端或3'末端起依次列出； (6) 将具有相同所述核苷酸分子式的品种组成一个谱系，具有不同核苷酸分子式的品 种为不同的谱系，所有谱系构成核苷酸分子式谱系表； 所述核苷酸分子式谱系表中，每一种核苷酸分子式对应来自一个谱系的植物品种； (7) 将属于步骤（1)中所述同一植物的待测植物品种按照步骤（3)-(5)重复操作，用所 述待测植物品种替代步骤（3)-(5)中的所述每个品种，得到所述待测植物品种的核苷酸分 子式；将所述待测植物品种的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的所有核苷酸分 子式进行比较，按照如下方法确定所述待测植物品种的名称及其隶属的谱系：若所述待测 植物品种的核苷酸分子式与所述核苷酸分子式谱系表中的一个核苷酸分子式相同，则所述 待测植物品种为或候选为所述一个核苷酸分子式对应的所述谱系中的任意一个品种。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物为紫薇。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述目的DNA区域来自于所述植物 的基因组内的泛素连接酶基因区。
8. 根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于： 步骤⑵中，所述引物具体为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组 成的引物对； 所述目的DNA区域来自于采用所述引物对对所述植物的基因组DNA进行PCR扩增所得 的PCR产物。
9. 根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述紫薇的多个品种及其对应 的所述目的DNA区域为如下： 所述紫薇的多个品种为如下8个品种中的至少两种：'宝庆淡紫'、'芙蓉面'、'翠盘红 粉'、'小花杂种粉'、'大白花'、'多花紫云'、'红环直枝紫'、'建民粉'； 所述紫薇品种'宝庆淡紫'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列3 ; 所述紫薇品种'芙蓉面'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列4 ; 所述紫薇品种'翠盘红粉'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列5 ; 所述紫薇品种'小花杂种粉'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列6 ; 所述紫薇品种'大白花'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列7 ; 所述紫薇品种'多花紫云'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列8 ; 所述紫薇品种'红环直枝紫'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列9 ; 所述紫薇品种'建民粉'的所述DNA区域的核苷酸序列为序列表中序列10。
10.根据权利要求5-8中任一所述方法，其特征在于： 所述紫薇品种'翠盘红粉'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152G161C173Y 215R221G245R294C 299。426。431八44〇八462。527八551〇557 ; 所述紫薇品种'红环直枝紫'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152K161Y173Y 215G221G245G2 94C299C426Y431R440A462Y527A551G557 ; 所述紫微品种'小花杂种粉'的所述DNA区域的核昔酸分子式为T152G161C173C 215A221G245G2 94C299C426C431A440G462C527A551A557 ; 所述紫薇品种'宝庆淡紫'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152K161Y173C 215R221G245G294C 299C426Y431R440R462T527A551G557 ; 所述紫薇品种'大白花'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152G161C173C 215R221G245G294C299 C426C431R440R462C527A551R557 ; 所述紫薇品种'芙蓉面'的所述DNA区域的核苷酸分子式为Y152K161Y173C 215R221G245G294C299 C426Y431R440R462Y527A551R557 ; 所述紫薇品种'建民粉'的所述DNA区域的核苷酸分子式为C152G161C173C 215G221G245G294C299 C426C431G440A462C527A551G557 ; 所述紫薇品种'多花紫云'的所述DNA区域的核苷酸分子式为C152K161Y173C 215G221G245G294C 299^426^431^440-^462^527-^551^557 ； 其中，Μ表示A和C ;K表示G和T ;Y表示T和C ;R表示A和G ;W表示A和T。
【文档编号】C12Q1/68GK104195243SQ201410418156
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月22日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】索志立, 黄建民, 黄磊, 侯伯鑫, 林道银 申请人:中国科学院植物研究所, 湖南省紫薇花木研究所