新的半乳凝素9突变体蛋白质及其用途

新的半乳凝素9 突变体蛋白质及其用途
【专利摘要】以大肠杆菌作为宿主生产的重组体半乳凝素9表明通过对肿瘤细胞的直接作用(诱导肿瘤细胞的细胞间粘附与凋亡的活性)和借助于免疫系的作用，具有抑制癌的转移和诱导萎缩，而且对非活化淋巴细胞没有作用，诱导活化T细胞、特别是成为过剩免疫反应原因的CD4阳性T细胞的凋亡，以及对与风湿病中关节的变形等有关的滑膜细胞具有很强的诱导凋亡能力，重组体半乳凝素9由于连接两个CRD的连接区对蛋白水解酶的敏感性提高，所以非常容易被酶消化，丧失上述活性，为了进一步研究需要更稳定型的分子。通过改变连接半乳凝素9的两个CRD的连接区，可得到避免对上述活性造成恶影响，而且稳定性提高的改变分子。
【专利说明】新的半乳凝素9突变体蛋白质及其用途
[0001] 本申请是申请号200580010446. 1，申请日2005年3月29日同名申请的分案申请。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及到新型半乳凝素9突变体（突变体）蛋白质及其用途。本发明特别涉 及到连接区域被改变的半乳凝素9以及利用该半乳凝素9的生物化学、临床检查、医疗以及 药物应用技术。

【背景技术】
[0003] 特定的糖链和与之结合的蛋白质表现出在哺乳动物的生物体内伴随生理现象以 及进化?成长的现象，以及在各种各样疾病等中起到多种多样作用和功能的证据正在被人 们发现。人们发现在生物体中存在着特异识别带有3 -半乳糖苷结构的糖链的动物凝集 素，作为这样的凝集素类的半乳凝素，目前至少有14种基因被鉴定。半乳凝素家族根据 其结构分为三个亚类、即原型（prototype)、嵌合型（chimera)、以及串联重复型（tandem repeat)、它们在生物体内的功能几乎不清楚。特别是有关具有两个糖链识别结构域的串联 重复型半乳凝素，由于研究的历史短，作为它的靶的生物体内糖链（受体）还不清楚，所以 其功能没有阐明。可是，根据对识别细胞表面的复杂的糖链的蛋白质进行探索发现等的经 过，预想半乳凝素具有与细胞的粘附、细胞间的信息传递、细胞的活化等有关的功能，而引 人注目。另外除了这样的功能之外，预想还具有其它重要的各种各样功能的那样的研究成 果也正在获得。
[0004] 作为串联重复型半乳凝素之一的半乳凝素9在人中，最初是作为霍奇金病患者的 自身抗原（autoantigen)被鉴定的（非专利文献1和2)，人们想像它是否在免疫细胞间的 相互作用中起着重要的作用。小鼠的半乳凝素9可以通过使用以被认为在半乳凝素类的 糖链识别结构域中保守性高的序列为基础设计的简并引物的5' -RACE PCR，从小鼠肾脏的 cDNA文库克隆（非专利文献3)。人们发现用抗原刺激的人T细胞在体内和体外产生作为嗜 酸性细胞趋化因子的ecalectin,而且该ecalectin与目前已知的其它嗜酸性细胞趋化因 子类虽然结构上不同，但也可以归属于半乳凝素家族，具有对带有P -半乳糖苷结构的糖 链的结合亲和性。从来自于人T细胞的白血病细胞株得到的mRNA成功地克隆了 ecalectin， 结果确认ecalectin是半乳凝素9的变异体之一，半乳凝素9与ecalectin是同一物质（非 专利文献4)。
[0005] 作为野生型半乳凝素9,现在已报告了 L型半乳凝素9(galectin_91ong isoform or long type galectin-9:Gal_9L)、M 型半乳凝素 9 (galectin_9medium isoform or medium type galectin-9:Gal_9M)以及 S 型半乳凝素 9(galectin_9short isoform or short type galectin-9:Gal_9S)。无论那一种半乳凝素9都由两个糖链识别部位（糖识 别结构域，carbohydrate recognition domain:CRD)和连接两个部位的连接肽区构成，已 知L型半乳凝素9含有最长的连接肽区，通过该连接肽区，N端结构域（NCRD)和C端结构域 (CCRD)被连接在一起，而S型半乳凝素9含有最短的连接肽区，M型半乳凝素9含有介于两 者之间长度的连接肽区，发现通常存在于比前二者更广的生物体内组织或细胞中。另外在 由人细胞或组织克隆的半乳凝素9基因之间也可以看到表示遗传多态现象的存在的证据。
[0006] 野生型半乳凝素9由二个糖识别部位（CRD)和连接两个部位的连接区构成，以大 肠杆菌作为宿主生产的重组体半乳凝素9表明通过对肿瘤细胞的直接作用（诱导肿瘤细胞 的细胞间粘附和凋亡的活性）和借助于免疫系统的作用，抑制癌转移和诱导萎缩。另外半 乳凝素9不作用于非活化淋巴细胞，而诱导活化T细胞、特别是诱导成为过度免疫反应原因 的⑶4阳性T细胞的凋亡也已阐明。另外也阐明了对与风湿病中关节变形等有关的滑膜细 胞具有很强的诱导凋亡能力。
[0007] 【非专利文献1】3&11；[11，11.6七31.，？1'0。.^1:1.六。3(1.3。;[. USA,92, 11810-11813(1995)
[0008] 【非专利文献 2 】Tureci, 0? et al.，J. Biol. Chem.，272 (10)，6416-6422 (1997)
[0009] 【非专利文献 3 】Wada, J. et al.，J. Biol. Chem.，272 (9)，6078-6086 (1997)
[0010] 【非专利文献 4】Matsumoto，R.et a I . , J . Biol. Chem.，273(27)，16976-16984(1998)


【发明内容】

[0011] 通过利用这样的半乳凝素9的多方面的作用，预期可治疗癌、难治的自身免疫疾 患（包括风湿病）、变态性疾患等。然而重组体半乳凝素9由于连接两个CRD的连接区对蛋 白水解酶敏感性高，非常容易被酶消化，丧失上述活性。
[0012] 本
【发明者】等进行了专心研究，结果通过对一方面保持半乳凝素9具有的糖链识别 活性，一方面对蛋白水解酶表现出更稳定的分子结构进行探索，改变半乳凝素9的连接两 个CRD的连接区，成功地获得了避免对上述那样的活性带来坏影响，稳定性提高的改变分 子，完成了本发明。
[0013] 本发明提供以下内容。
[0014] (1)蛋白质或其盐，其特征是半乳凝素9或与其具有基本上同等活性的蛋白质的 连接肽或其附近的区域被改变。
[0015] (2)上述⑴所述的蛋白质或其盐，其特征是：由在半乳凝素9或基本上具有与半 乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 1 个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，与半乳凝素9比较，至少对于连接肽的分解敏感 性被改变。
[0016] (3)上述（1)或（2)所述的蛋白质或其盐，其特征是：基本上具有与半乳凝素9同 等活性的蛋白质与半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70%以上同源性。
[0017] (4)上述（1)?（3)中任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：（1)具有半乳凝素 9的N末端侧的糖链识别区域（NCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽与（2)具有半 乳凝素9的C末端侧的糖链识别区域（CCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽借助 于⑶在半乳凝素9的连接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1个或1个以上的氨基 酸的氨基酸序列构成的改变连接肽连接。
[0018] (5)上述⑴?⑷任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：（1)具有序列3所示 的氨基酸序列的多肽或与它具有基本上同等活性，且具有与序列3所示的氨基酸序列至少 70%以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代 或添加1?8个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽和（2)具有序列4所示的氨基酸序列的多 肽或与它具有基本上同等活性，且具有与序列4所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的 氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1?21个氨 基酸残基的氨基酸序列的多肽借助于（3)在序列7?9中任一个序列表示的氨基酸序列中 缺失（但是，序列7中的1?32以及1?44的缺失、和序列8中1?12的缺失除外）、取 代或添加1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽连接。
[0019] (6) -种核酸，其特征是具有编码上述（1)?（5)任一项所述的蛋白质的碱基序 列。
[0020] (7)上述（6)所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
[0021] (8)上述（6)或（7)所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
[0022] (9) 一种重组载体，其特征是含有上述￠)?（8)任一项所述的核酸。
[0023] (10)上述（9)所述的重组载体，其特征是除了含有上述（6)?（8)任一项所述的 核酸外，还含有编码标记蛋白质和/或肤的喊基序列。
[0024] (11) -种转化体,其特征是含有上述（6)?⑶任一项所述的核酸或上述（9)或 (10)所述的重组载体。
[0025] (12)上述（11)所述的转化体，其特征是：转化体宿主细胞是原核细胞或真核细 胞。
[0026] (13) -种药物，其特征是：作为有效成分含有从上述（1)?（5)中任一项所述的 蛋白质、上述（6)?（8)中任一项所述的核酸、上述（9)或（10)所述的重组载体和上述（11) 或12所述的转化体中选择的成分。
[0027] (14)上述（13)所述的药物，其特征是免疫调节剂。
[0028] (15)上述（13)所述的药物，其特征是抗肿瘤药。
[0029] (16)上述（15)所述的药物，其特征是抗来自于包含脑肿瘤（多形性恶性胶质瘤 等）、脊髓肿瘤、上颚洞癌、胰液腺癌、齿肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉头 癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肺癌、胸膜肿瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大肠 癌、胆管癌、胆囊癌、胰脏癌、肝癌、肾脏癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢肿瘤、肾上腺癌、 子宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、纤毛上皮瘤、恶性骨肿瘤、软部肉瘤、乳癌、皮 肤癌、恶性黑色素瘤、基底细胞瘤、白血病、伴随骨髓化性的骨髓纤维症、恶性淋巴瘤、恶性 淋巴肉芽肿病、浆细胞瘤、神经胶质瘤等癌和肉瘤的肿瘤的抗肿瘤药。
[0030] (17)上述（13)所述的药物，其特征是该药物是针对下面疾患或疾病、或病的症状 的药物：
[0031] (A)炎症性疾患，来自于在各脏器中发生的各种急性和慢性炎症、变态性和自身免 疫性炎症、感染症等中的疾病；
[0032] (B)急性和慢性疾患，来自于包括支气管炎、支气管肺炎、间质性肺炎、肺炎、细支 气管炎、急性纵隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心内膜炎、心肌炎、口内炎、口角炎、扁桃 炎、咽炎、喉头炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性肠炎、虫垂炎、缺血性大肠炎、 药物性大肠炎、直肠炎在内的肺以外的其它脏器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、 重症肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬变、胆囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性肾 炎、膜性肾炎、丝球体肾炎、IgA肾症、各种膀胱炎、脑髓炎、乳腺炎、皮炎、表层角膜炎、干性 角结膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周围炎在内的炎症等疾病；
[0033] (C)来自于神经性炎症（例如、神经性胃炎、神经性膀胱炎等）、癌或伴随炎症疼痛 的疾病；
[0034] (D)变态性炎症疾患，全身性过敏性、支气管哮喘、过敏性肺炎、花粉症、变态性鼻 炎、变态性结膜炎、免疫复合体引起的变态性疾患、血管神经性浮肿等在内的疾病；
[0035] (E)自身免疫性的炎症（自身免疫疾患），来自于全身性（慢性关节风湿病、全身 性红斑狼疮、结节性多发性动脉炎、强皮症、多发性肌炎?皮肤肌炎、肖格伦综合征（Sjogren syndrome)、贝切特病（Behcet' s syndrome)等）、神经系（多发性硬化症、重症肌无力症、 HAM(HTLV-1脊髓症）、肌萎缩性侧索硬化症等）、内分泌性（巴泽多病、桥本病、1型糖尿病 等）、血液（特发性血小板减少性紫斑病、自身免疫性溶血性贫血、再生不良性贫血等）、呼 吸器（结节病、肺纤维症等）、消化管（溃疡性大肠炎、克罗恩病等）、肝脏（自身免疫性肝 炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胆管炎等）、肾?尿路系（抗嗜 中性白细胞细胞质抗体相关肾炎、血管炎、肺肾综合征（Goodpasture)、抗丝球体基底膜抗 体病等）等疾病；
[0036] (F)感染症，由于病原体伤害生物体的细胞?组织?脏器产生的疾患、或起因于给 人带来感染症的病原体的疾患，病原体来自于1)细菌（包括螺旋体、衣原体、立克次体）、2) 病毒、3)真菌、4)植物（藻类）、5)原虫、6)寄生虫（吸虫、条虫、线虫）、7)节足动物，包括 细菌性感染症（霍乱、瘟疫、大肠杆菌感染症等）、螺旋体感染症（钩端螺旋体病等）、衣原 体感染症（鹦鹉病等）、立克次体感染症（斑疹伤寒、破伤风等）、病毒性感染症（带状疱疹、 病毒性出血热、狂犬病等）、真菌症（念珠菌病、隐球菌病、曲霉菌病等）、原虫性疾患（阿米 巴性痢疾、疟疾、弓形体病等）、寄生虫（吸虫症、线虫症等）、此外还包括支原体感染症（支 原体肺炎等）、分支杆菌感染症（结核、非定型抗酸菌症等）疾病；
[0037] (G)皮肤科领域的疾患，i)皮肤感染症、包括变态性炎症和自身免疫性炎症等在 内的皮炎症，干癣、水疱症、脓疱症、角化、角化异常症等具有特有炎症的皮肤疾患、ii)来自 于由于美容皮肤科相关的损伤或老化，与a)黑色素代谢调节（美白）、b)毛发成长（生发） 的调节、c)胶原产生调节有关的皮肤科领域的疾患（包括老化）；
[0038] (H)生活习惯病，来自于包括高脂血症、动脉硬化症、高血压、糖尿病等在内的疾 病；
[0039] (I)有关正常细菌丛的维持的异常；
[0040] (J)来自于包括淀粉样变性、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨折等在内的疾病；
[0041] (K)脑、神经领域中的炎症反应，例如伴随着脑梗塞、心肌梗塞等缺血性病变的进 展出现的炎症、综合失调症；
[0042] (L)痛风；
[0043] (M)骨质疏松症；或
[0044] (N)间质性肺炎。
[0045] (18)分析或检查试剂，特征是作为有效成分含有选自于上述（1)?（5)中任一项 所述的蛋白质、上述（6)?（8)中任一项所述的核酸、上述（9)或（10)所述的重组载体以 及上述（11)或（12)所述的转化体的成分。
[0046] 发明的效果
[0047] 就半乳凝素 9得到的半乳凝素 9突变体由于与野生型比较对蛋白水解酶稳定，可 在半乳凝素9具有的生物体内功能的阐明中利用，可在对半乳凝素9在肿瘤化细胞的调控、 免疫调节、以及变态性和炎症的控制等各种各样的生物体反应的调控?调节中起到的功 能?活性进行的研究中使用。另外，该半乳凝素9突变体及其相关物质有望用作临床应用、 分子生物学应用、生物化学应用、医学应用中的试药和活性剂。
[0048] 本发明的另外的目的、特征、优点以及其它观点通过以下叙述同行人就都明白了。 然而，包括以下的记载以及具体的实施例等记载在内的本件说明书的记载是表示本发明的 理想方式，希望理解为只是为了说明给出的。在本说明书公布的本发明的意图以及范围内 进行的各种变化和/或改变（或修饰）通过以下记载以及本说明书的其它部分的知识对于 业内人士容易明白。本说明书中引用的所有专利文献和参考文献是为了说明的目的引用， 这些文献作为本说明书的一部分，其内容应当解释为包括在说明书中。

【专利附图】

【附图说明】
[0049] 图1表示半乳凝素9突变体（G9NC(null))表达载体的构建方法。
[0050] 图2表示半乳凝素9突变体（G9NC(null))表达物以及纯化处理物的电泳照片。
[0051] 图3表示比较野生型半乳凝素9(G9(M))和半乳凝素9突变体（G9NC(null))之间 对蛋白水解酶的耐性的结果。对于纯化标准品，存在的大肠杆菌蛋白水解酶的耐性进行了 研究。图表示电泳照片。
[0052] 图4表示比较野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突变体（G9NC(null))之间 对蛋白水解酶的耐性的结果。研究了对基质金属蛋白水解酶-3 (MMP-3)的耐性。图表示电 泳照片。
[0053] 图5表示比较野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突变体（G9NC(null))之间 对蛋白水解酶的耐性的结果。研究了对弹性蛋白酶（弹性蛋白酶）的耐性。图表示电泳照 片。
[0054] 图6表示在野生型半乳凝素9 (G9 (S))和半乳凝素9突变体（G9NC (null))之间对 生物活性进行比较的结果。研究了对M0LT-4细胞的凋亡诱导活性（DNA梯形成）。图表示 电泳照片。
[0055] 图7表示在野生型半乳凝素9 (G9 (S))和半乳凝素9突变体（G9NC (null))之间对 生物活性进行比较的结果。研究了对外周血嗜酸细胞的ECA活性。
[0056] 图8表示对半乳凝素9EST克隆进行BLAST序列检索，对来自不同源的各克隆 序列进行比较的结果。通过检索，各克隆表现出97 - 99%的同源性（同一性）。在 5, 88, 135, 238, 281位置表现出变异。
[0057] 图9表示酵母多糖诱发胸膜炎，但就单独半乳凝素9突变体（h_gal9NC(null))来 说，不诱发炎症。
[0058] 图10表示对半乳凝素9突变体（h_gal9NC(null))在酵母多糖诱导胸膜炎模型中 的效果进行研究的结果。
[0059] 图11表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))在PM诱导皮炎（类固醇 敏感性模型）中的效果进行研究的结果。
[0060] 图12表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))在花生四烯酸诱导皮炎 (类固醇非敏感性模型）中的效果进行研究的结果。
[0061] 图13表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))在辣椒辣素诱导皮炎模型 中的效果进行研究的结果。
[0062] 图14表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))在DNFB诱导接触皮炎模 型中的效果进行研究的结果。
[0063] 图15表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))在DNFB诱导接触皮炎模 型中的效果进行研究的结果。
[0064] 图16表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))在FITC诱导特应性皮炎 模型中的效果进行研究的结果。
[0065] 图17表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))对于荨麻疹模型的效果进 行研究的结果。
[0066] 图18表示对半乳凝素9突变体（Gal-9 = G9NC(null))对于荨麻疹模型的效果进 行研究的结果。
[0067] 图19表示对半乳凝素9突变体（h_gal9NC(null))对于关节炎模型的效果进行研 究的结果。
[0068] 图20表示半乳凝素 9突变体在皮下移植模型中的抑制肿瘤细胞增殖效果、即表示 抗肿瘤活性（抗癌效果）测定的结果。上段为对照组，下段为半乳凝素9突变体注入组（直 至5周什么样的肿瘤都没可见）。
[0069] 图21是半乳凝素9突变体在皮下移植模型中的抑制肿瘤细胞增殖效果、即表示抗 肿瘤活性（抗癌效果）测定的结果，给出了组织病理解析的组织照片。表示给予LLC+半乳 凝素9突变体（Gal9)(下段）时5周的皮肤。肉眼看为白色调。
[0070] 图22表示半乳凝素9突变体（稳定化半乳凝素9)在培养肿瘤细胞（Meth A细 胞，24h)中诱导凋亡（细胞损伤活性）的结果。
[0071] 图23表示半乳凝素9突变体（稳定化半乳凝素9)在培养肿瘤细胞（B16/F10细 胞，24h)中诱导凋亡（细胞损伤活性）的结果。
[0072] 图24是动物的存活曲线，表示在由Meth A细胞引起的癌性腹膜炎模型中，半乳凝 素9突变体具有抗肿瘤效果。
[0073] 图25表示在由Meth A细胞引起的癌性腹膜炎模型中，未给予半乳凝素9突变体 (Gal9)组（上段）给予组（下段）中小鼠的状态的照片。
[0074] 图26为动物的生存曲线，表示在由B16/F10细胞引起的癌性腹膜炎模型中半乳凝 素9突变体具有抗肿瘤效果。
[0075] 图27对比半乳凝素9突变体（Gal-9)给予组i非给予组中由B16/F10细胞（黑 素瘤）引起的癌性腹膜炎模型小鼠的状态，内脏组织（第14天）的照片。
[0076] 图28表示研究半乳凝素9突变体（稳定化半乳凝素9)影响免疫细胞的结果。是 B16/F10腹腔内浸润细胞（24h)的解析结果。
[0077] 图29表示使用半乳凝素9突变体（稳定化半乳凝素9)进行的抑制粘附实验的结 果。是B16/F10细胞（Ih)的解析结果。图中、Collagen type I表示I型胶原、Collagen type IV表示IV型胶原、Laminin表示层粘连蛋白、Fibronectin表示纤连蛋白、Vitronectin表 示玻连蛋白。
[0078] 图30表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在壁虱抗原诱发哮喘 模型中的作用效果进行测定的结果。
[0079] 图31表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在壁虱抗原诱发哮喘 模型中的作用效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。
[0080] 图32表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)在壁虱抗原诱发哮喘模型中的作用效果 进行测定的结果（支气管周围组织的照片）。
[0081] 图33表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在OVA诱发哮喘模型 (小鼠）中的作用效果进行测定的结果。
[0082] 图34表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在OVA诱发哮喘模型 (小鼠）中的作用效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。
[0083] 图35表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)影响OVA诱发哮喘模型（豚鼠）中的即 时型哮喘（IAR) ?延迟型哮喘（LAR)的作用。
[0084] 图36表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)在OVA诱发哮喘模型（豚鼠）中的作用 效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。。
[0085] 图37表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)在自身免疫性溶血性贫血模型（小鼠） 中的作用效果进行测定的结果（血细胞比容（％ ))。
[0086] 图38表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在阿蒂斯（Arthus) 反应（血管炎）模型（小鼠）中的作用效果进行测定的结果。
[0087] 图39表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在ARDS模型（小鼠） 中的作用效果进行测定的结果。
[0088] 图40表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)和地塞米松（Dex.)在ARDS模型（小鼠） 中的作用效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。
[0089] 图41表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)在辣椒辣素诱导炎症模型中的作用效果 进行测定的结果。
[0090] 图42表示对半乳凝素9突变体（Gal-9)影响破骨细胞形成的效果进行试验的结 果。表明有抑制效果。
[0091] 图43表示对通过半乳凝素9突变体（gal-9)刺激产生的单细胞的凋亡诱导 (M-CSF存在下）进行试验的结果。
[0092] 图44表示对通过半乳凝素9突变体（gal-9)刺激对人成骨细胞增殖影响的效果 进行试验的结果。
[0093] 图45表示对通过半乳凝素9突变体（Galectin-9)刺激（8hr)影响人成骨细胞分 化标志的表达的效果进行试验的结果。
[0094] 图46表示存活率，对半乳凝素9突变体对间质性肺炎模型的作用进行试验的结 果。
[0095] 图47表示对半乳凝素9突变体对间质性肺炎模型的作用进行试验的结果。给出 了存活14天例的肺组织（HE染色、照片）。
[0096] 图48是动物的生存曲线，表示在LLC细胞（凋亡（+))导致的癌性腹膜炎模型中， 半乳凝素9突变体具有抗肿瘤效果。
[0097] 图49表示使用B16/F10细胞，研究半乳凝素9突变体对癌转移模型的作用的结果 (模型动物的肺外观）。
[0098] 图50表示使用B16/F10细胞，研究半乳凝素9突变体（G9NC(null))对癌转移模 型的作用的结果（对肺的结节数进行计数的结果）。
[0099] 图51表示对半乳凝素9突变体（gal-9)(静脉内（i. V.)注射）在角叉菜胶诱发 炎症模型中的作用效果进行测定的结果。
[0100] 图52为了比较给出了对作为阳性对照的地塞米松（Dex.)在角叉菜胶诱发炎症模 型中的作用效果进行测定的结果。
[0101] 图53表示使用免疫组织染色对半乳凝素在风湿病（RA)关节滑膜中的表达进行研 究的结果。
[0102] 图54表示对半乳凝素对风湿病（RA)滑膜细胞凋亡的诱导活性进行研究的光学显 微镜观察的结果。
[0103] 图55表示用PI法对半乳凝素对风湿病（RA)滑膜细胞凋亡的诱导活性进行研究 的结果。
[0104] 图56表示对半乳凝素对风湿病（RA)滑膜细胞凋亡的诱导活性进行研究的结果。
[0105] 图57表示对半乳凝素对风湿病（RA)滑膜细胞增殖的抑制活性进行研究的结果。
[0106] 图58表示对半乳凝素-9突变体在佐剂性关节炎模型中的作用（抑制由于机械刺 激引起的疼痛）进行研究的结果。
[0107] 图59为了比较给出了在佐剂性关节炎模型中的作用（抑制由于机械刺激引起的 疼痛）进行研究的结果（作为阳性对照的吲哚美辛的作用）。
[0108] 图60表示对半乳凝素 -9突变体在角叉菜胶诱发急性炎症模型中的作用（抑制机 械刺激产生的疼痛）进行研究的结果。
[0109] 图61为了比较给出了在角叉菜胶诱发急性炎症模型中的作用（抑制由于机械刺 激引起的疼痛）进行研究的结果（作为阳性对照的地塞米松的作用）。
[0110] 图62表示对半乳凝素-9突变体在人关节液中的稳定性进行研究的结果 (SDS-PAGE)。
[0111] 图63表示对半乳凝素-9突变体（稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型（抗体混合 物引起的模型）中的作用进行研究的结果（i.v.注入）。
[0112] 图64表示半乳凝素-9突变体（稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型（胶原关节炎 模型）中的作用进行研究的结果（i.P.注入）。
[0113] 图65表示半乳凝素-9突变体（稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型（胶原关节炎 模型）中的作用进行研究的结果（i.v.注入）。
[0114] 图66表示半乳凝素-9突变体（稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型中的作用进行 研究的结果（i.v.注入）。
[0115] 图67为了比较给出了对在佐剂性关节炎模型中的作用进行研究的结果（阳性对 照的吲哚美辛的作用）。
[0116] 图68表示对半乳凝素-9突变体在大鼠CIA(胶原致敏）模型中的作用进行研究 的结果（i.v.注入）。

【具体实施方式】
[0117] 参考到目前为止公开发表的研究和相关的专利申请，其内容都包括在本说明书的 内容中。
[0118] 所谓「半乳凝素9突变体」指的是提供对半乳凝素9的糖链识别部位含有的特定 糖链特异结合的活性或与此类似的活性（本活性中包括定性的活性和/或定量的活性）的 物质。半乳凝素9对特定细胞具有凋亡诱导活性，而本半乳凝素9突变体可以是具有野生 型半乳凝素9具有的凋亡诱导活性或具有与它类似的活性的突变体，也可以是半乳凝素9 具有的生物活性被改变或修饰的突变体，对于某些场合更理想。所谓本发明中特别理想的 半乳凝素9突变体指的是作为具有生物活性的试药，在临床检查领域、分析领域、或医学或 药物等领域中，表现出比野生型半乳凝素9更好的性质。
[0119] 半乳凝素9突变体，例如可以是半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性 的蛋白质的连接肽或其附近区域被改变的蛋白质或其盐、由在半乳凝素9或基本上具有与 半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域的氨基酸序列中缺失、取代或添加1 个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，与半乳凝素9比较，实施了至少对于连接肽的分 解敏感性被改变的改变的蛋白质或其盐、可以是基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白 质，而且与半乳凝素9的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源 性、或至少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至 少95%以上的同源性的蛋白质或其盐、也可以是（1)半乳凝素9的N末端侧的糖链识别领 域（NCRD)或与其具有基本上同等活性的多肽与（2)具有半乳凝素9的C末端侧的糖链识 别区域（CCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽借助于（3)半在乳凝集素9的连接 肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变 连接肽连接的蛋白质或其盐等。
[0120] 可是，半乳凝素 9 是在 J. Biol. Chem.，272(10) :pp. 6416-6422(1997)报告中在由 恶性淋巴肉芽肿病患者的脾脏制备的cDNA中发现了新的半乳凝素，将该半乳凝素取名为 半乳凝素9,同时为了避开恶性淋巴肉芽肿病肿瘤中的序列变异，通过正常人的外周血调 制的cDNA进行了序列的再确认，最终决定了半乳凝素9的序列，该序列表示在该文献的第 6418 页的 FIG. 1。另外关于半乳凝素 9 进一步在 J. Biol. Chem.，273 (27) : pp. 16976-16984 (1998)中报道了从由生产嗜酸性细胞趋化因子的T细胞株、ST0-2制备的cDNA分离了趋化 因子Ecalectin(ecalectin)，该因子虽然与先前报告的上述半乳凝素9的同源性高，可是 在氨基酸序列位置中看到第5, 88, 135, 238, 281位的氨基酸不同，ecalectin序列记载在该 文献的第16983页的Fig. 8,而且进一步推测ecalectin为半乳凝素9的变异体。
[0121] 另外在 J. Biol. Chem.，275(12) :pp. 8355-8360(2000)中报道 了从由 Jurkat T-cell制备的cDNA分离半乳凝素9,制作重组（重组）蛋白质，由于该半乳凝素9重组蛋 白质表现出嗜酸性细胞趋化活性，所以平島等人决定将带有来自于Jurkat T-cell的序列 的半乳凝素9在今后研究中使用，其中在氨基酸序列位置中的第5, 88, 135,238,281位的 氨基酸分别适用 Gly, Lys, Ser, Pro, Glu,上述的松本等人（J. Biol. Chem.，273 (27) :pp. 16 976-16984(1998))报告的ecalectin虽然第5位的氨基酸在Ser和Gly这一点上不同， 但在嗜酸性细胞趋化活性上没有差异，另外，即使对17个登录在EST数据库的半乳凝素 9的序列（包括部分序列）进行查询，认为对于第5, 88, 135, 238, 281位的氨基酸分别适 用Gly, Lys, Ser, Pro, Glu妥当，半乳凝素9的变异被记载在该文献的第8359页的Table 11(参照图8)。图8中，617(6)，1^8〇()，561'(5)，？1' 〇(?)，6111?)。
[0122] 在 J. Biol. Chem.，272(9) :pp. 6078-6086(1997)(非专利文献 3)中根据氨基酸序 列的类似性决定了 2个糖识别部位（CRD)和连接它们的连接区的26个氨基酸（对于半乳凝 素9M型）（参照同文献的Fig. 1)。即从序列5所示的氨基酸序列看，确定C端侧的糖链识别 域（CCRD)从Met175开始。然后基于此结果，人半乳凝素9的CRD和连接区被登录在NCBI数 据库的Accession Number NP_033665。另外在 J. Biol. Chem.，273(5) :pp. 2954-2960(1998) 中给出了半乳凝素4和6的报告，其中与CRD的连接区的设定根据氨基酸序列、基因序列决 定，这些序列如同文献的第2956页的Fig. 2所示，但在将该设定反映在半乳凝素9中时，所 谓前者（J. Biol. Chem.，272(9) :pp. 6079-6086(1997))的设定在连接区和C端侧的CRD中 是不同的。即从序列5所示的氨基酸序列看，CCRD应当从Phe 195开始。
[0123] 本
【发明者】等研究组根据非专利文献3中的设定在将由外显子形成的剪接边界存 在于象处于Gln 148-Pro149间、Ile16tl-Thr161间、Ser 177-Thr178间那样的3个氨基酸区间C端侧 考虑在内的同时，将有关C端侧CRD的结合糖能力的研究，即在序列5所不的氣基酸序列看 至IJ，使从Thr 178开始的全长CCRD表达时有结合乳糖能力，即使再削除6个氨基酸（从序列 Met184开始的CCRD片段）、削除12氨基酸（从Ala 19tl开始的CCRD片段），仍有结合乳糖能 力，如果消除22氨基酸（从Leu2tltl开始的CCRD片段），由于不能在大肠杆菌中表达，从序列 5所示的氨基酸序列看，能够考察到CCRD从Phe 195开始的设定更严谨也一并考虑在内，作 为C端侧的CRD定为序列5所示的氨基酸序列Thr178?Thr 323的序列。有关半乳凝素9的 N端侧CRD (NCRD)，在序列5所示的氨基酸序列看到，使直至Gln148的全长NCRD表达时有结 合乳糖能力，如果消除9个氨基酸（序列Met 1?Ser139的NCRD片段），虽然蛋白质能表达， 但由于结合乳糖能力消失，所以作为N端侧的CRD定为序列5所示氨基酸序列中的Met 1? Gln148 序列。
[0124] 在理想的方式中，半乳凝素9突变体是例如（1)具有在作为半乳凝素9的NCRD如 序列2所示的氨基酸序列或其序列中缺失、取代或添加1个或1个以上的氨基酸的序列、或 对序列2所示的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源性、或至 少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至少95% 以上的同源性的氨基酸序列，而且具有结合乳糖能力的突变体、（2)具有作为半乳凝素9的 CCRD入序列3所示的氨基酸序列或在序列中缺失、取代或添加1个或1个以上氨基酸的突 变体、或对序列3所示的氨基酸序列具有至少70%以上的同源性、或至少75%以上的同源 性、或至少80%以上的同源性、或至少85%以上的同源性、或至少90%以上的同源性、或至 少95%以上的同源性的氨基酸序列，且具有结合乳糖能力的突变体、（3)具有作为结合上 述（1)和（2)的连接区如序列9所示的氨基酸序列或在该序列中缺失、取代或添加1个或1 个以上氨基酸的突变体、优选对于基质金属蛋白水解酶等蛋白质分解酶比天然的半乳凝素 9稳定的突变体。作为该连接区（3)，包括序列9所示的氨基酸序列中的氨基酸残基缺失1 个以上（例如、1?2个、优选3?4个、更优选5?6个、更优选7?8个、特别优选1? 9个等）的缺失类似体、该氨基酸残基的1个以上（例如、1?9个、优选1?8个、更优选 1?6个、更优选1?4个、特别优选1?2个等）被其它残基置换的置换类似体、附加1个 以上（例如、1?60个、优选1?40个、更优选1?20个、更优选1?10个、特别优选1? 5个等）的氨基酸残基（但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸 序列后的部分表示的序列除外）的付加类似体。作为代表性的该连接区（3)，如序列9所 示的氨基酸序列被HM，RIP，或任意的2氨基酸序列置换的连接区等。氨基酸的置换、缺失、 或插入可以是不使多肽的生理特性或化学特性发生大变化的改变，有时可以给出理想的变 化。作为该氨基酸序列中的氨基酸的置换体，可以从该氨基酸所属的类中的其它氨基酸类 选择。例如、作为非极性（疏水性）氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨 酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等、作为极性（中性）氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，作为带有正电荷的氨基酸（碱性氨基酸），如精氨酸、赖 氨酸、组氨酸等，作为带有负电荷的氨基酸（酸性氨基酸），如天冬氨酸、谷氨酸等。
[0125] 而作为该连接区（3)，如对序列7或8所示的氨基酸序列除去序列9所示的氨基 酸序列部分，用HM，RIP，或任意的2氨基酸序列置换的序列，在序列7或8所示的氨基酸 序列中除去序列9所示氨基酸序列部分，剩下其中的6氨基酸，将其它的残基削除后的序列 等。另外作为该连接区（3)，也包括序列7或8所示的氨基酸序列中的氨基酸残基（但是， 除去例如序列9所示的氨基酸序列部分，或序列7的场合可以除去序列8所示的氨基酸序 列部分）缺失1个以上（例如1?5个、优选3?10个、更优选5?15个、更优选7?20 个、特别优选1?32个等）的缺失类似体、1个以上的该氨基酸残基（例如1?9个、优选 1?8个、更优选1?6个、更优选1?4个、特别优选1?2个等）被其它残基置换的置换 类似体、附加1个以上（例如1?60个、优选1?40个、更优选1?20个、更优选1?10 个、特别优选1?5个等）的氨基酸残基（但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序 列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外）的付加类似体。
[0126] 如果能维持作为天然的人半乳凝素9蛋白质的特征的结构域结构或糖结合能力， 上述那样的变异体都包含在本发明中。另外认为本发明的肽或多肽也可以包含具有与天然 人半乳凝素9蛋白质基本上同等的一级结构构象或其一部分肽或多肽，而且还可以包含具 有与天然的基本上同等生物学活性的肽或多肽。还可以是天然产生的一种变异体。本发明 的来自人的蛋白质（或肽或多肽）例如与选自WO 02/37114 Al的序列表中SEQ ID NO: 1? 3的氨基酸序列有60%、由于场合不同，可以具有70%更高的同源性蛋白质，更优选具有 80 %或90 %以上的相同氨基酸序列的蛋白质。所谓本发明的来自人的蛋白质的一部分是来 自该人的蛋白质的一部分的肽（即该蛋白质的部分肽），只要是与本发明的半乳凝素9蛋 白质具有基本上同等活性的蛋白质，可以为任一种蛋白质。例如、该本发明的蛋白质的部 分肽具有该人半乳凝素9的构成氨基酸序列中至少5个以上、优选20个以上、更优选50个 以上、更优选70个以上、最好优选100个以上、有时200个以上氨基酸残基的氨基酸序列的 肽，最好是这些肽是对应于连续的氨基酸残基的肽，或例如就相对于该WO 02/37114 Al 的序列表SEQ ID N0:1?3中任一项表示的氨基酸序列中对应的区域的同源性来说，具有 与上述同样的同源性的肽。
[0127] 在本说明书中所谓「基本上同等」指的是蛋白质的活性、例如、所定的伤害细胞活 性、诱发凋亡活性、抗炎症活性、抗变态性活性、免疫调节活性、糖链结合活性、生理活性、生 物学活性基本上相同。另外该用语的意思中可以包括具有基本上同质的活性的场合，作为 基本上同质的活性，如结合活性、伤害细胞活性、诱发凋亡活性等。所谓基本上同质的活 性表示它们的活性从性质上讲是同质，例如在生理上、药理学上、或生物学上同质。例如、 结合活性、伤害细胞活性、诱发凋亡活性等活性虽然最好是同等（例如、约0. OOl?约1000 倍、优选约0. 01?约100倍、更优选约0. 1?约20倍、更优选约0. 5?约2倍），但这些活 性的程度、蛋白质的分子量等量的要素也可以不同。
[0128] 所谓「半乳凝素9突变体多肽」包括野生型半乳凝素9的天然序列的突变体、其 衍生物、类似体（类似物）、片段、嵌合体、以及变异体。该多肽包括意图能够在宿主细胞表 达，且通过设计成能够编码特定的半乳凝素9突变体多肽的重组产生的聚核苷酸序列编码 的多肽。
[0129] 所谓「半乳凝素9突变体治疗剂」指的是来自编码半乳凝素9突变体的聚核苷酸 (半乳凝素9突变体聚核苷酸）或半乳凝素9突变体多肽序列的分子、包含这样的半乳凝素 9突变体的聚核苷酸或多肽的突变体、变异体、类似体、嵌合体、片段等中的至少一个。所谓 作为聚核苷酸的半乳凝素9突变体治疗剂，一般来说是编码半乳凝素9突变体多肽的序列， 而且包括在宿主细胞中通过重组技术可表达的。另外，半乳凝素9突变体治疗剂可以是半 乳凝素9活性的激动剂。其它的半乳凝素9突变体治疗剂，可以包括供给半乳凝素9突变 体的治疗剂，具有半乳凝素9突变体有的活性，而且产生对与半乳凝素9活性缺乏或不足有 关的疾患?疾病?异常症状有予防和/或治疗效果的半乳凝素9活性的调节剂。作为半乳 凝素9活性的调节剂，例如聚核苷酸、多肽、或低分子。
[0130] 本说明书中使用的用语「诊断剂」指的是在本发明的诊断使用一种或一种以上的 对该诊断行为有用的那样的任意药剂。这些药剂在诊断中的使用可以包括用于决定半乳凝 素9产生细胞的存在的方法或用于决定提示半乳凝素9结合性物质的细胞的存在的方法的 使用。作为诊断剂，例如含有选自编码半乳凝素9突变体突变蛋白质的DNA、稳定化半乳凝 素9突变体突变蛋白质、以及含有该稳定化半乳凝素9突变体突变蛋白质的细胞或细胞匀 浆液中的成分。
[0131] 本说明书中使用的用语「治疗剂」可以是在本发明的治疗中使用的一种或一种以 上的达到或对达到其治疗行为有用的任意药剂。例如、治疗剂是被设计为能够表达半乳凝 素9突变体多肽的聚核苷酸，该药剂是在给予哺乳动物后，然后能够在细胞中表达的聚核 苷酸。此时药剂的活性形式是被表达的多肽。
[0132] 半乳凝素9突变体治疗剂是具有半乳凝素9突变体生物活性的治疗剂、或比天然 的半乳凝素9突变体更长，对特定糖链具有结合的活性的多肽、编码对基质金属蛋白水解 酶等蛋白质分解酶比天然的半乳凝素9更稳定的半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸那样的 来自半乳凝素9突变体的治疗剂。该治疗剂单独、或与其它药剂（例如、与半乳凝素9突变 体的给予一起使用的，且对特定的肿瘤或自身免疫等的在其它众所周知的治疗法中使用的 那样药物、或在哺乳动物中容易进行半乳凝素9突变体的表达那样的基因递送载体等）配 合达到其治疗目的。例如、该治疗剂可以是包括为其它目的开发的半乳凝素9突变体治疗 齐U，以及半乳凝素9的激动剂、对半乳凝素9活性进行修饰或调节的药物，例如有机低分子 化合物或物质、肽、肽样化合物或物质、编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸、半乳凝素9 突变体多肽、表达对蛋白水解酶比天然的半乳凝素9更稳定的半乳凝素9突变体的嵌合体 或变异体等，且被转化的细胞。
[0133] 本说明书中所谓的「配合治疗剂」指的是一起给予时，产生它们各自效果的含有几 个成分或几个药剂的治疗组成物，配合治疗剂也指为了治疗疾患等一起给予时产生相乗效 果那样的制剂。最好是通过配合治疗剂中的几个成分或几个药剂的各自作用得到的其它 各种作用效果，为了能够获得更大的治疗效果、例如肿瘤的消失或正常化、从自身免疫疾患 回复和获得长期生存，可以使这些成分组合。作为给予配合治疗剂后得到的效果的例子，如 在短期的症状回复和长期给予后得到的症状的回复的组合，或使对患者中的特定型的各个 细胞的自身免疫应答减少那样的效果的组合。作为本发明的配合治疗剂的例子，如用于给 予含有编码半乳凝素9突变体的聚核苷酸与编码IFN类，IL-2等细胞因子类中的至少一个 的聚核苷酸的基因递送载体的配合治疗剂等。其它的例子也可以使用2个基因递送载体， 例如、一个表达半乳凝素9突变体，另一个用于表达细胞因子类中至少一个。另外，为了预 测给予半乳凝素9突变体在靶细胞中诱导凋亡，进行正调节，也可以给予表达IFN类，IL-2 等、或IFN-y等的基因递送载体。各种治疗剂也可以同时供给，例如、为了提1?治疗效率， 根据需要，可以重复给予各个药剂中的1个或全部，也可以加入到同一药学上容许的载体 中给予。
[0134] 「基因递送载体」指的是能够使用于多肽在细胞中表达的编码序列递送给细胞变 得容易进行那样的成分。该细胞为了能够适于体内基因治疗也可以存在于哺乳动物的体 内，为了能够适于体外基因治疗进行转染处理，也可以暂时从哺乳动物中取出，使得多肽表 达后再返回到哺乳动物。基因递送载体可以是能够完成向细胞递送基因那样的任意成分或 载体，例如、可以是脂质体、粒子、载体等。作为基因递送载体，重组载体（例如、重组病毒载 体）、核酸载体（例如、质粒）、裸核酸分子（例如、基因）、和作为中和核酸分子上的负电荷， 且将核酸分子折叠的分子能够凝集那样的多阳离子分子复合体化的核酸分子、与脂质体结 合的核酸（美国专利第5, 166, 320号说明书；第5, 547, 932号说明书；Wang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，84:7851，1987)等。该基因递送载体可以包括象生产细胞那样的特定 的真核生物细胞，这些载体是能够向宿主细胞递送具有生物学的1个以上所期望的特性的 核酸分子的载体。所期望的特性就像以下议论的那样，例如、可以包括表达蛋白质、酶、或抗 体等那样的所期望物质的能力和/或提供生物学活性的能力。即、通过基因递送载体转运 的核酸分子不需要表达所期望的物质，其本身就是活性的药剂。这样的生物学活性的一个 例子是可在基因治疗中看到的例子。就基因治疗来说，是对某种基因进行钝化，阻断该基因 指示的产物的生产，整合到被递送的核酸分子能够特异表达的基因中。基因递送载体指的 是为了使得1个或多个目的序列或基因表达能够进行指示的集合体（组件）。
[0135] 基因递送载体一般来说包含启动子成份，而且可以包含指示多聚腺苷化的信号。 另外，基因递送载体还可以与在转录时能够运作那样与1个或多个目的序列或基因连接， 含有作为翻译起始序列起作用的序列。另外基因递送载体还可以含有Neo、SV 2Neo、TK、潮 霉素、博莱霉素（腐草霉素）、螺旋霉素、组氨醇、DHFR等那样可选择标志、1个以上的制限 酶部位和翻译终止序列。在本发明中能够使用的场合，基因递送载体可以包括病毒载体 (Jolly, Cancer Gen. Therapy, 1:51-64, 1994)、核酸载体、裸DNA、脂质体DNA、粘粒、细菌、特 定的真核生物细胞（包含生产细胞；参照美国专利第6, 333, 195号说明书）那样的重组载 体。
[0136] 所谓「生物学的活性」在表示保持特异活性的分子场合下使用。例如、具有生物活 性的半乳凝素9突变体多肽对含有半乳凝素9的糖链识别部位的特定糖链特异结合的活性 或与它具有基本上同等性质的活性，且对基质金属蛋白水解酶等蛋白质分解酶比天然的半 乳凝素9定性和/或定量保持稳定的能力，例如表现出对导致半乳凝素9含有的抗肿瘤活 性或凋亡的凋亡途径进行活化的活性。
[0137] 本说明书中使用的用语「核酸分子」或「聚核苷酸」指的是编码特定氨基酸序列或 编码其互补链的RNA或DNA、以及DNA = RNA杂交体等分子。本说明书中使用的「编码序列」 指的是编码特定氨基酸序列或编码其互补链的RNA或DNA、以及DNA: RNA杂交体等中的任一 种。聚核苷酸例如可以包括反义寡核苷酸、或核酶，另外也可以包括基因的3'或5'非翻译 区那样的序列、基因的内含子、不构成基因的编码区域的基因的其它区域。DNA或RNA可以 是单链或双链。在合成核酸或合成聚核苷酸中，也包括含有化学合成核酸序列的序列，以及 为了赋予分子对变性的抵抗性预先从化学上进行的部分改变。聚核苷酸可以通过例如聚合 酶链式反应（PCR)扩增、使用互补的DNA或RNA的重组表达等制造，或通过化学合成生成。
[0138] 本说明书中用语「表达调控序列」或「调节序列」指的是包括影响编码多肽的基因 的表达，包括影响用于转录和翻译的信号表达的那样一个或一个以上的成分，且在该领域 可使用的序列。适于本发明的多肽表达的表达调控序列因可表达多肽的宿主系不同而有所 不同。
[0139] 作为本发明的「多肽」，只要是包含半乳凝素9突变体多肽，可以是任何多肽，如 含有成熟蛋白质的半乳凝素9突变体蛋白质的任意部分，以及其缩短型、突变体、对立基因 体、类似物、衍生物等。作为突变体，可以是由与关联蛋白质同一基因表达的剪接后突变体 衍生的。另外只要没有特别指示，这样的多肽例如可以是具有对特定糖链具有特异结合的 亲和结合性或对特异对象的结合活性等该半乳凝素9蛋白质具有的生物活性中的一个或 一个以上生物活性的多肽。本「多肽」用语并不限定于特定长度的基因产物。不管是来自 人的或来自人以外的供给源的，至于半乳凝素9的N末端侧糖链识别部位（NCRD)以及C末 端侧糖链识别部位（CCRD)与靶蛋白质或成熟蛋白质同一的，或至少具有60%、优选70%、 更优选80%、和最好优选90%、进一步优选95%的同源性的多肽都包括在本多肽的这个定 义内。因此可以包括基于对立基因的突变体、以及包括氨基酸的置换、缺失、或插入在内的 基因产物的突变体。氨基酸的置换可以是氨基酸的保守性置换、或对糖基化部位、磷酸化部 位、乙酰化部位等进行改变那样的氨基酸置换、对功能不需要的半胱氨酸残基的位置进行 改变后，改变了折叠形式的置换、以及除去非必需氨基酸残基那样的置换。作为氨基酸的保 守性置换一般来说是保存电荷、疏水性/亲水性、和/或被置换的氨基酸的立体尺寸（大 小）那样的置换，例如、Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/GIn、Ser/Cys/Thr、 和Phe/Trp/Tyr等组的成员之间的置换是保守性的置换。
[0140] 所谓类似物是具有靶蛋白质样活性的物质，作为肽样物质如含有一个或一个以上 被广泛了解的肽模仿物质的肽等。在本定义中，包括例如含有一个或一个以上氨基酸的类 似物（例如、含有非天然型氨基酸等）的多肽、含有被置换的连结部的多肽、天然存在的那 样的变异和天然不存在的那样变异的该【技术领域】中众所周知的那样的其它改变?修饰。
[0141] 本说明书中用语「多肽」是多肽表达后被改变的多肽，例如进行了糖基化、乙酰化、 磷酸化、肉豆蘧酰化等。
[0142] 本说明书中用语「裸DNA」指的是为了在哺乳动物中表达给予哺乳动物的聚核苷 酸DNA。作为聚核苷酸，例如可以是编码序列，聚核苷酸DNA -旦DNA进入细胞内，为了使 编码序列容易表达可以直接或间接地与表达调控序列的序列结合。所谓间接结合目的是使 DNA在哺乳动物细胞中容易表达，为了使调节领域和编码序列进行结合，或使整合其它序列 容易，借助于接头或间隔片段将两个聚核苷酸领域结合在一起。
[0143] 本说明书中的「载体」指的是可以指示1或多个目的序列或基因表达的集合体（组 件）。载体必须任意含有转录启动子/增强子、规定1或多个基因座的成份、以及控制对可 变剪接、核RNA输送、信使翻译后进行的修饰、或蛋白质的转录后进行的修饰等过程进行指 示或调控的其它基因表达的其它成份。
[0144] 另外载体必须在被转录时，含有与一个或一个以上的目的序列或基因可操作连 接、而且作为翻译起始序列起作用的那样序列。根据需要，载体可以含有指示多聚腺苷化的 信号、Neo、TK、潮霉素、博莱霉素（腐草霉素）、组氨醇、DHFR等那样的选择标志、一个或一 个以上的限制性部位和翻译终止序列。另外当载体配置在逆病毒中时，载体必须含有包装 信号、长末端反复序列（LTR)、而如果没有这些序列，必须含有适合使用的逆病毒的正链和 负链的引物结合部位。
[0145] 所谓「组织特异的启动子」指的是在被限定的一些组织型或细胞型中具有优先活 性那样的启动子，规定转录启动子/增强子或基因座的成份、或象上述那样控制基因表达 的其它成份。作为这样的组织特异的启动子的代表例，例如PEPCK启动子、HER2/neu启动 子、酪蛋白启动子、IgG启动子、绒毛性胚抗原启动子、弹性蛋白酶启动子、胆色素原脱氨基 酶启动子、胰岛素启动子、成长激素因子启动子、酪氨酸羟化酶启动子、白蛋白启动子、a胎 球蛋白启动子、乙酰胆碱受体启动子、醇脱氢酶启动子、a或0珠蛋白启动子、T细胞受体 启动子、骨钙素启动子等。
[0146] 所谓「事件特异的启动子」指的是是规定转录启动子/增强子或基因座的成份、或 象上述那样控制基因表达的其它成份，而且它们的转录活性指的是当对细胞性刺激应答时 进行变化那样的活性。作为这样的事象特异的启动子的代表例，如胸腺嘧啶脱氧核苷激酶 或胸苷酸合成酶启动子、a或3干扰素启动子、以及对于激素（天然激素、合成激素、或来 自其它非宿主生物的任一种激素，例如昆虫激素等）的存在进行应答的启动子等。
[0147] 用语「融合蛋白质」或「融合多肽」指的是使用能够发生一个以上的蛋白质或含有 一个以上的蛋白质部分的1个多肽表达那样的载体表达产生的，而且使载体或连续的结合 中的一个以上的异种编码序列重组表达后得到的蛋白质或多肽。融合蛋白质最好是带有保 持来自构建它使用的蛋白质或多肽具有的至少一个生物学活性的多肽单位，最好是包括通 过使不同蛋白质的部分组合，形成信号多肽，使相乗改良的生物学活性产生的融合蛋白或 融合多肽。作为生成的融合蛋白质，如有表达时具有功能的多肽，有表达时没有功能的肽。 作为表达时没有功能的肽，最好是如为了表达具有活性的多肽时起作用的肽。作为本发明 中有用的融合蛋白质的例子，如从用于治疗或用于检测或测定，以及用于进一步分析或分 离和纯化的利用观点考虑具有几个优点的经基因操作的任意半乳凝素9突变体融合多肽。
[0148] 用语「嵌合」或「嵌合蛋白质」可以认为含有与融合蛋白质或融合多肽等价的意 思。「嵌合分子」可以是融合多肽、或编码融合多肽的聚核苷酸融合分子。嵌合由可连结的 DNA编码序列构建，然后通过细胞系表达，或通过载体给予，在动物中可以进行体内表达。 例如、含有半乳凝素9突变体的嵌合或融合蛋白质可以在体内或体外通过基因治疗程序给 予。
[0149] 本说明书中所谓「患者」指的是在活的生物中可进行任意治疗或予防治疗的个体， 包括真核生物或原核生物，并不限定于这些。例如、作为患者的真核生物可以是脊椎动物或 无脊椎动物。因此，例如、患者可以是鱼、鸟、蠕虫、昆虫、哺乳动物、爬虫类、两栖类、菌类、植 物，优选哺乳动物。作为哺乳动物，例如人。
[0150] 以下对本发明的半乳凝素9突变体治疗剂和/或诊断剂的一般的制造和使用法进 行说明。在1种方式中，本发明提供对起因于半乳凝素9含有的生理活性或生物活性不足 或欠缺的疾患?疾病?异常状态进行治疗的技术。作为该治疗技术，例如提供半乳凝素9 突变体治疗剂的工程和/或给予有该疾患等的哺乳动物有效量的半乳凝素9突变体治疗剂 的工程等。半乳凝素9突变体由于能够发挥对恶性肿瘤细胞的伤害细胞活性、对恶性肿瘤 细胞的凋亡诱导活性、对恶性肿瘤细胞的抗肿瘤活性（抗癌活性）、活化T细胞的凋亡诱导 活性、特别是CD4阳性T细胞的凋亡诱导活性、免疫调节活性、抗炎症作用、抗变态性作用， 所以预期可以作为抗肿瘤剂（抗癌剂）、抗变态性剂、免疫调节剂、自身免疫疾患用剂、抗炎 症剂和肾上腺皮质类固醇激素替代用剂。该治疗技术包括对活化T细胞显著的自身免疫疾 患进行治疗的方法。所谓「自身免疫疾患」和「自身免疫」都指的是哺乳动物中的由于自身 免疫导致的特征性的损伤（这是对自身成分的免疫系的应答）。自身免疫应答是进展到表 现出临床征兆的症状的现象。严格来说，移植排斥并不是自身免疫反应，而是患者有时接受 对有症状的细胞、组织、或器官进行置换或移植的外科手术时，接受同种移植的生物体对外 来移植发生免疫学反应的现象。在由来自种的一个成员向其它种的细胞、组织、或器官的同 种移植中，在受体（recipient)中当为了排斥被移植的细胞、组织、或器官发生充分的免疫 应答时，发生「移植排斥」。
[0151] 作为通过本发明的方法和治疗剂能够治疗的「肿瘤」的例子，包括恶性肿瘤，例如 进行转移的肿瘤为恶性肿瘤，一般将恶性肿瘤分为上皮性和非上皮性的肿瘤，有时也区分 为癌、肉瘤、白血病等来考虑，单称为「癌」时，一般人大多指恶性肿瘤。在本说明书中所谓 「癌」可以按照广泛意思解释，并不单解释为上皮性的恶性肿瘤。在本说明书中所谓「癌」可 以包含上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤（既包含肿瘤形成性的肿瘤，也包含非形成性 的肿瘤），如皮肤癌（也包含黑素瘤）、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸恶性肿瘤、前列腺癌、膀 胱癌、肾癌、甲状腺癌、咽?喉头癌、舌癌、上颚癌、食道癌、胃癌、大肠?直肠癌、肺?支气管 癌、肝癌（包括肝细胞癌、肝内胆管癌）、肝外胆管?胆囊癌、胰赃癌、白血病、恶性淋巴瘤、 浆细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性血管瘤、 恶性血管内皮瘤、脑肿瘤（包括脑膜瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤等）等，并不限定于这些， 应当理解为通过使用本发明的半乳凝素9突变体获得理想结果的肿瘤，还包括该半乳凝素 9突变体参与后可获得某种生理或生物学上应答的肿瘤。
[0152] 作为通过本发明的方法和治疗剂能够治疗的「自身免疫疾患」的例子，如多发性硬 化症、桥本甲状腺炎、全身性红斑狼疮（SLE)、肺肾综合征（Goodpasture)、天疱疮、受体自 身免疫、自身免疫溶血性贫血、自身免疫血小板减少性紫斑病、变形性关节症、慢性关节炎 风湿病、抗胶原抗体和强皮症（schleroderma)、复合化结合组织病、多发性肌炎、恶性贫血、 特发性艾迪生病、自发性不孕症、丝球体肾炎、水疱性类天庖疮、肾上腺素作用性药物耐性、 慢性活性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫基底的内分泌腺不全、白斑、脉管炎、心肌梗 塞后遗症（post-myocardial infarction)、心脏穿孔症候群、荨麻疫、特应性皮炎、自身免 疫基底的哮喘、自身免疫基底的炎症性反应、肉芽肿症损伤、强直性（alkylizing)脊椎炎、 链球菌感染后（poststreptococcal)的丝球体肾炎、自身免疫溶血性贫血、脑炎、对淋巴瘤 的二次自身免疫反应、变性损伤、萎缩性损伤等。作为表示受体自身免疫的自身免疫疾患， 例如格雷夫斯病、重症肌无力症、胰岛素耐性症等。作为肾上腺素性药物耐性的自身免疫疾 患，例如哮喘和囊胞性纤维症等。
[0153] 作为本发明中的其它自身免疫疾患，例如动物模型存在的疾患，例如肖格伦综合 征（自身免疫泪腺炎（dacryodentis)或免疫媒介唾液腺炎）、自身免疫心肌炎、原发性胆汁 性肝硬变（PBC)、炎症性心脏病、水银诱导性肾自身免疫、胰岛素依赖性糖尿病（I型糖尿病 或IDD)、胸腺切除术后自身免疫、中枢神经系（CNS)脱髓鞘障碍、CNS狼疮、睡眠发作、免疫 媒介PNS障碍、变形性关节症、慢性关节炎风湿病、葡萄膜炎、髓质囊胞性纤维症、自身免疫 溶血性疾患、自身免疫脉管炎、卵巢自身免疫疾患、强皮症（scheroderma)等。作为由于中 枢神经系（CNS)脱髓障害导致特征性自身免疫疾患，例如多发性硬化症（MS)等。末梢神经 系（PNS)自身免疫疾患例如格林-巴利综合征（GBS)。
[0154] 作为半乳凝素9突变体治疗剂，如多肽、聚核苷酸、低分子有机化合物、肽、或肽样 化合物或物质等。而半乳凝素9突变体治疗剂也包括编码半乳凝素9突变体多肽、半乳凝 素9突变体多肽的聚核苷酸、含有该半乳凝素9突变体多肽一部分的融合多肽、编码含有该 半乳凝素9突变体多肽一部分的融合多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突变体多肽的生物活性 肽衍生物、来自于半乳凝素9突变体多肽的生物活性肽样化合物或物质、或具有半乳凝素9 突变体活性，且模仿半乳凝素9突变体结构的低分子有机化合物（例如、激动剂）等。半乳 凝素9突变体多肽可以是半乳凝素9突变体多肽突变体、半乳凝素9突变体多肽衍生物、变 异的半乳凝素9突变体多肽、或缩短型半乳凝素9突变体多肽那样的生物活性的半乳凝素 9突变体多肽。编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸也可以是编码带有半乳凝素9N端 侦U CRD全长以及C端侧CRD全长的突变体多肽的聚核苷酸序列、编码半乳凝素9突变体多 肽的生物活性部分的序列、编码来自于半乳凝素9突变体多肽的生物活性肽的序列、编码 可溶性半乳凝素9突变体多肽的序列等。本发明另外实施方式是含有可以表达编码半乳凝 素9突变体多肽的聚核苷酸序列的基因递送载体的组成物。
[0155] 本发明中利用「基因重组技术」，构建和获得所定核酸（聚核苷酸）或所定肽（多 肽），另外可进行分离?序列决定，制作重组体。作为本说明书中可使用的基因重组技术 (包括重组DNA技术），如该领域已知的技术，例如可以通过J. Sambrook, E. F. Fritsch&T. Maniatis,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)〃，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York(1989) ；D. M. Glover et al. ed.，〃DNA Cloning"，2nd ed. , Vol. Ito 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化学会编、「续生化学实验讲座1、基因 研究法II」、东京化学同人（1986);日本生化学会编、「新生化学实验讲座2、核酸III (重 组 DNA 技术）」、东京化学同人（1992) ;M.J. Gait(Ed), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (1984) ；B.D.Hames and S. J. Higgins(Ed), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Ltd. , Oxford, UK(1985) ；B. D.Hames and S. J. Higgins(Ed), Transcription and Translation:A Practical Approach(Practical Approach Series), IRL Press Ltd., Oxford, UK(1984) ；B.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(2nd Edition), John ffiley&Sons, New York (1988)； J. H. Miller and M. P. Calos (Ed), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1987) ；R. J. Mayer and J. H. Walker(Ed), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, (1987) ；R. K. Scopes et al. (Ed), Protein Purification:Principles and Practice (2nd Edition, 1987&3rd Edition,1993), Springer-Verlag^ N. Y. ；D. M. Weir and C.C.Blackwell(Ed), Handbook of Experimental Immunology, Vol. I,2,3and 4, Blackwell Scientific Publications，Oxford， （1986) ；L.A.Herzenberg et al. (Ed)，Weir's Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, 2, 3and 4, Blackwell Science Ltd. (1997) ；R. W. Ellis(Ed), Vaccines new approaches to immunological problems, Butterworth-Heinemannj London (1992) ；R. Wu ed.，''Methods in Enzymology"，Vol. 68(Recombinant DNA)，Academic Press，New York(1980) ;R. Wu et al. ed.，"Methods in Enzymology^jVol. 100(Recombinant DNAjPart B)&101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York(1983) ;R. Wu et al.ed.，"Methods in Enzymology^j Vol. 153 (Recombinant DNAj Part D)，154 (Recombinant DNAj Part E)&155 (Recombinant DNAjPart F),Academic PressjNew York(1987) ；J.H. Miller ed. , ^Methods in Enzymology^jVol. 204, Academic PressjNew York(1991) ；R. Wu et al.ed.，"Methods in Enzymology^j Vol. 218, Academic Press,New York(1993)； 5. Weissman (ed.)，"Methods in Enzymology"，Vol. 303, Academic Press，New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.)，"Methods in Enzymology^j Vol. 306, Academic Press, New York(1999)等所述的方法或其中引用的文献所述的方法或与它们基本上同样的方法或改 变法进行（这些方法中的记载由于参照也包括在本说明书的内容中）〔以下、将这些方法都 称之为「基因重组技术」）。
[0156] 本说明书中，所谓「同源性」意味着在多肽序列（或氨基酸序列）或聚核苷酸 序列（或碱基序列）中的2条链之间，构成该链的各个氨基酸残基之间或各碱基之间的 相互适合关系中能够决定是同一那样的氨基酸或碱基的量（数），指的是两个聚核苷酸 或多肽序列之间的序列相关性的程度。同源性可以容易算出。测定两个聚核苷酸或多 肽序列之间的同源性的方法已知有很多种，「同源性」（也称为「同一性」）的用语对于 同行众所周知（例如、Lesk，A. M. (ed. )，Computational Molecular Biologly，Oxford University Press,New York, (1988) ；Smith,D.W. (ed. ), Biocomputing:Informatic s and Genome Projects, Academic Press, New York (1993) ；rifin, M. &Grifin, H. G. ed.) omputer Analysis of Sequence Data:Part Ii, Human Press, New Jersey, (1994)； von Heinje，G.，Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987) ；Gribskov, M. &Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press，New York，（1991)等）。测定两个序列的同源性使用的一般方法如Martin，J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers,Academic Press,San Diego, (1994)； Carillo, H. &Lipman，D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073(1988)等公布的方法，但并不限 定于这些方法。作为用于测定同源性的理想方法，如为了获得进行试验的两个序列间的 最大的适合关系部分而设计的方法。这样的方法如作为计算机程序建立的方法。作为测 定两个序列间同源性的理想的计算机程序法如GCG程序包（Devereux，J. et al.，Nucleic AcidsResearch, 12(1):387 (1984)O/BLASTP/BLASTN(Atschul, S. F. et al.,J.Mol. Biol，215:403(1990))等，但并不限定于这些方法，可以使用该领域中众所周知的方法。
[0157] 在本说明书中，所谓「聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)」或「PCR」 一般指的是美国专利第4, 683, 195号说明书等所述的那样方法，例如指用于在体外通过酶 对所期望的核苷酸序列进行扩增的方法。一般来说，PCR法是包括使用能够优先与模板核 酸进行杂交的2个寡核苷酸引物，反复进行引物延伸合成那样的循环的方法。对于典型的 PCR法中使用的引物可以使用对于模板内部应当可扩增的核苷酸序列互补的引物，例如， 优选使用在与应当扩增的核苷酸序列的两端互补、或与应当被扩增的核苷酸序列邻接的引 物。作为5'端的引物要按照至少含有起始密码子、或包含该起始密码子、可扩增那样选择， 而作为3'端侧的引物最好是能够至少含有终止密码子、或含有该终止密码子能够扩增那样 地进行选择。引物优选由5个以上的碱基，更优选10个以上碱基构成的寡核苷酸、更优选 由18?25个碱基构成的寡核苷酸。
[0158] PCR反应可以按照该领域众所周知的方法或与这些方法基本上同样的方法 或改变法进行，例如可以根据 R. Saiki, et al.，Science, 230:1350, 1985 ;R. Saiki, et al.，Science, 39:487, 988;. A. Erilich ed.，PCR Technology, Stockton Press, 989;. M. Glover et al.ed.，"DNA Clonig"，2nd ed.，Vol.l，(The Practical Approach Series)，RL Press, Oxford University Press (1995) ;M. A. Innis et al.ed.，"PCR Protocol s : a guide to methods and app locat ions，'，Academi c Prss, New AYork 1990) ；M. J. McPherson, . Quirk and G. R. Tayloy (Ed. , ), CR: a pract9ical approach, RL Press, Oxford (1991) ；M. A. Frohman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002(1988)等所述的方法或对这些方法进行修饰、改变的方法进行。另外， PCR法也可以使用适用的市售的试剂盒进行，根据试剂盒制造者或试剂盒销售者指明的程 序实施。
[0159] PCR反应对于代表性的实验是将例如模板（例如，以mRNA为模板合成的DNA ;lst strand DNA)和根据该基因设计的引物与IOX反应缓冲液（Taq DNA聚合酶附带的）、 dNTP (脱氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP dTTP的混合物）、Taq DNA聚合酶以及去离子蒸馏 水混合。对于该混合物使用例如GeneAmp 2400PCR system, erkin-Elmer/Cetus公司等自动 热循环仪在一般的PCR循环条件下反复该循环25?60次，用于扩增的循环数可以根据相 应目的设为合适的次数。作为PCR循环的条件，例如变性90?95°C 5?100秒、退火40? 60°C 5?150秒、延伸65?75°C 30?300秒的循环，优选变性94°C 15秒、退火58°C 15秒、 延伸72°C 45秒的循环，退火的反应温度以及时间可以根据相应实验选择适当的值，变性反 应和延伸反应的时间也可以根据预想的PCR产物的链长选择适当的值。退火的反应温度最 好是根据通常引物与模板DNA的杂交的Tm值改变。延伸反应的时间通常大约每IOOObp的 链长1分钟程度那样的尺度，根据场合不同也可以选择更短的时间。
[0160] 在本说明书中，所谓「寡核苷酸」可以是比较短的单链或双链的聚核苷酸，优选聚 脱氧核苷酸，可以通过Angew. Cem. nt. Ed. Engl.，Vol. 28, p. 716-734 (1989)所述的那样已 知方法、磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸法、磷酸酰胺法、磷酸法等方法化学合成。已知通常 合成可以很便利地在被修饰的固体支持体上合成，该仪器有销售。该核苷酸可以含有一个 或一个以上的修饰碱基，例如可以含有次黄苷等天然而不是普通的碱基或三甲基化的碱基 等，根据场合不同也可以含有带有标记的碱基。
[0161] 为了对所定核酸进行鉴定，可以利用杂交技术。该杂交可以根据上述公布的「基因 重组技术」的文献所述的方法或基本上与它同样的方法或改变法进行。例如，杂交可以使含 有DNA等核酸的样品转移到含有尼龙膜等膜载体上，根据需要实施变性处理、固定化处理、 清洗处理等后，使转移到上述载体（例如膜等）的核酸根据需要，使变性的标记探针DNA片 段在杂交用缓冲液中进行反应。
[0162] 杂交处理通常于约35?约80°C进行、于约50?约65°C下更合适，进行约15分 钟?约36小时，约1?约24小时更合适，可以选择最适条件进行。例如，杂交处理在约55°C 下进行约18小时。作为杂交用缓冲液，可以使用选自该领域中通常使用的缓冲液，例如可 以使用Rapid hybridization buffer (Amersham公司）等。作为转移的载体（例如，膜等） 的变性处理，通常通过于约40?约100°C、于约70?约90°C下更合适，进行约15分钟?约 24小时焙烤，进行约1?约4小时焙烤更合适，可以选择最适合条件进行。例如，对膜等载 体通过于80°C下进行约2小时焙烤进行固定化。作为转移的载体（例如膜等）的清洗处 理，可以通过用在该领域中通常使用的清洗液、例如含有IMNaCUlmMEDTA和0. 1%十二烷 基硫酸钠（SDS)的50mM Tris - HCl缓冲液，pH8. 0等进行清洗。作为含有尼龙等膜的载 体，可以使用从该领域通常使用的载体中选择的载体。
[0163] 作为上述碱性变性液、中和液、缓冲液，可以使用从该领域中通常使用的缓冲 液中选出来的缓冲液，作为碱性变性液，例如可以使用含有〇. 5MNaCl和1. 5MNaCl的 0. 5M Tris - HCl 缓冲液，pH8. 0 等，作为缓冲液例如 2XSSPE(0. 36MNaCl、20mMNaH2P04 和2mMEDTA)等。另外在杂交处理之前，为了防止非特异性杂交反应，根据需要，进行了 转移的载体（例如膜等）最好是进行预杂交处理。该预杂交处理可以通过例如浸入到 预杂交溶液[50% formamide、5XDenhardt 溶液（0.2%牛血清白蛋白、0.2% polyvinyl pyrrolidone)、5XSSPE、0. 1% SDSUOOii g/ml 热变性鲑精子 DNA]等中，于约 35 ?约 50°C， 优选42°C下进行约4?约24小时，优选约6?约8小时反应，该条件同行可以通过反复进 行适当实验，确定更理想的条件。在杂交中使用的标记探针DNA片段的变性可以于约70? 约KKTC下、优选约KKTC下，进行约1?约60分钟、优选约50分钟加热等进行。而杂交可 以利用其众所周知的方法或根据这些方法的方法进行，在本说明书中，所谓严格的条件指 的是例如，关于钠浓度，约15?约50mM、优选约19?约40mM、更优选约19?约20mM，关于 温度约35?约85°C、优选约50?约70°C、更优选约60?约65°C的条件。
[0164] 杂交完了后，对膜等载体进行充分清洗处理，在将进行特异杂交反应的标记探针 DNA片段以外的标记探针等除去后，可以进行检测处理。膜等载体的清洗处理可以使用从 该领域通常使用的方法选出的方法进行，例如可以通过用含有〇. 1% SDS0. 5 XSSC (0. 15M NaCl、15mM柠檬酸）溶液等进行清洗。
[0165] 进行杂交的核酸可以通过代表性的自动放射自显影进行检测，在检测中也可以适 当选用该领域中使用的方法。将进行检测的相当于信号的核酸带悬浮于适当的缓冲液、例 如 SM 溶液（含有 IOOmM NaCl 和 IOmM MgSO4 的 50mM Tris - HCl 缓冲液，pH7. 5)等，然后 对该悬浮液进行适度稀释，对所定核酸进行分离?纯化，然后再进行扩增处理。在本说明书 中，所谓「高同源性」是因该对象序列的长度不同而不同，例如可以是50%以上、甚至60% 以上、优选70%以上、更优选80%以上，而对于特定场合也可以为95%以上，97%以上特别 好。所谓「同效的碱基序列」例如在严格条件下与含有问题序列的核酸可进行杂交的碱基 序列，例如与该碱基序列中连续的5个以上的碱基序列、优选IO个以上的碱基序列、更优选 15个以上的碱基序列、更优选20个以上的碱基序列进行杂交，编码与该多肽基本上同等的 氨基酸序列的碱基序列。核酸也可以通过化学合成获得。这种情况下，化学合成片段，然后 通过酶将合成的片段结合起来。
[0166] 通过杂交处理对从含有基因文库或cDNA文库等的核酸样品中进行筛选目的核酸 的处理可以反复进行。可以使用被克隆的来自人的cDNA文库、例如各种来自人的组织或 培养细胞（特别是人的肾脏、脑、松果体、下垂体后叶、神经细胞、网膜、网膜血管细胞、网膜 神经细胞、胸腺、血管、内皮细胞、血管平滑肌细胞、血液细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、精巢、卵 巢、子宫、肠、心脏、肝脏、小肠、大肠、齿肉关连细胞、皮肤关连细胞、线球体细胞、尿细管细 胞、结合组织细胞等组织?细胞、以及各种肿瘤组织、癌细胞等）cDNA文库。另外用作模板等 的cDNA文库也可以直接使用市售的来自各种组织的cDNA文库，例如可以使用由Stratagen 公司、Invitrogen公司、Clontech公司等销售的cDNA文库。作为典型的例子，可以使用 由人组织?细胞制备的基因文库、例如人Pl artificial chromosome基因组文库（Human Genome Mapping Resource Center)、人组织cDNA文库（例如，可从Clontech公司等获得）。 使用探针可以对由各种人组织或培养细胞等构建的人基因组DNA文库或来自人的cDNA文 库进行筛选。为了用放射性同位素等对探针等进行标记，可以使用市售的标记试剂盒、例 如随机引物DNA标记试剂盒（Boehringer Mannheim公司）等进行。例如使用随机引发 (random-priming)试剂盒（Pharmacia LKB 公司，Uppsala)等，用[a-32P]dCTP(Amersham 公司）等对探针用DNA进行标记，可以获得带有放射活性的探针。
[0167] 含有所定核酸的噬菌体粒子、重组质粒、重组载体等可以通过该领域中通常使 用的方法对所定核酸进行纯化分离，例如可以通过甘油梯度超离心分离法（Molecular Cloning,a Laboratory Manual, ed. T. Maniatis, Cold Spring Harobor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989)、电泳法等进行纯化。使用在该领域中通常使用的方法可以从噬菌体粒子等纯 化分离DNA，例如，将得到的噬菌体等悬浮于TM溶液（含有IOOmM MgSO4的50mM Tris - HCl缓冲液，pH7. 8)等，用DNase I和RNase A等处理后，加20mM EDTA、50ii g/ml蛋白酶K 以及0. 5% SDS混合液等，于约65°C，保温约1小时后，对该溶液进行酚提取、二乙基乙醚提 取后，通过乙醇沉淀使DNA沉淀，然后将得到的DNA用70 %乙醇洗净后干燥，溶解于TE溶液 (含有IOmM EDTA的IOmM Tris - HCl缓冲液，pH8. 0)等后得到。另外作为目的DNA通过 亚克隆等大量获得也是可能的，例如亚克隆作为宿主可以使用大肠杆菌，用质粒载体等进 行。通过这样亚克隆得到的DNA也与上述同样，通过离心分离、酚提取、乙醇沉淀等方法纯 化分离。
[0168] 在本说明书中，得到的PCR产物等核酸（包括DNA)通常进行1?2%琼脂糖凝 胶电泳，作为特异的带从凝胶中切出，例如，使用gene clean kit(Bio 101)等市场销售 的提取试剂盒进行提取。提取的DNA用适当的限制酶切，根据需要进行纯化处理，或根据 需要，对5'末端用T4聚核苷酸激酶等进行磷酸化后，与pUC18等pUC系载体等适当的质 粒载体连接，转化适当的感受态细胞。被克隆的PCR产物可以解析其碱基序列。对于PCR 产物的克隆，可以使用例如 P-Direct (Clontech)，pCR-Script?SK(+) (Stratagene 公司）、 pGEM-T(Promega公司），pAmp?(Gibc〇-BRL公司）等市场销售的质粒载体。为了进行宿 主细胞的转化，例如可以使用噬菌体载体，使用钙法、铷/钙法、钙/锰法、TFB高效率法、 FSB冷冻感受态细胞法、迅速克隆法、电穿孔等该领域已知的方法或基本上与该方法同样 的方法进行（D.hanahan，J. Mol. Biol.，166:557, 1983等）。为了分离目的DNA，可以运用 逆转录 PCR(polymerase chain reaction coupled reverse transcription ;RT_PCR)、 RACE(rapid amplification of cDNA ends) qRACE可以根据例如M. A. Innis et al.ed.，"PCR Protocols，'（M. A. Frohman, "a guide to methods and applications，'），pp. 28-38, Acade mic Press, New York(1990)等所述的方法进行。
[0169] DNA，可以根据需要克隆，例如可以利用质粒、入噬菌体、粘粒、Pl噬菌体、F因子、 YAC等。最好是来自入噬菌体的载体，例如可以利用Charon 4A、Charon 21A、AgtlO、 入 gtll、XDASHII、XFIXII、XEMBL3、XZAPII?(Stratagene 公司）等。另外可以将得到 的DNA整合到下面详细说明那样的适当载体、例如质粒pEX、pMAMneo、pKG5等载体，用下面 详细说明那样的适当的宿主细胞、例如大肠杆菌、酵母、CHO细胞、COS细胞等表达。另外该 DNA片段直接或作为附加了适当调控序列的DNA片段整合到适当的载体、然后导入动物后， 可以做成表达所定基因的转基因动物。作为动物如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、土拨鼠、 牛等。最好是将该DNA片段导入小鼠等动物的受精卵，可以做成转基因动物。对于所定的 基因产物的确认可以使用转化该外源基因的293T细胞、COS - 1细胞等适于该基因的动物 细胞等进行。
[0170] 作为将外源基因导入哺乳动物等动物细胞的方法，可以通过该领域已知 的方法或基本上与该方法同样的方法进行，例如磷酸钙法（例如，F.L. Graham et al.，Virology, 52:456, 1973 等）、DEAE -葡聚糖法（例如，0.?^『(166七已1.，]\6611. Virol.，3:371，1968 等）、电穿孔法（例如，E. Neumann et al.，EMBO J 1. :841，1982 等）、 微注射法、脂质体法、病毒感染法、噬菌体粒子法等。这样一来，转染了所定的基因的动物细 胞产生的基因产物也可以进行基因解析。
[0171] 作为整合所定基因等（本发明中得到的DNA等）的质粒，只要是在基因工程中常 用的宿主细胞（例如，大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞宿主、酵母、293T细胞、CHO细胞、COS 细胞等真核细胞宿主、Sf21等昆虫细胞宿主）中能够表达的质粒，什么样的质粒都可以。 当然也可以选用市售的试剂盒或试剂附带的质粒。在这样的序列内，也可以含有例如为了 在选择的宿主中表达而进行适当修饰的密码子，或设计限制酶部位，也可以含有为了使目 的基因表达容易的调控序列、促进序列等、在结合目的基因中起作用的接头、适配器等、以 及调控抗生素抗性等、调控代谢、对筛选有用的序列（也可以含有编码杂化蛋白或融合蛋 白质的序列）等。最好是使用适当的启动子、例如在以大肠杆菌作为宿主的质粒中，如使用 色氨酸启动子（trp)、乳糖启动子（Iac)、色氨酸?乳糖启动子（Iac)、脂蛋白启动子（Ipp)、 入噬菌体1\启动子等，在以动物细胞作为宿主的质粒中，可以使用SV40晚期启动子、MMTV LTR启动子、RSV LTR启动子、CMV启动子、SRa启动子等，在以酵母作为宿主的质粒中可以 使用 GAL1、GALlO 启动子等。另外也可以使用 CYC1、HIS3、ADH1、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、 TRP、URA3LEU2、EN0、TP1、A0X1 等调控系。
[0172] 为了促进编码所期望多肽的DNA的转录，可以在载体中插入增强子，作为这样的 增强子，如作用于启动子、具有促进转录的作用，通常约10?IOObp的具有Cis作用的序列 (元件）。很多增强子是从珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、a -转铁蛋白、胰岛素等哺乳动物 基因了解到的。作为代表性的，使用从真核细胞感染性病毒得到的增强子合适，例如位于复 制起点的晚期区的SV40增强子（100 - 270bp)、巨细胞病毒的初期启动子的增强子、位于多 糖类的复制起点的晚期区的增强子、腺病毒的增强子等。另外根据需要，也可以附加宿主中 存在的信号序列，这些可以使用同行都非常了解的。
[0173] 作为以大肠杆菌作为宿主的质粒，例如pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、 pSP64、pSP65、pTZ - 18R/-18U、pTZ - 19R/-19U、pGEM - 4、pGEM - 3Z、pGEM - 4Z、 pGEM - 5Zf ( - )、pBluescr ipt KS? (Stratagene公司）等。作为适于在大肠杆菌中 表达的质粒载体，如 pAS、pKK223(Pharmacia 公司）、pMC1403、pMC931、pKC30、pRSET - Bdnvitrogen公司）等。作为以动物细胞为宿主的质粒，例如SV40载体、多糖类?病 毒载体、牛痘病毒载体、逆转录病毒载体等，具体来说，如pcD、pcD-SRa、CDM8、pCEV4、 pME18S、pBC12Bl、pSG5(Stratagene公司）等。作为以酵母为宿主的质粒，如Yip型载 体、Yep型载体、YCp型载体等，例如pGPD-2等。作为宿主细胞，当宿主细胞为大肠杆菌 时，如来自大肠杆菌K12株的，例如作为来自NM533、XLlBlue、C600、DH1、DH5、DH11S、 DH5 a、DH10B、HB101、MC1061、JM109、STBL2、B834 株的，如 BL21 (DE3)pLysS 等。宿主细 胞为酵母时，例如 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces prombe, Pichia pastoris，Kluveromyces 株，Candida Trichoderma reesia，以及其他酵母株等。作为在 酵母中的表达系，例如可以参照 Hinnen et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929 ; Ito et al. , J. Bacteriol. (1983) 153:163 ；Kurtz et al. , Mol. Cell. Biol. (1986)6:142 ； Kunze et al. , J. Basic Microbiol. (1985)25:141 ；Gleeson et al. , J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459 ；Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet(1986)202:302 ；Das et al. , J. Bacteriol. (1984) 158:1165 ；De Louvencourt et al. , J. Bacteriol. (1983) 154:737； Van den Berg et al. , Bio/Technology(1990) 8:135 ；Kunze et al. , J. Basic Micr Biol. (1985)25:141 ;Cregg et al., Mol. Cell.Biol. (1985)5:3376 ;美国专利第 4,837, 148 号说明书，同第 4,929,555 号说明书；Beach and Nurse, Nature (1981) 300:706 ; Davidow et al.,Curr.Genet. (1985) 10:380 ；Gaillardin et al.,Curr.Genet. (1985) 10:49 ；Ballance et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284 - 289； Tilburn et al., Gene (1983) 26:205 - 221 ；Yalton et al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA(1984)81:1470 - 1474 ；Kelly and Hynes1EMBO J., (1985)4:475479 ；EP 244, 234 ；W0 91/00357等所述的表达系。
[0174] 宿主细胞为动物细胞时，如来自非洲中部猴成纤维细胞的COS - 7细胞、COS - 1细胞、CV - 1细胞、来自人肾细胞的293细胞、来自人表皮细胞的A431xb、来自人大肠 的205细胞、来自小鼠成纤维细胞的COP细胞、MOP细胞、WOP细胞、来自中国仓鼠细胞 的CHO细胞、CHO DHFR _细胞、人HeLa细胞、来自小鼠细胞的C127细胞、来自小鼠细胞 的NIH 3T3细胞、小鼠L细胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat细胞、其他被转化后得到 的细胞系、通常的二倍体、由体外一次培养组织诱导的细胞株等。哺乳动物表达，例如可 以参照Dijkema et al.，EMB0 J. (1985)4:761 ;Gorman et al.，Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1982b)79:6777;Boshart et al.，Cell (1985)41:521;美国专利第 4, 399, 216 号说 明书；Ham and Wallace, Methods in Enzymology (1979) 58:44 ；Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102:255 ;美国专利第4, 767, 704号说明书；同第4, 657, 866号说明书； 同第4,927,762号说明书；同第4,560,655号说明书；TO90/103430 ;TO 87/00195 ;美国 专利第RE 30, 985号说明书等记载的细胞。作为昆虫细胞，以蚕核多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus)、来自该病毒的病毒或其他合适的病毒作为载体， 可以使用 Spodoptera frugiperda(caterpillar), Aedes aegypti(mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melangaster (fruitfly),香幼虫或香培养细胞、例 如 BM - N 细胞等（例如，Luckow et al. , Bio/Technology, 6, 47-5 (1988) ;Setlow, J. K. et al. (end,), Genetic Engineering, Vol. 8, pp. 277-279, Plenum Publishing, 1986 ；Maeda et al.，Nature, 315, pp. 592-594 (1985))。有关异种基因在昆虫中的表达例如可以参照美国 专利第 4, 745, 051 号说明书；Friesen et al. (1986) ,"The Regulation of Baculovirus Gene Expression"，The Molecular Biology of Baculoviruses (ff.Doerfler(Ed))； EP 127, 839；EP 155, 476 ；Vlak et al. , J. Gen. Virol. , (1988) 69: 765 - 776 ；Miller et al. , Ann. Rev. Microbiol. (1988)42:177 ；CarbonelI et al. , Gene(1988)73:409 ； Maeda et al. , Nature, (1985) 315:592-594 ；Lebacq-Verheyden et al., Mol.Cell. Biol. (1988)8:3129 ；Smith et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985)82:8404 ； Miyajima et al. ,Gene (1987) 58:273 ;Martin et al. ,DNA (1988) 7:99 等报道。另 外关于多数的杆状病毒株和突变体以及来自宿主的对应的容许昆虫宿主细胞，例如 可以参照 Luckow et al.，Bio/Technology(1988)6:47_55;Miller et al. ,Generic Engeneering(Serlow, J. K. et al. (Ed))Vol. 8(Plenum Publishing, 1986)pp. 277-279 ； Maeda et al.，Nature (1985) 315:592 - 594 等报道。
[0175] 利用Agrobacterium tumefaciens等，可以将植物细胞作为宿主细胞使用，与适合 它的载体一起，这些在该领域都是广泛了解的。在本发明的基因工程手法中，可以使用在该 领域已知或广泛运用的限制酶、逆转录酶、作为用于对适于将DNA片段克隆化的结构进行 修饰或进行变换的酶的DNA修饰?分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸基转移酶、DNA连接酶等。 作为限制酶，例如 R.J. Roberts, Nucleic Acids Res.，13:rl65, 1985 ;S. Linn et al.ed. Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor, New York,1982 ； R. J. Roberts, D. Macelis, Nucleic Acids Res. , 19:Suppl. 2077, 1991 等报道的酶。
[0176] 根据本发明，用含有编码多肽（或蛋白质）的核酸的表达载体转化的转化体根据 需要使用适当的选择标志，通过反复克隆，可以很多具有稳定高表达能力的细胞株。例如， 在作为宿主细胞使用动物细胞的转化体中，作为选择标志利用dhfr基因时，通过慢慢提高 MTX浓度进行培养，选择抗性株，使编码本发明的多肽的DNA扩增，可以获得能更高表达的 细胞株。本发明的转化体可以在可表达编码本发明的多肽的核酸的条件下进行培养，使目 的物生成、蓄积。该转化体可以在该领域中广泛使用的培养基中进行培养。例如大肠杆菌、 枯草杆菌等原核细胞宿主、酵母等作为宿主的转化体最好使用液体培养基。在培养基中可 以含有生育需要的碳源、氮源、无机物等。作为碳源，如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖 等、作为氮源，如铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、胨、酪蛋白、肉提取物、麦芽提取物、大豆柏、马 铃薯提取液等无机或有机物质、作为无机物，例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁、碳酸钙等。 另外也可以添加酵母、维生素类、酪蛋白水解物、生长促进因子等。另外根据需要为了更有 效地使启动子起作用，可以添加例如30 -吲哚丙烯酸那样的药剂。培养基的pH希望约 5?约8。
[0177] 培养例如对于大肠杆菌通常于约15?约45°C下进行约3?约75小时，根据需要， 也可以加通气或搅拌。对宿主为动物细胞的转化体进行培养时，作为培养基可以使用例如 含有约5?约20%的胎牛血清的MEM培养基、PRM1604培养基、DMEM培养基等。pH优选约 6?8。培养通常于约30?约40°C下进行约15?约72小时，根据需要，也可以加通气或 搅拌。表达所定基因产物的转化体可以直接利用，也可以做成该细胞匀浆液利用，也可以将 所定基因的产物分离后使用。当从上述培养细胞提取时，培养后可以适当运用用众所周知 的方法收集菌体或细胞，将它们悬浮于适当的缓冲液中，通过超声波、溶菌酶和/或冻融等 破坏菌体或细胞后，通过离心分离或过滤获得粗提取液的方法等。在缓冲液中也可以加尿 素或盐酸胍等蛋白质变性剂、TritonX - 100 (商品名）、吐温一 20 (商品名）等表面活性 齐U。对于目的生成物向培养液中分泌的场合，培养结束后，通过这方面众所周知的方法将菌 体或细胞与上清分离开，收集上清。
[0178] 上述那样得到的培养上清、或提取液中含有的目的生成物可以将以往众所周知的 分离纯化法适当组合对其进行纯化，例如通过硫酸铵沉淀法等盐析、通过交联葡聚糖等凝 胶过滤法、使用带有例如二乙基氨乙基或羧甲基等的载体的离子交换层析法、例如，使用带 有丁基、辛基、苯基等疏水性基团的载体等的疏水性层析法、色素凝胶层析法、电泳法、透 析、超滤、亲和层析法、高效液相层析法等进行纯化获得。理想的是可以通过聚丙烯凝胶电 泳、固定了配体等的亲和层析等进行纯化分离处理。例如作为配位体，如包括进行特异识别 的单克隆抗体的抗体或其片段、凝集素、糖、结合对的一方等。例如免疫亲和层析、明胶一琼 脂糖亲和层析、肝素一琼脂糖层析等。
[0179] 得到的本发明的多肽（或蛋白质）可以再通过化学的手法对其含有的氨基酸残基 进行修饰，或使用肽酶，例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、肽链内切酶、肽 链外切酶等酶进行修饰，或进行部分分解后做成其衍生物等。本发明的多肽，C末端可以是 羧基（COOH)或羧化物（C00_)，也可以是酰胺（一 CONH2)或酯（COOR)。其中作为酯中的 R，除了可以使用甲基、乙基、n-丙基、异丙基或n- 丁基等C3 _8烷基、例如环戊基、环己基等 Cp6环烷基、例如苯、a-萘等C6_12芳香基、例如苄基、苯乙基等苯一 Cp2烷基或a-萘 甲基等a _萘一 C1 _ 2烷基等C7 _ 14芳烷基之外，还可以使用作为口服用酯广泛使用的三甲 基乙酰氧甲基等。当本发明的蛋白质C末端以外含有羧基（或羧化物）时，羧基被酰胺化 或酯化后的产物也包括在本发明的多肽中。作为此时的酯，例如可以使用上述的C末端的 醋等。
[0180] 另外，对于本发明的多肽（或蛋白质），也包括在上述的多肽中，N末端的蛋氨酸残 基的氨基被保护基（例如，甲酰基、乙酰基等C 1 _ 5烷一羰基等C1 _ 6酰基等）保护的产物， N端侧在生物体内被切断生成的谷酰基进行焦谷氨酰化的产物、分子内氨基酸的侧链上的 取代基（例如，一 0H、一 C00H、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等）用适当的保护基（例如，甲酰 基、乙酰基等C1 _6酰基等）保护的产物、或结合了糖链的所谓糖蛋白等复合蛋白质等。
[0181] 另外，通过使用以本发明涉及到的基因的碱基序列作为基础的基因工程常用的 方法，例如在所定的多肽的氨基酸序列中适当地置换、缺失、插入、转移或附加1个或多个 以上氨基酸，可以制造导入了变异的适合的多肽。作为这样的变异?变换?修饰法，例如 日本生化学会编、「续生化学实验讲座1、基因研究法II」、pl〇5(广濑进）、东京化学同人 (1986);日本生化学会编、「新生化学实验讲座2、核酸III (重组DNA技术）」、p233(广濑 进）、东京化学同人（1992) ;R.Wu，L Grossman，ed.，"Methods in Enzymology"，Vol. 154， p. 350&p. 367, Academic Press，New York(1987) ;R.Wu，L Grossman，ed.，"Methods in Enzymology,?, Vol. 100, p. 457&p. 468, Academic PressjNew York (1983) ；J. A. Wells et al.，Gene，34:315,1985 ;T.Grundstroem et al.，Nucleic Acids Res.，13:3305,1985 ; J. Taylor et al.，Nucleic Acids Res.，13:8765, 1985 ;R. Wu ed.，"Methods in E nzymology"，Vol. 155,p. 568,Academic Press, New York (1987) ；A. R. Oliphant et al.，Gene，44:177, 1986等所述的方法。例如，利用合成寡核苷酸等的指定位置导入 法（部位特异的突变导入法）（Zoller et al.，Nucleic Acids Res.，10:6487, 1987; Carter et al.，Nucleic Acids Res.， 13:4331， 1986)、盒（序列）突变导入法 (cassette mutagenesis:WelIs et al.，Gene，34:315, 1985)，限制部位选择突变导入法 (restriction selection mutagenesis:Wells et al., Philos.Trans. R. Soc. London Ser A，317:415, 1986)，丙氨酸?扫描法（Cunningham&Wells，Science，244:1081-1085, 1989)， PCR突变导入法，Kunkel法，dNTP[ a S]法（Eckstein)，使用亚硫酸或亚硝酸等的指导区域 突变导入法等方法。
[0182] 另外，当用基因重组法进行制造时，以融合多肽（融合蛋白质）使其表达，在生物 体内或生物体外，也可以变换?加工为基本上与所期望的多肽具有同等生物学活性的多肽。 可以使用基因工程常用的融合产生法，这样融合的多肽利用其融合部，通过亲和层析等也 可以进行纯化。作为这样融合多肽，如可以与组氨酸盒融合的融合多肽，或与半乳糖 苷酶（e-gal)、麦芽糖结合蛋白质（MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)、硫氧还蛋白（TRX) 或Cre Recombinase融合的融合多肽。同样，多肽可以附加异种的抗原表位的盒，通过使 用与该抗原表位特异结合的抗体的免疫亲和层析也可以进行纯化。在更适合的实施方式 中，如聚组氨酸（poly-His)或聚组氨酸-甘氨酸（poly-His-Gly)盒，而作为抗原表位盒， 例如 AU5, c-Myc，CruzTag 09, CruzTag22, CrzTag 41，Glu-Glu，HA，Ha.ll，KT3，FLAG(regis tered trademark，Sigma-Aldrich)，Omni-prbe，S-probe，T7, Lex A,V5,VP16, GAL4, VSV-G 等（Field et al.，Molecular and Cellular Biology，8:pp. 2159-2165(1988) ;Evan et al. , Molecular and Cellular Biology, 5:pp. 3610-3616 (1985) ；Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):pp. 547-553(1990) ；Hopp et al. , BioTechnologyj 6:pp .1204-1210(1988) ；Martin et al. , Scence, 255:pp. 192-194(1992) ；Skinner et al. , J. Bio. Chem. , 266:pp. 15163-15166 (1991) ；Lutz-Freyermuth et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87:pp. 6393-6397(1990)等）。也可以利用使用酵母双杂交法。
[0183] 另外作为融合多肽，也可以是附加了变成可检测蛋白质那样的标志的融合多肽。 在更合适的实施方式中，该可检测标志可以是生物素/链抗生物素蛋白系的Biotin Avi Tag、发焚光的物质等。作为发该焚光的物质，如来自才^ >水母（Aequerea victorea)等 发光水母的绿色焚光蛋白（green fluorescent protein:GFP)、对其进行改变后的变异体 (GFP变异体）、例如EGFP(Enhance-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP)，黄色焚光蛋白 (yellow fluorescent protein: YFP)，绿色焚光蛋白(green fluorescent protein:GFP)、 蓝色焚光蛋白（cyan fluorescent protein:CFP)，青色焚光蛋白（blue fluorescent protein:BFP)，来自々$ ? 4夕(Renilla reniformis)的GFP等（宫胁敦史编、实验医学 另册后基因组时代的实验讲座3 - GFP和Bioimaging、羊土公司（2000年））。也可以使用 特异识别上述融合蛋白的抗体（包括单克隆抗体和其片段）进行检测。这样的融合多肽的 表达和纯化也可以使用适用于表达和纯化的试剂盒，按照试剂盒制造者给出的程序实施。
[0184] 得到的蛋白质（可以包括肽和多肽），通过酶免疫测定法等已知手法使它结合于 适当的载体或固相，可以进行固定化。固相化蛋白质、固相化肽可很便利地用于结合分析或 物质的筛选。
[0185] 多肽或蛋白质的结构的修饰?改变等可以参考例如日本生化学会编「新生化学实 验讲座I、蛋白质VII、蛋白质工程」东京化学同人（1993)，根据该文献所述的方法或其引 用的文献所述的方法、或与其基本上同样的方法进行。在如下面所述的那样的生物学活性 中，也可以包括免疫方面活性、例如抗原性。在该修饰?改变中，可以是脱氨基化、羟基化、 羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙酰化等酰化、酯化、酰胺化、开环、闭环、糖基 化、向含糖链种类不同方面改变、将含糖链数增减、脂质结合、对D-型氨基酸残基的置换 等。这些方法都是在该领域已知的方法（例如、T.E. Creighton, Proteins:structure and molecular Properties，pp.79_86W.H.Freeman&Co.，San Francisco，USA(1983)等）。
[0186] 利用本发明的半乳凝素9突变体，可以筛选对该半乳凝素9的所定生物学活性等 功能（例如，细胞损伤活性、凋亡诱导活性、与糖皮质激素类似的活性、抑制恶性细胞转移 的活性等）促进的化合物（激动剂）或抑制的化合物（拮抗剂）或它们的盐。这也意味着 可以提供该筛选试剂。因此，也可以提供有关利用在本发明中阐明的该半乳凝素9蛋白质 等多肽、其一部分肽或它们的盐表现出的活性的各种各样的物质，对本发明中该半乳凝素9 蛋白质、其一部分肽或它们的盐等表现出的活性等所定功能促进的化合物（激动剂）或抑 制的化合物（拮抗剂）或它们的盐的筛选方法。
[0187] 在该筛选中，例如（i)使适当的试验样品与半乳凝素9突变体蛋白质、其一部分肽 或它们的盐（也包括表达该蛋白质的转化体）等接触的场合与（ii)在本发明的蛋白质、其 一部分肽或它们的盐等中不存在问题的试验样品场合进行比较。具体来说，在上述筛选中， 测定、比较该生物学活性（例如，与各个半乳凝素9蛋白质和生物体成分之间的相互作用有 关的活性等）。
[0188] 在该筛选系中也可以存在为了便于测定的适当的检测用底物。作为该底物，只要 是在测定中可有效利用的，无论什么样的都可以。例如，选用已知的众所周知的底物，最好 是使用合成的化合物等。底物可以直接使用，但最好是使用用荧光素等荧光、酶或放射性物 质标记的底物。
[0189] 作为试验样品，例如蛋白质、肽、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、植物提取 物、动物等组织提取物、细胞提取物等。在试验样品中使用的试验化合物的例子中最好含有 抗凝集素抗体、酶抑制剂、细胞因子、各种具有抑制活性的化合物、特别是合成化合物等。这 些化合物可以是新的化合物，也可以是众所周知的化合物。该筛选可以根据通常的结合活 性或酶活性的测定法实施，例如可以参考该领域中众所周知的方法等进行。另外，可以使用 各种标记、缓冲液系以及其它适当的试剂，可以按照在此说明的操作进行。使用的肽等可以 用活化剂进行处理，也可以预先将其前体或潜在型的前体变换为活性型的前体。测定通常 在Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液等对反应没有坏影响的那样缓冲液等中，例如在pH约 4?约10(优选pH约6?约8)中进行。当分别进行筛选时，在各个方法中的通常条件、操 作法中除了考虑同行通常技术外，可以构建与本发明的该半乳凝素9蛋白质或与其基本上 具有同等活性的多肽或肽有关的测定系。有关这些一般的技术手段的详细叙述可以参照综 述、出版的书等[例如、Methods in Enzymology Academic Press公司（USA)发行等]。另 夕卜，凋亡诱导活性测定法等可以参考田沼靖一监修、「细胞工程另册：实验程序系列、凋亡实 验程序」株式会社秀润社、1995年1月20日（第1版第2次印刷）等，也可以使用市售测 定试剂盒。
[0190] 使用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐是从上述的试验化合 物，例如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物 组织提取物等选择的化合物，是促进或抑制本发明的蛋白质等的功能的化合物。作为该化 合物的盐，如药学上容许的盐等。例如，与无机碱基的盐、与有机碱基的盐、与无机酸的盐、 与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。作为与无机碱基的盐的合适例子，如钠盐、钾 盐等碱金属盐、钙盐、镁盐等碱土金属盐、以及铝盐、铵盐等。作为与有机碱基的盐的合适例 子，如与三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2, 6-二碱基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇 胺、环己基胺、二环己基胺、N，N'_二苄基乙二胺等的盐。作为与无机酸的盐的合适例子，如 与盐酸、溴氢酸、硫酸、磷酸等的盐。作为与有机酸的盐的合适的例子，例如与甲酸、醋酸、丙 酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的 盐。而作为与碱性氨基酸的盐的合适例子，如与精氨酸、赖氨酸、组氨酸等的盐，作为与酸性 氨基酸的盐的合适的例子，如与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
[0191] 当将本发明的活性成分[例如（a)该半乳凝素9突变体多肽、其一部分的肽或它 们的盐、与其相关的肽等、(b)编码该半乳凝素突变体9或相关多肽的DNA等的核酸等、（c) 控制该半乳凝素9的问题活性的化合物（该半乳凝素9蛋白质的毒害细胞活性、凋亡诱导 活性、对正常细胞没有坏的影响，促进或抑制?阻碍起着所定功效的活性等现象、或促进或 抑制?阻碍组织或蛋白质的变质?过剩生产或分解现象达到生物学活性的化合物）或其 盐、（d)使用本发明发现的活性物质等]作为药物使用时，通常可以单独或与药理上容许的 各种制剂辅助剂混合后，作为药物组成物或药物制备物等给予。最好是以适合经口给药、局 部给药、或非经口给药等使用的制剂制备物的形态给药，根据目的也可以通过任一种给药 方式（也包括吸入法、或直肠给药）给药。
[0192] 另外，本发明的活性成分也可以配合各种药物、例如抗肿瘤剂（抗癌剂）、肿瘤转 移抑制剂、血栓形成抑制剂、关节破坏治疗剂、镇痛剂、消炎剂和/或免疫抑制剂使用，这些 制剂只要是具有有利的作用可以无限制地使用，例如可以从该领域中已知的制剂中选择。
[0193] 而作为非经口给药方式，可以包括局部、经皮、静脉内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔 内给药，也可以直接向患部给药，对于某些场合也适合。理想的是向包括人在内的哺乳动 物经口、或非经口（例如，细胞内、组织内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊 髓腔内、点滴法、注肠、经直肠、点耳、点眼或点鼻、齿、向皮肤或粘膜涂布等）给药。作为具 体的制剂制备物的形态，如溶液制剂、分散制剂、半固体制剂、粉粒体制剂、成型制剂、浸出 制剂等，例如片剂、包被片剂、加糖衣制剂、丸剂、口含片、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、埋 入剂、粉末剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、注射剂、液剂、酏剂、乳剂、灌注剂、糖浆、水剂、乳剂、悬 浊剂、擦剂、洗剂、气雾剂、喷雾剂、吸入剂、喷雾剂、软膏制剂、硬膏制剂、贴附剂、浴剂、湿润 齐U、膏剂、油剂、栓剂（例如直肠栓剂）、酊剂、皮肤用水剂、点眼剂、点鼻剂、点耳剂、涂布剂、 输液剂、用于注射用液剂等的粉末剂、冷冻干燥制剂、凝胶制备品等。
[0194] 药物用的组成物可以根据通常的方法进行制剂化。例如，根据适当的需要，可以单 独或组合使用生理学上认可的载体，作为药物容许的载体、佐剂、赋形剂、辅形剂、稀释剂、 香味剂、香料、甜味剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、结合剂、PH调节剂、缓冲剂、表面活性剂、基 齐IJ、溶剂、填充剂、增量剂、溶解辅助剂、可溶化剂、等渗剂、乳化剂、悬池化剂、分散剂、增粘 齐IJ、凝胶化剂、硬化剂、吸收剂、粘接剂、弹性剂、可塑剂、崩解剂、喷射剂、保存剂、抗氧化剂、 遮光剂、保湿剂、缓和剂、防止带电剂、无痛化剂等，通过将它们一起与本发明的蛋白质混 合，可以制造成一般认可的制剂实施中要求的单位用量形态。
[0195] 作为适于非经口使用的制剂，活性成分与水或其它的药学上容许的溶剂的无菌溶 液、或悬浊液剂等、例如注射剂等。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液、其它相关的糖的溶 液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等乙二醇类可作为理想的注射剂用的液体载体。制备注射剂时， 使用蒸馏水、林格液、生理盐水那样的载体、适当的分散剂或湿化剂和悬浊化液等，用该领 域已知的方法制备成象溶液、悬浊液、乳剂那样可以注射的形式。
[0196] 作为注射用的水性液，如包括生理盐水、葡萄糖或其它的辅助药（例如，D-山梨糖 醇、D-甘露糖醇、氯化钠等）等渗液等，也可以与药理上容许的适当溶解辅助剂、例如醇（例 如乙醇等）、聚醇（例如，丙二醇、聚乙二醇等）、非离子性表面活性剂（例如，聚山梨酯80?， HC0-50等）并用。作为油性液，如芝麻油、大豆油等，也可以与作为溶解辅助剂的苯甲酸苄 酯、苄酯醇等并用。另外，也可以与缓冲剂（例如，磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等）或用于 浸透压调节的试剂、无痛化剂（例如，杀藻胺、盐酸普鲁卡因等）、稳定剂（例如，人血清白 蛋白、聚乙二醇等）、保存剂（例如，苄醇、酚等）、抗坏血酸等抗氧化剂、吸收促进剂等配合。 制备的注射液通常被填充到适当的安瓿瓶中。
[0197] 对于非经口给药，可以加或不加表面活性剂以及其它药学上容许的助剂，做成水、 乙醇或油那样的无菌的药学上容许的液体中的溶液或悬浊液形式的制剂。作为制剂中使用 的油性载色剂或溶剂，如天然的、合成的或半合成的单、或双、或三甘油酯类、天然的、合成 的或半合成的油脂类或脂肪酸类，例如，花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如，该 注射剂可以按照含有〇. 1?10重量％程度的本发明化合物那样制备。
[0198] 作为适用于局部、例如口腔或直肠使用的制剂，例如洗口剂、磨齿剂、口腔喷雾剂、 吸入剂、软膏剂、牙科填充剂、牙科包被剂、牙科膏剂、栓剂等。作为洗口剂、其它牙科用剂， 可以使用药理上容许的载体，通过惯用的方法制备。作为口腔喷雾剂、吸入剂，使本发明化 合物本身或与药理上容许的非活性载体一起溶解于湿雾剂或喷雾器用的溶液，或做成吸入 用微粉末给予牙齿等。软膏剂，可以添加通常使用的基剂、例如软膏基剂（白色凡士林、石 蜡、橄榄油、聚乙烯二醇400、聚乙烯二醇软膏等）等，通过惯用的方法制备。
[0199] 向牙、皮肤局部涂布用的药品可以在适当灭菌的水或非水赋形剂的溶液或悬浊液 中配制、作为添加剂，如亚硫酸氢钠或乙二胺四乙酸二钠那样的缓冲剂；含有醋酸或硝酸苯 汞、氯化烷基二甲基苄基铵或双氯苯双胍己烷那样的灭菌和抗真菌剂的防腐剂和羟丙基甲 基纤维素（t ya ^ a - *)那样的增稠剂。
[0200] 栓剂使用在该领域中众所周知的载体、最好是非刺激性的适当的辅形剂、例如聚 乙二醇类、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等载体，最好是在常温下虽然是固体，但在肠道 的温度下为液体，在直肠内放出融解的药物的载体等，通过惯用的方法制备，通常按照含有 0. 1?95重量％程度的本发明化合物那样制备。由于使用的赋形剂和浓度不同，药品可以 悬浮于或溶解于赋形剂中。象局部麻醉剂、防腐剂以及缓冲剂那样的辅助药可以溶解于赋 形剂中。适于作为经口使用的制剂，如片剂、丸剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、口含片那样的固形 组成物，或液剂、糖浆、悬浊剂那样的液状组成物等。制备制剂时，使用在该领域中已知的制 剂辅助剂等。片剂和丸剂还可制造成被糖衣包被。调剂单位方式为胶囊时，可以在上述类 型的材料中再含有油脂那样的液状载体。
[0201] 另外，活性成分为蛋白质或多肽时，由于聚乙二醇（PEG)在哺乳动物中毒性极低， 所有与它结合特别有用。而与PEG结合，有时可以有效地减少异种性化合物的免疫原性以 及抗原性。该化合物也可以加入到微胶囊装置中给予。象PEG那样的聚合物可以简单地附 着于在氨基末端的氨基酸的a-氨基、赖氨酸侧链的e-氨基、天冬氨酸或谷氨酸的侧链的 羧基、羧基末端的氨基酸的a -羧基、或某种天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基的糖基链被活 化的衍生物上。
[0202] 已知有很多适于与蛋白质直接反应的活化形式的PEG。作为对与蛋白质的氨基 反应有用的PEG试剂，如羧酸、碳酸衍生物的活性酯、特别是解离基为N-羟基琥珀酰亚胺、 P-硝基苯酚、咪唑、或1-羟基-2-硝基苯-4-硫酸。同样，含有氨基肼或酰肼基的PEG在通 过蛋白质中的过碘化酸氧化生成的醛反应中有用。
[0203] 本发明的诊断和治疗为了能够适于也许哺乳动物表现出的特定的自身免疫等疾 患?疾病、包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性疾患、炎症等，通过对该哺乳动物进行诊断 开始实施的。为了监测治疗进行以及例如为了判断是否要对正在进行的治疗中的给予量 或给予次数那样的参数进行改变，作为治疗程序诊断可以在治疗期间继续进行。作为有助 于决定有关半乳凝素9突变体治疗药给予的适当性那样的诊断手法，如哺乳动物中半乳凝 素9表达水平的分析、和从自身免疫的部位分离的淋巴细胞等细胞与靠近自身免疫部位的 淋巴细胞等细胞之间的这些细胞水平的比较等。要治疗的哺乳动物的自身免疫疾患等疾 患?疾病、包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性疾患、炎症等通过检测细胞内的半乳凝素 9抗原可以进行监测。这样的监测包括使来自哺乳动物的样品与半乳凝素9特异的抗体接 触，然后检测与样品结合的抗体。
[0204] 基因治疗用载体是用于递送为了在哺乳动物中表达要被递送到哺乳动物的 本发明的治疗药的包括编码序列（例如、半乳凝素9突变体编码序列）在内的构建物 (construct)的载体，或用于递送半乳凝素9突变体的全部或部分，也包括用于递送的核酸 序列的该构建物的载体，可以通过局部或全身的任一种方法给予。这些构建物可以在体内 或体外，利用通过病毒载体的途径或非病毒载体形式的途径递送。为了表达这样的编码序 列，可以通过使用内源性的哺乳动物启动子或异种启动子诱导来进行。编码序列在体内的 表达可以是构建形式表达，或可调节地进行的任一种表达方式。当半乳凝素9突变体在哺 乳动物被表达时，可以以可溶性的半乳凝素9突变体表达，有时也可以以前体型半乳凝素9 突变体形式表达。在这两种表达形式中或其中的任一种形式中，它们可以是例如整个的半 乳凝素9突变体、或半乳凝素9突变体的生物学的活性部分、变异体、衍生物、或融合体等。
[0205] 本发明提供可以表达所要的半乳凝素9突变体的核酸序列的基因递送载体。作为 基因递送载体，优选病毒载体，更优选逆病毒、腺病毒、腺随伴病毒（AAV)、疱疹病毒、或甲病 毒等病毒载体等。作为病毒载体，如星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、 细小病毒、细小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒等病毒载体。关于该基因递送载体，一般 可参照D. Jolly, Cancer Gene Therapy, I (I) :51-64 (1994) ;0? Kimura et al.，Human Gene Therapy, 5:845-852(1994) ；S.Connelly et aI. , Human Gene Therapy, 6:185-193(1995)； M.G. Kaplitt et al.，Nature Genetics, 8:148-153 (1994)等。
[0206] 逆病毒载体在该领域都熟知的，例如、包括B型、C型、和D型逆病毒、xenotropic 逆病毒（例如、NZB-X1, NZB-X2, NZB9. I (R. R. 0' Neill, J. Virol.，53:100-106 (1985)参照） 等）、polytropic 逆病毒（例如、MCF，MCF-MLV(M. Kelly, J. Virol.，45:291-298(1983)参 照）等）、泡沫病毒、慢病毒等（参照R. L Weiss et al. (Eds.)，RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1985)在内的任意逆病毒 基因治疗载体在本发明中都可以使用。
[0207] 基因治疗逆病毒载体的一部分可以是来自不同逆病毒的部分。例如、逆载体的LTR 可以是来自大白鼠肉瘤病毒的，tRNA结合部位可以是来自罗斯肉瘤病毒的，包装信号可以 是来自大白鼠白血病病毒的，第二链合成起源可以是来自鸟白血症病毒的。这些重组逆病 毒载体通过将它们导入适当的包装细胞株，可用于能形成可转化的逆病毒载体粒子（参照 美国专利第5, 591，624号说明书）。逆病毒载体可以通过逆病毒粒子内带有的称之为整合 酶的具有的将目的DNA部位特异地整合到宿主细胞的DNA中的能力的重组酶进行构建。作 为重组病毒载体，最好是复制能力缺损重组病毒。
[0208] 作为适合使用上述逆病毒载体的包装细胞株，如该领域熟知的细胞株，而且容易 制备（参照美国专利第6, 013, 517号说明书，W092/05266)。该包装细胞株可以在用于产生 重组载体粒子的生产细胞株（载体细胞株，vector cell line:VCL)中使用。包装细胞株 最好是能够在人血清中不进行活化，由人的亲细胞（例如、HT1080细胞）或水貂的亲细胞 株制作。
[0209] 作为逆病毒基因治疗载体构建中理想的逆病毒，如鸟白血症病毒、牛白血病病毒、 大白鼠白血病病毒、水貂细胞灶形成病毒、大白鼠肉瘤病毒、网状细胞内皮症病毒、罗斯肉 瘤病毒等。作为大白鼠白血病病毒特别优选的，例如、4070A和1504A (HartIey&Rowe，J. VirolO.，19:19-25(1976))、Abelson(ATCC No. VR-999)、Friend(ATCC No. VR-245)、 Graffi, Gross (ATCC No. VR-590)、Kirsten、Harvey 肉瘤病毒和 Rauscher (ATCC No. VR-998)、 以及莫洛尼小鼠白血病病毒（ATCC No. VR-190)等。
[0210] 这样的逆病毒可以从美国典型培养物保藏所（ATCC, Rockville, Maryland, USA) 那样的保藏机构或保存机构获得，或使用通常可利用的技术由已知的供给源分离。
[0211] 作为在本发明可使用的众所周知的逆病毒基因治疗载体的例子，如GB 2200651,EP 0415731,EP00345242, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03662, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 93/10218, WO 91/02805、美国专利第 5, 219, 740 号说明书、同第 4, 405, 712 号说明书、同第4, 861，719号说明书、同第4, 980, 289号说明书、同第4, 777, 127号 说明书、同第 5,591,624 号说明书、Vile, Cancer Res, 53:3860-3864(1993)，Vil e,Cancer Res,53:962-967 (1993), Ra, Cancer Res, 53:83-88(1993), Takamiya, J Neurosci Res,33:493-503(1992), Baba, J Neurosurg,79:729-735 (1993), Mann, Cel I 33:153(1983), Cane, Proc Natl Acad Sci USA, 81:6349(1984), Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14(1990)等记载的例子。
[0212] 人的腺病毒基因治疗载体在该领域中也是众所周知的，可在本发明中使用，例如 可以参照 Berkne, Biotechniques, 6:616 (1988) ;Rosenfeld, Science, 252:431 (1991) ;W0 93/07283 ;W0 93/06223 ;W0 93/07282等。作为可在本发明中使用的已知的腺病毒基因 治疗载体例子，如上述参考文献所述的，例如、WO 94/12649 ;W0 93/03769 ;W0 93/19191; WO 94/28938 ；W0 95/11984 ；W0 95/00655 ；W0 95/27071 ；W0 95/29993 ；W0 95/34671； WO 96/05320 ；W0 94/08026 ；W0 94/11506 ；W0 93/06223 ；W0 94/24299 ；W0 95/14102； WO 95/24297 ；W0 95/02697 ；W0 94/28152 ；W0 94/24299 ；W0 95/09241 ；W0 95/25807 ； TO 95/05835 ;W0 94/18922 ;W0 95/09654 等所述的例子。另外，就像 Curiel, Human Gene Therapy，3:147-154(1992)所述那样，也可以给予连接在灭活的腺病毒的DNA。
[0213] 另外作为本发明的基因递送载体，如腺病毒随伴病毒（AAV)载体。这样的载体中 用于本发明的理想例子，如象WO 93/09239公布的那样源于AAV-2的载体。作为最理想的 AAV载体，是含有2个AAV的逆末端反复序列的载体。该载体天然的D序列由于核苷酸置 换被改变，其结果应当至少还维持着5个天然型核苷酸和直至18个天然型核苷酸（优选 至少10个天然型核苷酸和直至18个天然型核苷酸、最优选10个天然型核苷酸），D序列 剩下的核苷酸缺失，或被非天然型的核苷酸置换。AAV逆末端反复领域的天然型D序列是 在各AAV逆末端反复序列中含有20个连续核苷酸的序列（即在各末端存在一个序列），该 序列与HP形成无关。非天然型置换的核苷酸可以是与在同一部位天然型的D序列中发现 的核苷酸不同的任意的核苷酸。作为其它的可使用的AAV载体的例子，如pWP-19、pWN-1 等（Nahreini, Gene, 124:257-262(1993))。作为这样的 AAV 载体的其它例子，如 psub201 等（Samulski，J. Virol. ,61:3096 (1987))。作为其它的 AAV 载体例子，如 Double-D ITR 载 体等。制作Double-D ITR的方法如美国专利第5, 478, 745号说明书公布的方法。此外， AAV载体如美国专利第4, 797, 368号说明书、同第5, 139, 941号说明书、同第5, 474, 935号 说明书、WO 94/288157号等公布的载体。作为可在本发明利用的另外的AAV载体例子，如 SSV9AFABTKneo，该载体含有AFPO增强子和白蛋白启动子，而且倾向于在肝脏中优先表达。 其结构和制作方法如Su，Human Gene Therapy, 7:463-470(1996)公布的方法。作为其它 的AAV基因治疗载体，如美国专利第5, 354, 678号说明书、同第5, 173, 414号说明书、同第 5, 139, 941号说明书、同第5, 252, 479号说明书等记载的载体。
[0214] 本发明的基因治疗载体可以是疱疹载体。作为主要的疱疹载体的理想例子， 如含有编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶多肽序列的单纯疱疹病毒载体（例如、美国专利 第5, 288, 641号说明书和EP 0176170公布的载体）。作为单纯疱疹病毒载体的例子 如 WO 95/04139 等公布的 HFEM/ICP6-LacZ, Geller, Science, 241:1667-1669 (1988)、 W090/09441、W0 92/07945 等记载的 pHSVlac, Fink, Human Gene Therapy, 3:11-19 (1992)记 载的 HSV Us3: :pgC-lacZ、EP 0453242 A 记载的 HSV7134, 2RH 105 和 GAL4、以保藏号 ATCC VR-977和ATCC VR-260寄托于ATCC的载体等。
[0215] 在本发明中也可以使用甲病毒基因治疗载体。作为理想的甲病毒载体，如新培斯 病毒载体、披膜病毒、Semliki Forest 病毒（ATCC VR-607;ATCC VR-1247)、Middleberg 病 毒（ATCC VR-370)、Ross River 病毒（ATCC VR-373;ATCC VR-1246)、委内瑞拉马脑炎病 毒（ATCC VR923 ;ATCC VR-1250 ;ATCC VR-1249 ;ATCC VR-532)、美国专利第 5, 091，309 号、 同第5, 217, 879号、和WO 92/10578记载的载体等。另外作为可使用的甲病毒载体，如美 国专利第5, 091，309号说明书、同第5, 217, 879号说明书、同第5, 843, 723号说明书、同第 6,376,236号说明书、恥94/21792、恥92/10578、恥95/07994等记载的载体。这样的甲病 毒可以从ATCC(Rockville, Maryland, USA)那样的保藏机构或保存机构获得，或使用通常 可利用的技术从已知的供给源分离。最好是能够使用细胞伤害性可降低的甲病毒载体（参 照美国专利第6, 391，632号说明书）。
[0216] DNA载体系（例如、真核生物级联式表达系（eukarytic layered expression system)等）在用于表达本发明的半乳凝素9突变体的核酸中是有用的。有关真核生物级 联式表达系的详细情况可以参照W095/07994。作为本发明的真核生物级联式表达系最好是 来自甲病毒载体的，优选来自新培斯病毒载体的表达系。
[0217] 作为适合本发明使用的其它病毒载体，如来自脊髓灰质炎病毒（例如、ATCC VR-5 8, Evans, Nature, 339:385 (1989)，Sabin, J. Biol. Standardization, 1:115 (1973)等记载的 病毒等）；鼻病毒（例如、ATCC VR-IllO和Arnold, J. Cell Biochem, L401-405(1990)记载的 病毒等）；痘病毒（例如、金丝雀痘病毒等）或痘苗病毒（例如、ATCC VR-111，ATCC VR-2010 等、Fisher-Hoch，Proc Natl Acad Sci USA，86:317(1989)，Flexner，Ann NY Acad Sci， 569:86 (1989)，Flexner, Vaccine, 8:17 (1990)、美国专利第 4, 603, 112 号说明书以及同第 4, 769, 330号说明书、和WO 89/01973中记载的病痘毒等）；SV40病毒（例如、ATCC VR-305 和 Mulligan, Nature, 277:108 (1979)和 Madzak, J. Gen. Vir, 73:1533 (1992)中记载的病毒 等）；流感病毒（例如、ATCC VR-797等）、使用美国专利第5, 166,057号说明书411&1^，？1'〇(3 Natl Acad Sci USA, 87:3802-3805(1990), Enami & Palese1J Virol, 65:2711-2713(1991 ),Luytjes, Cell, 59:110(1989), McMicheal., N E J Med, 309:13(1983), Yap, Nature, 273: 238 (1978)、以及Nature, 277:108 (1979)等中记载的那样的逆遗传学技术制作的重组流感 病毒；EP 0386882、Ruchschacher, J. Vir.，66:2731 (1992)等记载的人免疫不全症病毒；麻 疹病毒（例如、ATCC VR-67，VR-1247以及EP 0440219记载的病毒等）；奥拉病毒（例如、 ATCC VR-368 等）；Bebaru 病毒（例如、ATCC VR-600 和 ATCC VR-1240 等）；Cabassou 病 毒（例如、ATCC VR-922 等）；奇昆贡亚病毒（例如、ATCC VR-64, ATCC VR-1241 等）；Fort Morgan 病毒（例如、ATCC VR_924 等）；Getah 病毒（例如、ATCC VR_369, ATCC VR-IM3 等）；Kyzylagach病毒（例如、ATCC VR-927等）；马亚罗病毒（例如、ATCCVR-66等）；穆 茨布病毒（例如、ATCC VR-580，ATCC VR-1244等）；恩杜姆病毒（例如、ATCC VR-371等）； Pixuna病毒（例如、ATCC VR-372，ATCC VR-1245 等）Jonate 病毒（例如、ATCCVR-925 等）； Triniti 病毒（例如、ATCC VR-469 等）；Una 病毒（例如、ATCC VR-374 等）；Whataroa 病 毒（例如、ATCC VR-926 等）；Y-62-33 病毒（例如、ATCC VR-375 等）；0' Nyong 病毒、东部 脑炎病毒（例如、ATCC VR-65，ATCC VR-1242等）；西部脑炎病毒（例如、ATCC VR-70，ATCC VR-125L, ATCC VR-622, ATCC VR-1252 等）；冠状病毒（例如、ATCC VR-740, Hamre, Proc Soc Exp Biol Med, 121:190(1966)记载的病毒）的载体等。
[0218] 将本发明的组成物向细胞递送不限定于上述的病毒载体。也可以使用其它的 递送方法和媒体，作为这样的方法和媒体，例如核酸表达载体、只与灭活的腺病毒连结的 多阳离子性复合体DNA(例如参照Curiel, Hum Gene Ther, 3:147-154(1992))、配位体连 结DNA (例如参照Wu，J Biol Chem, 64:16985-16987(1989))、真核生物细胞递送载体细胞 (例如、参照美国专利第6, 013, 517号说明书、同第6, 015, 686号说明书等）、光聚合的水 凝胶物质沉淀物、象美国专利第5, 149, 655号说明书记载的那样的携带型基因导入粒子 枪、W092/11033记载的电离放射线法、核电荷中和法、或与细胞膜的融合法等。另外作为手 法如 Philip，Mol Cell Biol, 14:2411-2418(1994)，Woffendin，Proc NaOOOOtl Acad Sci USA, 91:1581-585 (1994)记载的方法等。
[0219] 也可以使用粒子媒介基因转移技术，序列被插入到用于高水平表达的含有惯用 的调控序列的通常载体，然后与被连接在合成基因转移分子（例如、细胞靶配位体（例 如、Wu et al.，J. Biol. Chem. ,262:4429-4432(1987)记载的那样的脱唾液酸类黏蛋白、 Hucked, Biochem Pharmacol, 40:253-263 (1990)记载那样的膜岛素、Plank, Bioconjugate Chem，3:533-539(1992)记载的那样的半乳糖、乳糖、或铁传递蛋白等）的聚赖氨酸、鱼精蛋 白、和白蛋白那样的聚合性DNA结合阳离子温育。
[0220] 也可以使用裸DNA，例如、作为裸DNA的导入方法如WO 90/11092和美国专利第 5, 580, 859号说明书记载的方法等。收率使用生物降解性乳胶珠可以改善。DNA包被乳胶 珠，该珠被胞饮后可有效地输送到细胞内。该方法使疏水性增大，由此通过使包裹小泡破裂 和使DNA释放到细胞质那样的珠处理可以进一步改善。
[0221] 作为基因递送载体可以起作用的那样脂质体如美国专利第5, 422, 120号说明书、 WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/144445 和 EP 524, 968 记载的。在非病毒的递送法中， 编码半乳凝素9突变体多肽的核酸序列可以被插入到用于高水平表达的通常含有调控序 列的惯用的载体，然后与合成基因导入分子温育。作为该合成基因导入分子，例如与细胞靶 的配位体（例如、脱唾液酸血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖、铁传递蛋白等）连接的聚 合性DNA结合阳离子。作为聚合性DNA结合阳离子，例如、聚赖氨酸、鱼精蛋白、白蛋白等。 作为其它的递送系，例如可以使用用于将含有多种组织特异的或普遍活性的启动子调控下 的基因的DNA胶囊化的脂质体。作为适合使用的非病毒的递送法，如机械递送系（例如、 WofTendin et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (24) :11581-11585 (1994)记载的手法）。
[0222] 另外编码序列和这样的表达产物可以通过光聚合的水凝胶物质的沉淀递送。作为 可用于递送编码序列的基因递送的其它方法，例如、使用美国专利第5, 149, 655号00说明 书记载的携带型基因导入粒子枪的方法、WO 92/11033记载那样的为了对导入的基因进行 活化使用电离放射线的方法等。
[0223] 作为脂质体和多阳离子性基因递送载体的例子，如美国专利第5, 422, 120号说 明书和同第 4,762,915 说明书、恥 95/13796，恥94/23697，恥 91/14445，￡? 0524968,3 tryer, Biochemistry, 236-240 (1975),ff.H.Freeman et al. , Biochem Biophys Acta,600:I (1980), Bayer, Biochem Biophys Acta,550:464(1979), Rivnay, Meth Enzymol,149:119(1987), Wang, Proc Natl Acad Sci USA,84:7851 (1987), Plant, Anal OBiochem, 176:420(1989)等记载的载体。
[0224] 本发明公布了对陷于包含包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性疾患、炎症、免疫 异常、活化淋巴细胞（特别是活化T细胞，也可包括活化B细胞）的自身免疫疾患等疾患和 疾病的哺乳动物通过给予半乳凝素9突变体或来自半乳凝素9突变体的治疗剂（例如、作 为治疗活性成分含有半乳凝素9突变体多肽或用于在哺乳动物中表达的编码半乳凝素9突 变体多肽的聚核苷酸等的组成物）进行治疗的方法。作为可以通过本发明的方法和组成物 治疗的自身免疫疾患，如任意的自身免疫疾患或移植排斥（例如、包括本说明书中列举的 自身免疫疾患，但不限定于这些）。
[0225] 半乳凝素9突变体例如可以以通过重组技术表达的多肽、或半乳凝素9突变体多 肽的突变体、其衍生物、或它的融合蛋白质形式给予，可以通过局部或全身任一种方式递送 给哺乳动物。编码半乳凝素9突变体、半乳凝素9突变体的衍生物或突变体、或半乳凝素9 突变体融合体的核酸（DNA、RNA等）在基因治疗程序中可以以包含用于在哺乳动物中表达 的调节区的裸质粒DNA形式，或通过用于在哺乳动物中表达的病毒载体给予。用于表达的 半乳凝素9突变体多肽的递送可以使用使递送变得容易的那样的药学上容许的载体完成。 对有自身免疫疾患的哺乳动物用来自半乳凝素9突变体的治疗剂进行治疗后，可以使自身 免疫疾患改善或缓解，或使起因于自身免疫的临床症状消失。
[0226] 本发明不受本发明公开的治疗剂怎样起作用的理论限定，而是应当由引起自己识 另IJ，然后伤害自身免疫的活化T细胞等决定。通过表达半乳凝素9突变体，或是使半乳凝素 9突变体表达，或给予来自半乳凝素9突变体治疗剂，有问题的活化淋巴细胞受到可利用的 半乳凝素9突变体的影响，优先成为靶子，进行凋亡。半乳凝素9突变体多肽或来自半乳凝 素9突变体治疗剂可以投到表现出自身免疫的区域（例如、进行治疗的表现出特定自身免 疫疾患特征那样的局部区域）。由此，给予的半乳凝素9突变体以及其它治疗剂与在该区域 的细胞表达的具有靶标的活化T细胞等之间的接触被最适化。因此，该区域的细胞成了借 助于基因递送载体的帮助被投到该区域的编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸表达时 的良好的候补。由此对本发明进行各种变更、运用，按照能够使半乳凝素9突变体多肽表达 那样进行操作，可以在处于被活化T细胞等攻击下的细胞中进行表达。对于移植排斥的场 合，例如与能够结合很多细胞型的在细胞表面上遍在表达的蛋白质的分子结合部融合的半 乳凝素9突变体多肽。该结合部分，例如可以是肝素，而结合的细胞表面上的分子也可以是 葡糖胺聚糖。另外该结合部分也可以是对任意选择的细胞表面抗原特异的单链抗体的结合 结构域。
[0227] 关于本发明，对于包括癌等恶性肿瘤细胞在内的肿瘤细胞获得细胞伤害作用，或 获得抗变态性作用，或获得抗炎症作用，或使免疫异常正常化，对于活化淋巴细胞（特别是 也可以包括活化T细胞）诱导凋亡的场合都应当与上述自身免疫的场合同样理解。
[0228] 本说明书中使用的「给药」或「进行给药」指的是将治疗剂或治疗剂的配合物递送 到哺乳动物的过程。给药过程可以因治疗剂（单个或多个的治疗剂）和所期望的效果不同 进行改变。给药可以通过例如非经口的递送或经口的递送等适合治疗剂的任意手段完成。 作为非经口的递送，例如向皮下、静脉内、肌肉内、动脉内递送、向器官组织的注射、通过粘 膜、肺、局部的或通过导管递送等。经口的手段是经由口给药的手段，例如、可以使用片剂或 其它经由胃肠的递送手段（包括可饮用的液体）等进行。作为经由粘膜的递送，例如鼻腔 内递送等。作为经由肺的递送，可以使药剂吸入。给药一般来说也可以通过使用药学上容 许的载体（例如、缓冲液、多肽、肽、云芝多糖缀合物、脂质体、脂等）递送进行。基因治疗程 序包括作为治疗剂认为可以给予在哺乳动物以转录物或多肽形式表达时能够达到治疗目 的聚核苷酸的场合，也可适用于非经口的递送手段和经口的递送手段中任一种手段。这样 的给药手段可以按照适合治疗的疾患情况进行选择。例如，疾患为器官基底的场合，递送可 以是局部递送，例如，疾患为全身的场合，递送可以是全身的。所谓联合用药指的是在对某 患者的治疗中再给予一种或一种以上的治疗剂。治疗剂可以使用同样的药学的载体给予， 或也可以使用不同的载体给予。这些载体可以通过同样的或不同的给予手段给予。药剂可 以是同型的药剂，或不同型的药剂，例如、作为不同型，如聚核苷酸、多肽、或低分子的药剂。 给药时间可以是恰好同一时间，1种治疗剂也可以在另外的药剂之前或之后给药。因此联合 用药可以同时，也可以连续进行。用于将治疗剂做成所定的组合的正确程序可以在考虑药 剂和按照其它考虑已治疗的状态后决定。
[0229] 所谓用语「体内给药」指的是为了在哺乳动物中表达，将编码多肽的聚核苷酸投给 患者（例如、哺乳动物）。特别是作为直接的体内给药，如细胞不从哺乳动物取出，而是通过 编码序列转染哺乳动物细胞。因此作为直接的体内给药，为了在患者细胞中发生表达，可以 直接将编码目的多肽的DNA直接注射到陷于自身免疫疾患烦恼的区域。
[0230] 用语「体外给药」指的是将细胞从患者（例如、哺乳动物）中取出后，对细胞（例 如、来自于处于自身免疫攻击下的细胞集団的细胞）进行转染处理。转染后，细胞被返回到 哺乳动物。体外给药是将细胞从哺乳动物取出，根据需要，选择要转化的细胞（即受到自身 免疫机构攻击下的细胞），要将被选择的细胞做成不能复制，将选择的细胞用编码要表达的 基因（即半乳凝素9突变体）的聚核苷酸（为了使表达容易进行也可含有调节区域）进行 转化，为了使半乳凝素9突变体表达，通过将被转化的细胞返回到患者达到。
[0231] 作为治疗的有效量，指的是产生所期望的治疗结果那样的量。例如、当所期望的治 疗效果是自身免疫治愈时，所谓的治疗的有效量指的是容易达到治愈的那样的量。所谓治 疗上有用的量可以是例如、在包括数日或数周间给药那样的投药程序中投给的那样的量。 治疗效果，例如在自身免疫疾患的症状出现期间，可以使哺乳动物的自身免疫应答的影响 降低时在哺乳动物中用于获得这样效果的药剂的有效量指的是造成自身免疫的症状减少 那样的量。
[0232] 用语「药学上容许的载体」指的是用于给予治疗剂（例如、多肽、聚核苷酸、低分 子、肽性物质、肽等）载体,载体本身不诱导接受组成物的个体产生有害的抗体,而且不能 产生有问题那样的毒性，可以给予的那样的任意的药学上容许的载体。在本发明的另外方 式中，提供与药学上容许的载体或稀释剂组合，含有上述那样的重组病毒载体的药学的组 成物。这样的药学的组成物可以是液体溶液形式的组成物，或制备成在给予前可悬浮于溶 液的固体形式（例如、冷冻干燥的产品）。另外，该组成物也可以使用适合于给予表面，或 注射，或经口给予，或经直肠给予的载体或稀释剂进行制备。作为药学上容许的载体或稀释 齐U，在使用的给予量和浓度下对接受者（recipient)基本上是无毒的。作为用于可注射的 溶液的载体或稀释剂的代表例子，如水、等渗生理食盐水溶液（理想的是在生理PH下具有 缓冲的溶液、例如、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水等）、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙 醇、多肽或蛋白质（例如、人血清白蛋白）等。载体或重组病毒可以加入到含有lOmg/ml甘 露醇、lmg/ml HSA、20mM Tris(pH7. 2)、和150mM NaCl的药学的组成物后进行递送。此时重 组载体约为Ig物质，高分子物质不到1 %，总物质量（包括水）在1/100, 〇〇〇以下。该组成 物至少了在20°C下稳定6个月间。
[0233] 本发明的药学的组成物可以含有刺激细胞分裂的因子，因此可以含有整合重组逆 病毒载体，刺激组合的因子。重组病毒的保存法可以参照美国专利第5, 792, 643号说明书 记载的保存法。
[0234] 用于实施本发明提供的治疗法的所有治疗剂可以加入到含有治疗药用的药学上 容许的载体的适当的药学组成物。用于治疗药的药学载体可以是同样的，也可以因各个治 疗药不同而不一样。作为合适的载体，可以是大的、而且代谢缓慢的巨大分子（例如、蛋白 质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、粒子中的不活性病毒等）。这样的 载体对于同行众所周知。
[0235] 作为药学上容许的盐，例如无机酸盐（例如盐酸盐、溴氢酸盐、磷酸盐、硫酸盐 等）；有机酸盐（例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等）），这些盐可以加入到该 组成物后使用。有关药学上容许的赋形剂可以参照例如Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.，N. J.，USA, 1991)。作为治疗组成物中的药学上容许的载体，例如 水、生理盐水、甘油糖、乙醇等液体。作为助剂，例如湿润剂、乳化剂等，也可以将pH缓冲物 质等加入到这样的载体中。代表性的治疗组成物可以制备成可以注射的任一种液体溶液或 悬浮物；在注射前制备成可以使用液体载体适合做成液体或悬浮物的固体形态载体。在药 学上容许的载体的定义内也包含脂质体。
[0236] 还可以提供与药学上容许的载体或稀释剂组合，包含有重组逆病毒或一个上述的 载体构建物的病毒的药学组成物。该组成物可以制备成液体溶液或在给予前可悬浮于溶液 的固体形式（例如、冷冻干燥的产品）中任一种。另外，该组成物也可以使用适合于给予表 面，或注射，或经口给予，或经直肠给予的载体或稀释剂进行制备。
[0237] 作为药学上容许的载体或稀释剂，在使用的给予量和浓度下对接受者 (recipient)基本上是无毒的。作为用于可注射的溶液的载体或稀释剂的代表例子，如水、 等渗生理食盐水溶液（理想的是在生理pH下有缓冲作用的溶液、例如、磷酸缓冲生理盐水、 Tris缓冲生理盐水等）、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白质（例如人血清白蛋白） 等。载体或重组病毒可以加入到含有lOmg/ml甘露醇、lmg/mlHSA、20mM Tris(pH7.2)、和 150mM NaCl的药学组成物后进行递送。此时重组载体约为Ig物质，高分子物质不到1 %， 总物质量（包括水）在1/100, 〇〇〇以下。该组成物至少了在20°C下稳定6个月间。
[0238] 药学上容许的载体或稀释剂为了能够做成液体溶液或给药前能够悬浮于溶液的 固体方式（例如、冷冻干燥的方式）中的任一种方式的组成物，可以与基因递送载体组合。 2个以上的基因递送载体可以借助于代表性的传统的直接途径例如颊/舌下、直肠、经口、 经鼻、局部（例如、经皮和眼等）、阴道、肺、动脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、眼内、鼻腔内、或 静脉内），或间接给药。
[0239] 本发明的治疗药可以任意地含有例如用于在哺乳动物中表达的聚核苷酸，该治 疗药可以根据该领域中众所周知的方法，制作成肠溶性片剂和胶囊剂等制剂。这些可以 参照以下的专利：例如、美国专利第4, 853, 230号说明书、EP 225, 189、AU 9, 224, 296、AU 9, 230, 801、和WO 92144, 52等。这样的胶囊可以经口给予，以肠为靶。经口给药后1?4 日，通过使用抗该蛋白质的抗体等测定血浆和血液决定例如多肽的表达是否在进行，或例 如是否发生由核酶或反义寡核苷酸引起的表达被抑制。
[0240] 基因递送载体可以象例如美国专利第4, 411，648号说明书、同第5, 222, 936号说 明书、同第5, 286, 254号说明书、WO 94/05369等记载的那样，通过例如注射、粒子枪、局部 给药、非经口给药、吸入、或离子导入递送等导入哺乳动物。
[0241] 治疗组成物或治疗剂也可以与能够改善包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性 症、炎症、免疫异常、自身免疫疾患那样的其它治疗剂、或能够增强给予半乳凝素9突变体 治疗剂获得的治疗上利益那样的其它治疗剂一起给予。例如、在为了治疗变态性反应给予 时，为了能够在存在于粘膜、鼻、支气管、肺等组织的细胞中表达，可以给予半乳凝素9突变 体聚核苷酸的气雾，为了更有利，例如在变态性反应平息之前的期间，每日数次、通过鼻用 喷雾或气雾喷雾反复给药。
[0242] 基因递送载体可以直接给到哺乳动物的单一部位或多个部位，例如可以通过直接 注射给予。基因递送载体也可以使用通过体外转化导入的靶细胞给予。本发明还提供适合 基因递送载体给予的药学组成物（包括例如各种赋形剂）。
[0243] 可以将半乳凝素9突变体多肽、其突变体、衍生物、类似物、变异体、或指示嵌合表 达的载体构建物直接给予包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤部位、表现出变态性的部位、炎症 部位、表现出免疫异常的部位、表现出自身免疫的部位（例如、胰脏、肾脏、肝脏、关节、脑、 脊髓液、皮肤、或身体其它区域或器官）。为了直接给予载体构建物，在本发明的范围内可以 使用各种各样的方法。例如、如果已鉴定有在某区域起作用的动脉的话，为了直接将载体递 送到该部位，可以注射到这样的动脉中。同样通过使用例如含有载体构建物的局所用药剂 组成物，可以将载体构建物直接给到皮肤表面。
[0244] 在直接给药中，可以将半乳凝素9突变体治疗剂和含有其它的抗自身免疫药剂的 配合治疗剂一起给予。联合用药可以同时进行，例如，通过在同一载体中放置编码药剂的聚 核苷酸，不管是聚核苷酸、多肽、其它的药物，将药剂加入到同一药剂组成物中，或可以在几 乎同一时间，几乎同一位置将药剂加入到可以注射的其它的药剂组成物中然后给予可以完 成联合用药。不同时进行联合用药时（例如，给予药物前体激活剂后，给予药物前体那样的 场合）、第2个药剂为了适合治疗目的，可以通过直接注射给药。因此，象例如给予药物前体 那样的场合，药物前体应当给到与药物前体激活剂同一部位。因此作为联合用药程序，可以 含有用于达到治疗目的的给药组合。另外，联合用药根据需要，可以包括之后给药（例如， 反复进行体内直接注射给予半乳凝素9突变体治疗那样的方式）。
[0245] 本发明中，取出的细胞应当理解为能够返回到同一动物或另外的同种异系的动物 或哺乳动物的细胞。这样的场合，一般来说，组织适合性最好是符合该动物（并非限定于此， 例如参照 Yamamoto et al.，AIDS Research and Human Retroviruses, 7:911-922(1991); Yamamoto et al. , Journal of Virology, 67:601-605(1993))〇
[0246] 可以从患者的各个部位取出细胞。另外在本发明的其它的实施方式中，可以将载 体构建物导入到例如来自皮肤的细胞（皮肤成纤维细胞等）或来自血液的细胞（例如、夕卜 周血白细胞等）。可以从血液特异取出所期望的、细胞的特定级分（例如、T细胞部分集合 或干细胞等）（参照例如、WO 91/16116)。然后利用任意的上述技术使取出细胞与载体构建 物接触，然后将该细胞返回到温血动物（最好是表现出自身免疫的区域付近或付近内）。
[0247] 例如一旦对哺乳动物等患者进行诊断，进行包括给予半乳凝素9突变体治疗剂， 或按照适于治疗的特定疾患?疾病（例如、肿瘤、变态性、自身免疫疾患等）的手法和用量 将该治疗剂给予哺乳动物，以及为了决定有无必要连续给予治疗剂或修正给予进行监测哺 乳动物等在内的本发明的实施。本发明中所谓实施包括对治疗的疾患进行鉴定，决定可适 用于靶基因治疗的有希望细胞型或身体区域。构建半乳凝素9突变体聚核苷酸（含有用于 在哺乳动物中表达的调节区域的质粒、或含有用于表达的病毒载体），取出一些哺乳动物细 胞，再用编码半乳凝素9突变体的聚核苷酸进行转染处理，然后为了使半乳凝素9突变体表 达，加入到哺乳动物中。或者，聚核苷酸例如为了在疾患清楚的区域中进行表达可以投给哺 乳动物。
[0248] 因此，例如对于恶性肿瘤细胞的场合，通过在体内或体外使用半乳凝素9突变体 可以对患部组织或脏器等肿瘤细胞进行转染处理。另外，例如对于慢性关节炎风湿病的场 合，可以在体外使用半乳凝素9突变体对由关节液得到的细胞进行转染。
[0249] 例如在多发性硬化症治疗中，可以向受到影响的脑区域注射半乳凝素9突变体， 也可以使半乳凝素9突变体在处于自身免疫反应型的活化T细胞等攻击的细胞中容易表 达。另外一个例子，对于多发性硬化症的场合，半乳凝素9突变体DNA可以局部注射于哺乳 动物脑中，也可以取出来自脊髓液的细胞，将它用半乳凝素9突变体DNA进行转染处理，返 回到脊髓区域。作为另外的例子，为了治疗具有肖格伦综合征的哺乳动物，作为该疾病的靶 器官，也可以选择适于通过注射给予半乳凝素9突变体多肽的方式。另外对于患有肖格伦 综合征的哺乳动物，也可以对罹患器官（例如、肾脏等）进行鉴定，直接将半乳凝素9突变 体DNA给到该器官，也可以取出来自器官的细胞，进行转染处理，然后返回到身体使半乳凝 素9突变体在哺乳动物的这些细胞中表达。
[0250] 例如予防移植排斥时，接受移植的动物由于象对外来细胞、外来组织、或外来器官 进行攻击那样捕杀活化患者细胞，所以可以局部或全身给予半乳凝素9突变体治疗剂，为 了能够暂时对患者身体内器官进行保护，在移植开始前也可以使半乳凝素9突变体多肽在 器官外表面上的细胞中进行表达。接受移植的人的免疫系在顺应外来细胞、外来组织、或外 来器官之前期间，连续给予半乳凝素9突变体治疗剂大概是很有必要的。
[0251] 预期半乳凝素9突变体治疗剂具有类似于天然半乳凝素9的作用。为了引起凋亡 反应可以使用半乳凝素9突变体治疗剂。因此，在临床医疗中，为了达到凋亡，应当可以从 化学计量上知道需要表达或给予哺乳动物的半乳凝素9突变体量。就本发明的其它方式来 说，本说明书中公开的载体构建物当然也可以指示来自非载体的基因的表达。例如，与适于 与半乳凝素9突变体一起给予的药物前体系可以起到用于基因治疗的安全机构的作用，也 可以用作并用治疗剂。
[0252] 也可以使药物前体激活剂与半乳凝素9突变体一起在载体中表达，确保安全机 构。如果决定该活化系应当被停止，给予药物前体，使该药物前体激活剂活化。通过这样治 疗，可以赋予临床医治基因治疗期间的调控手段。药物前体激活剂/药物前体系可用于哺 乳动物（例如、自身免疫由于半乳凝素9突变体表达恶化的那样场合）中转染细胞的钝化。 药物前体激活剂/药物前体系为了能够使用通过该系提供的药物前体活化的细胞伤害作 用，可以进行组合治疗，或在治疗剂中并用给予使用。
[0253] 包括与药物前体激活剂和药物前体一起给予编码半乳凝素9突变体多肽的聚核 苷酸的治疗可以是免疫调节性的治疗。所谓免疫调节性指的是引起性质或效力与因子不存 在下发生的免疫应答不同的免疫应答的因子的使用，该因子可以是与免疫应答有关的一个 以上细胞制造的，也可以外源添加到细胞的因子。应答的性质或效力可以通过同行众所周 知的各种分析（例如、测定细胞增殖（例如、 3H胸腺嘧啶脱氧核苷的換入）的体外分析和体 外细胞伤害分析（包括例如测定51Cr的释放））进行测定（参照Warner et al.，AIDS Res. and Human Retroviruses, 7:645-655(1991))。作为免疫调节因子，是在体内和体外都具有 活性的因子。这样的因子的代表例如细胞因子（例如、白介素2, 4, 6, 12和15)、a干扰素、 3干扰素、Y干扰素、GM-CSF、G-CSF、和肿瘤坏死因子（TNF)等。作为其它的免疫调节因 子，例如 CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, MHC 类 I 分子，MHC 类 II 分子、P 2-巨球蛋白、 伴侣、其类似物等。而且当基因递送载体不表达作为细胞因子的免疫调节辅因子时，该细胞 因子可以包含在上述的组成物中，与上述的组成物同时或延后给予。需要时，在这样的实施 方式中，免疫调节补因子最好是根据该领域中已知的标准的程序和给药量给予。例如、a干 扰素在2?4个月间可以按照100?500万单位/日给药量给予，而IL-2可以在2?12 周间，按照1?3次/日、10, 000?100, 000单位/kg体重的给药量给予。Y干扰素例如 为了通过给予半乳凝素9突变体达到更有效的治疗，为了在活化T细胞中对问题基因的表 达进行正调节，可以按照2?12周间、2?3次/周、150, 000?1，500, 000单位的给药量 给予。
[0254] 在并用治疗剂中，药物前体激活剂也可以由该激活剂的载体表达，也可以由与半 乳凝素9突变体多肽同样的载体进行表达。可以将任一种载体系（单一载体或2个载体） 通过体内或体外手段给予。在自身免疫治疗中，例如，药物前体激活剂的添加可以更进一步 促进支持由半乳凝素9突变体达到的效果的免疫调节效果，而药物前体添加可以对转染细 胞的杀伤再进行活化。
[0255] 伴侣分子可以在聚核苷酸治疗药给予前、给予同时，或给予后给予，而伴侣分子可 以是例如热休克蛋白质（例如、hsp70)。在哺乳动物中表达的聚核苷酸可以再与例如用于 确实只在所期望靶细胞进行聚核苷酸表达目的的诱导启动子（例如、组织特异的启动子） 连接。为了将聚核苷酸有效地递送到组织的目的，聚核苷酸可以与适合于向该组织的细胞 基因组整合的核苷酸序列邻接。
[0256] 对于本发明的这一方式和许多方式，对人进行治疗的有效性最初可以在所定的 自身免疫疾患动物模型中进行试验。作为这样的现存动物模型，包括例如肖格伦综合征 (自身免疫泪腺炎或免疫媒介唾液腺炎）、自身免疫心肌炎、原发性胆汁性肝硬变（PBC)、 炎症性心疾患、水银诱导性肾脏自身免疫、胰岛素依赖性糖尿病（I型糖尿病或IDD)、胸 腺摘出后自身免疫、中枢神经系（CNS)脱髓损伤、CNS狼疮、发作性睡眠、重症肌无力症 (MG)、突眼性甲状腺肿、免疫媒介PNS损伤、变形性关节症、慢性关节风湿病、葡萄膜炎、髓 质囊胞性纤维症、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脉管炎、卵巢自身免疫疾患、和人强皮症 (schleroderma)等在内的自身免疫疾患动物模型。
[0257] 可以将多个基因递送载体给予动物或植物。在理想的实施方式中，动物为温血动 物，最好是从小鼠、鸡、牛、猪、宠物（例如、猫和狗）、马、和人中选择。至于多肽治疗药（例 如、半乳凝素9突变体或其它细胞因子），给药量可以是约5?50 y g/kg哺乳动物体重、或 约50 ii g/kg?约5mg/kg、或约100?500 ii g/kg哺乳动物体重和约200?约250 ii g/kg的 范围。
[0258] 关于多肽治疗药（例如编码天然或变异体的半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸 等）在以组织为靶的给药中，根据聚核苷酸在患者（例如、哺乳动物）中的表达，可以象下 面那样给予含有编码序列或非编码序列的可表达构建物的载体：在局部给药的基因治疗 程序中，可以在约IOOng?约200mg DNA、或约500ng?约50mg DNA、或约I u g?约2mg DNA、或约5iig DNA?约500 iig DNA范围内给药，而在基因治疗程序中的局部给药中间，可 以在约20 ii g?约100 ii g范围给药，例如每次注射或给药，按照约500 ii g的用量给药。期 望更多表达时，遍及组织的更广的区域，按照连续给药程序再给予更多的量的DNA或同样 量的DNA，例如可以向肿瘤部位附近不同的或紧连的组织部分给予一些，这样给药对于带来 阳性的治疗结果很有必要。
[0259] 有关低分子治疗药的给予，可以根据低分子的效力改变给药量。如果是非常强的 抑制剂，其给药量如用哺乳动物每公斤的量表示的话，例如、在约I y g/kg?约500mg/kg、 或约100 ii g/kg?约5mg/kg、或约I ii g/kg?约50 ii g/kg、或例如约10 ii g/kg的范围非常 充分。就肽和类肽的给药来说，效力因给药量而有所变化，可以是约I U g/kg?约500mg/kg 哺乳动物体重、和约100 y g/kg?约5mg/kg、和约I ii g/kg?约50 ii g/kg的范围。而通常 的用量可以是约IOu g/kg。
[0260] 本发明的活性成分可以在很宽范围选择该成分的给药量给药，该给药量和给药次 数等可以根据治疗患者的性别、年龄、体重、一般的健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排 泄速度、药物的组合、患者此时进行治疗的病状的程度考虑这些因素或其它要因之后决定。
[0261] 在进行药物品制造时，其添加剂等和制备法等可以参考例如日本药局方解说书编 集委员会编、第十四改正日本药局方解说书、平成13年6月27日发行、株式会社广川书店； 一番 >瀬尚他编医药品的开发12卷（制剂素剂〔I〕）、平成2年10月15日发行、株式会社 广川书店；同、医药品的开发12卷（制剂素材〔II〕）平成2年10月28日发行、株式会社 广川书店等记载，从这些记载中根据需要适当选择运用。
[0262] 本发明的活性成分包括本说明书中说明的（a)半乳凝素9突变体以及与其具有基 本上均等的生物活性的多肽等、（b)编码半乳凝素9突变体以及与其具有基本上均等的生 物活性的多肽的聚核苷酸、（c)利用半乳凝素9突变体技术发现的因子等、（d)半乳凝素9 突变体以及与其具有基本上均等的生物活性的多肽基因递送载体等，这些成分在利用人半 乳凝素9对正常细胞不表现出伤害活性，而对肿瘤细胞表现伤害细胞活性的性状、对肿瘤 细胞诱导凋亡，但对正常细胞不诱导凋亡的性状、抑制恶性细胞的转移性的性状、诱导被活 化的免疫细胞、特别是活化的CD4阳性T细胞的凋亡的活性（与此相反，静息T细胞、特别 是CD4阳性T细胞（协助者T细胞）的凋亡诱导称之为不诱导凋亡的性状）等上是有用的， 有望作为利用与抗肿瘤剂、抗变态性剂、免疫调节剂、自身免疫疾患用剂、抗炎症剂、肾上腺 皮质类固醇激素同样活性的药剂。
[0263] 根据使用本发明的活性成分、例如半乳凝素9突变体（特别是G9NC(null))确认 的生物活性效果，认为半乳凝素9以及半乳凝素9突变体（特别是G9NC(null))对于如下 给出的那样病的症状和疾患表现出有用的生物活性。
[0264] 在炎症性疾患中有各脏器中发生的各种急性和慢性炎症、变态性和自身免疫性的 炎症、感染症等。
[0265] 作为急性和慢性疾患，包括例如肺炎中支气管炎、支气管肺炎、间质性肺炎、肺脏 炎、细支气管炎和急性纵隔炎等，以及其它的的脏器的炎症，例如心外膜炎、心内膜炎、心肌 炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉头炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性肠炎、 虫垂炎、缺血性大肠炎、药物性大肠炎、直肠炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重症肝炎、慢 性肝炎等各种急性和慢性肝炎和肝硬变、胆囊炎、急性胰炎、慢性胰炎、还有急性和慢性肾 炎、膜性肾炎、丝球体肾炎、IgA肾症等和各种各样的膀胱炎、脑髓炎、乳腺炎、皮炎、表层角 膜炎、干性角结膜炎、各种中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸等、牙肉炎、牙周炎、牙周围炎等 各种各样的炎症。
[0266] 另外，在神经性炎症（例如神经性胃炎、神经性膀胱炎等）中也看到了效果。例如， 通过实施例8确认，半乳凝素9在辣椒辣素诱导神经性皮炎症模型中对模型的炎症反应具 有强的抑制效果。辣椒辣素是通过刺激末梢神经引起神经性炎症和疼痛的物质。辣椒辣素 具有刺激储藏在作为知觉神经C纤维末端的神经肽的物质P释放的作用。物质P具有使组 胺从肥大细胞释放的作用，结果血管被扩张，出现浮肿。另外，由于释放的组胺作用，知觉神 经受到刺激，物质P由C纤维末端释放，作用于其周围的肥大细胞，出现再使组胺释放的增 强循环。半乳凝素具有抑制该病态形成的作用。
[0267] 再者辣椒辣素与感觉神经末梢的疼痛受容传感器的辣椒辣素受体（香草素受体） 结合，引起疼痛。疼痛是由于化学刺激（酸等）、热刺激（开水等）或过度的机械刺激（创 伤等）感觉神经末梢被活化引起的，辣椒辣素受体也参与由于这样的刺激引起的疼痛。这 表明半乳凝素9抑制由辣椒辣素受体导致的神经末梢的活化，预期有可能具有使伴随癌或 炎症引起的疼痛减轻等镇痛作用。
[0268] 变态性炎症疾患如全身性过敏性、支气管哮喘、过敏性肺炎、花粉症、变态性鼻炎、 变态性结膜炎、免疫复合体引起的变态性疾患、血管神经性浮肿等。
[0269] 另外自身免疫性的炎症（自身免疫疾患）中有全身性（慢性关节风湿病、全身性 红斑狼疮、结节性多发性动脉炎、强皮症、多发性肌炎?皮肤肌炎、肖格伦综合征、贝切特病 等）、神经系（多发性硬化症、重症肌无力症、HAM(HTLV-1脊髓症）、肌萎缩性侧索硬化症 等）、内分泌性（巴泽多病、桥本病、1型糖尿病等）、血液（特发性血小板减少性紫斑病、 自身免疫性溶血性贫血、再生不良性贫血等）、呼吸器（结节病、肺纤维症等）、消化管（溃 疡性大肠炎、克罗恩病等）、肝脏（自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆 管炎、自身免疫性胆管炎等）、肾?尿路系（抗嗜中性白细胞细胞质抗体关联肾炎、血管炎、 Goodpasture综合征、抗丝球体基底膜抗体病等）等。
[0270] 感染症是病原体由于生物体的细胞?组织?脏器产生的疾患的总称。关于感染 症可以参考监修：町并陆生、编集：秦顺一、坂本穆彦、「标准病理学（第2版）」、医学书院、 2002年3月15日发行。引起人感染症的病原体有1)细菌（包括螺旋体、衣原体、立克次 体）、2)病毒、3)真菌、4)植物（藻类）、5)原虫、6)寄生虫（吸虫、条虫、线虫）、7)节足动 物。各病原体引起的主要的疾患如细菌性感染症（霍乱、瘟疫、大肠杆菌感染症等）、螺旋 体感染症（钩端螺旋体病等）、衣原体感染症（鹦鹉病等）、立克次体感染症（斑疹伤寒、破 伤风等）、病毒性感染症（带状疱疹、病毒性出血热、狂犬病等）、真菌症（念珠菌病、隐球菌 病、曲霉菌病等）、原虫性疾患（阿米巴性痢疾、疟疾、弓形体病等）、寄生虫（吸虫症、线虫 症等）、以及支原体感染症（支原体肺炎等）、分支杆菌感染症（结核、非定型抗酸菌症等）。
[0271] 至于癌和肉瘤，如脑肿瘤（多形形恶性胶质肿等）、脊髓肿瘤、上颚洞癌、胰液腺 癌、齿肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉头癌、甲状腺癌、甲状芳腺癌、肺癌、胸 膜肿瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大肠癌、胆管癌、胆囊癌、胰脏癌、肝癌、肾 脏癌、膀胱癌、前立腺癌、阴茎癌、精巢肿瘤、肾上腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、外阴 癌、卵巢癌、纤毛上皮肿、恶性骨肿瘤、软部肉瘤、乳癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、基底细胞瘤、 白血病、伴随骨髓化性的骨髓纤维症、恶性淋巴瘤、恶性淋巴肉芽肿病、浆细胞瘤、神经胶质 瘤等。
[0272] 也适用皮肤科领域，例如1)在皮肤疾患中存在着包括感染症、变态性炎症和自身 免疫性炎症在内的炎症和干癣、水疱症、脓疱症、角化、角化异常症等特有的炎症。另外2) 与美容皮肤科关系，
[0273] a)黑色素代谢调节（美白）? --半乳凝素9基因导入黑素瘤细胞，由黑色调向 白色变化。皮肤基底细胞层有半乳凝素9阳性细胞。
[0274] b)毛发成长（生发）的调节? --毛根部有半乳凝素9表达，随时期而变。半乳 凝素9基因导入小鼠的毛发的成长与突变体半乳凝素9基因导入小鼠相比非常好。
[0275] c)胶原产生调节等? --成纤维细胞通过各种刺激有半乳凝素9表达、纤维结缔 组织有半乳凝素9阳性的部分。
[0276] 至于生活习惯病如高脂血症、动脉硬化症、高血压、糖尿病等。已阐明与生活习惯 病动脉硬化症的病态形成有关的细胞之一泡沫细胞中存在着gal9阳性细胞和阴性细胞。 因此，表明gal9与动脉硬化症的病态有关，不可否认通过控制它，治疗或予防成为可能。至 于高血压，在动物实验模型高血压发症时由于半乳凝素9在尿细管或丝球体中的表达增 强，所以有时对半乳凝素9表达进行控制，通过给予半乳凝素9能够治疗的可能性增大。
[0277] 另外，也适用于正常细菌丛的维持，例如、gal9在肠管上皮正常强烈表达，另外对 于给予恶玉细菌丛时，半乳凝素9在肠管上皮和巨噬细胞等炎症细胞中的表达增强。由此 明显表示出半乳凝素9与消化管中正常细菌丛的维持有关。
[0278] 另外，在可适用于淀粉样变性，例如在确认淀粉样变性的部分的巨噬细胞中，有表 现出半乳凝素9表达的巨噬细胞存在。存在着通过半乳凝素9可以控制淀粉样沉积的可能 性。
[0279] 认为对阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨折等也有用，例如、在阿尔茨海默病患者的 脑中变性的神经细胞表现出半乳凝素9阳性特征。因此存在可用于治疗和诊断的可能性。 另外在骨质疏松症中，认为半乳凝素9有抑制骨吸收，促进骨形成的可能性。这样的作用从 骨代谢方面考虑，认为是理想的药剂。
[0280] 另外在脑、神经领域中也有用，例如、脑梗塞、心肌梗塞等缺血性病变的进展伴随 着炎症细胞的湿润，引起超氧化物产生等进一步恶化。预期半乳凝素9和半乳凝素9突变 体可控制这样的炎症。作为炎症、免疫系的变化为原因的脱骨髓性疾患，例如多发性硬化症 等。作为变性疾患，如肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病等。另外综合失调症可以说原因是某 种炎症性的变化。即EPA(二十碳五烯酸）可用于脑中炎症反应的控制和神经细胞膜的形 成。在综合失调症患者中，有细胞膜中的EPA和其它的必需脂肪酸表现出枯竭的研究例。
[0281] 预期半乳凝素9和半乳凝素9突变体对痛风也有用。预期半乳凝素9和半乳凝素 9突变体对于对尿酸结晶的组织沉着的疼痛的强急性炎症也能进行控制。
[0282] 哮喘是引起可逆性呼吸道阻塞（哮喘发作）的呼吸器疾患，指的是对抗原特异的 (变态原）或非特异的（感染、冷气等）刺激，呼吸道反应性亢进的状态。近年证明对于哮 喘的呼吸道在不发作的稳定期存在以嗜酸性细胞、T淋巴细胞、和肥大细胞为主体的炎症， 现在，认为是哮喘本身慢性的支气管炎。另外、很多的小儿哮喘与特应性起因（IgE产生） 的关联虽然强（特应型哮喘）、在成人哮喘中约半数被确认不能证明与IgE有关（非特应型 哮喘）。哮喘予防?管理指导原则（1998年厚生省研究班）已出台，哮喘治疗可以分为急性 发作和慢性呼吸道炎症两种。作为发作治疗药，支气管扩张药（0 2刺激药、氨茶碱）可用作 第一选择药，在中等症以上的发作中用这些药剂不充分，要进行类固醇药的大量全身给药。 类固醇药副作用大、特别是消化性溃疡、高血压、高血糖、精神症状等重大，如果长期使用， 感染症、肾上腺抑制、骨质疏松症等逐渐成为问题。另外伴随着合併症的场合类固醇的使用 伴随着危险。期盼副作用少、具有与类固醇同等效果的药剂的开发。作为长期的管理药，在 慢性呼吸道炎症的治疗中抗炎症药为主体，其中推荐吸入类固醇药的使用。长期大量使用 该类固醇药时，肾上腺抑制、骨质疏松症、呼吸道感染等副作用出现的可能性不能否定。另 夕卜、吸入药要求正确吸入手技，与内服药比较，在顺应性这点差。就中等症以上的哮喘来说， 除了吸入类固醇药之外，推荐吸入h刺激药、白三烯拮抗药或并用缓释性茶碱药。如果是 重症例，不得已只能全身给予类固醇。期盼开发取代这样药剂的药剂。
[0283] 已知在哮喘的病态形成中，对T淋巴细胞、嗜酸性细胞的肺组织以及呼吸道的浸 润起着重要的作用。另外半乳凝素9具有诱导细胞凋亡的功能，诱导活化T细胞和嗜酸性 细胞的凋亡。按照这样的思路，根据本发明中使用半乳凝素9突变体等的研究，显然半乳凝 素9和半乳凝素9突变体具有改善（抑制）哮喘中呼吸道炎症的活性。
[0284] 而半乳凝素9和半乳凝素9突变体具有增强成骨细胞增殖和分化以及抑制破骨细 胞分化的活性，认为对于骨质疏松症的予防和/或治疗、类固醇长期给药中成为问题的副 作用之一骨生长抑制也有效。
[0285] 半乳凝素9和半乳凝素9突变体在对淋巴细胞的作用中与类固醇不同，表现出活 化淋巴细胞特异的抑制作用，与类固醇相比，预期副作用、例如、免疫抑制少。另外，还具有 抑制类固醇中不存在的粘附分子的功能以及抑制神经性炎症的作用，有望作为哮喘治疗、 例如发作治疗药。另外认为可减轻类固醇的副作用。
[0286] 实施例
[0287] 以下给出实施例，对本发明进行具体说明，该实施例只是为了对本发明进行说明， 用于其具体方式的参考提供的。这些实施例是为了说明本发明的特定的具体方式的例子， 并不表示限定或限制本申请书公开的发明范围。本发明应当理解为源于本说明书的思想的 各种各样的可实施方式。
[0288] 所有的实施例除了另外详细记载的以外，使用的标准的技术实施的或可以实施的 例子，这些对于同行众所周知、惯用的技术。而在以下的实施例中，没有特别指出时，具体 的操作和处理条件等，DNA 克隆根据 J. Sambrook, E. F. Fritsch&T. Maniatis, "Molecular Cloning"，2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 和 D. M. Glover et al. ed.，"DNA Cloning", 2nd ed.，Vol. Ito 4，（The Practical Approach Series)，IRL Press, Oxford University Press (1995);使用 PCR 法全时根据 H. A. Erlich ed.，PCR Technology, Stockton Press, 1989 ;D.M. Glover et al.ed.，"DNA Cloning"，2nd ed.,Vol. I, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995)和 M. A. Innis et al.ed. , ^PCR Protocols"，Academic Press, New York (1990)所述的方法进行，而使用市售的试剂或试剂盒时使用附带的指示书 (protocols)和添付的药品等。
[0289] 实施例1
[0290] (A)半乳凝素9突变体表达载的构建
[0291] 在制作表达载体时,使用
[0292] (1)由 Jurkat 细胞的 poly (A)+RNA 级分制备的 cDNA
[0293] (? pET-1 Ia 载体（STRATAGENE)
[0294] (3) PCR 用引物：
[0295] G9NCRD1: CGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG 序列 10
[0296] G9NCRD6: CGACCGCATATGCTGGAAGCTGATGTAGGACAG 序列 11
[0297] G9CCRD5:CGTCCTCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATG 序列 12
[0298] G9CCRD6: CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG 序列 13
[0299] Jurkat细胞（来自T细胞的细胞）由美国模式培养物保藏所（ATCC)获得。细胞 系于添加了 10% FCS的RPMI-1640培养基（Sigma、圣路易斯、美国）中在5% CO2的条件 下维持在37°C。从Jurkat细胞提取总RNA象下面那样进行。即将使用含有10% FBS的 RPMI-1640培养基培养的Jurkat细胞进行离心、收集。用IOmlPBS将细胞清洗2次。向清洗 后的细胞沉淀按照每2x IO8个细胞加15mlISOGEN (商品名：日本人），按照指南（日本人） 提取总RNA。从总RNA纯化poly (A) +RNA和cDNA合成象下面那样进行。即，将从Jurkat细 胞提取的总RNA按照终浓度为lmg/ml浓度那样溶解于DEPC处理水中。使用PolyATtract mRNA Isolation System (商品名：Promega),根据指南从总 RNA 纯化 poly (A)+RNA。将纯化 的poly (A) +RNA按照终浓度为5 ii g/20 ill溶解于DEPC处理水中。
[0300] 使用 First-Strand cDNA 合成试剂盒（商品名：Amersham Biosciences)，按照指 南由5 ii g的poly (A)+RNA合成cDNA(对于引物使用Not I-d(T) 18)。
[0301] 接下来，按照图1所示顺序，在pET-1 Ia载体NdeI-BamHI位点插入半乳凝素9的 N-末端侧糖链结合结构域（N-terminal carbohydrate recognition domain, NCRD)和 C-末端侧糖链结合结构域（CCRD)，制作缺少连接肽的改变型半乳凝素9 (G9NC(null))的表 达载体。首先从半乳凝素9cDNA分别取得（1)对应于人半乳凝素9的C-末端侧CRD的cDNA 和（2)对应于人半乳凝素9的N-末端侧CRD的cDNA。即使用PCR用引物：G9CCRD5+G9CCRD6 从cDNA扩增对应于人半乳凝素9的C-末端侧CRD的cDNA(G9CCRD)。将G9CCRD用制限 酶（Ndel+BamHI)切后，插入到用同样制限酶处理的pET-lla载体，得到pET-G9CCRD。PCR 使用KOD DNA聚合酶试剂盒（T0Y0B0 Code No. K0D-101)进行。使PCR反应混合物（dNTP mix，25mM MgCl2，10XBuffer，K0D DNA 聚合酶（0. 05u),引物和模板 cDNA)在以下那样的 PCR的循环条件下进行反应：94°C处理2分钟后，进行25次循环（98°C下15秒、然后65°C下 2秒、而后74°C下处理30秒），最后于4°C下停止反应。被PCR扩增的片段向载体的插入使 用Ligation high kit (T0Y0B0 Code No. LGK-101)进行。反应按照插入片段：载体的摩尔 比为约5 :1进行混合，加其总DNA溶液（体积）量的1/2 (体积）量的试剂Ligation high 混合后进行。通过于16 °C反应16小时（0/N)进行插入。
[0302] 另外使用PCR用引物：G9NCRD1+G9NCRD6从该半乳凝素9cDNA扩增对应于人半乳 凝素9的N-末端侧CRD的cDNA(G9NCRD)。将G9NCRD用制限酶（NdeI)切断后，将得到的片 段用同样的制限酶（NdeI)处理，再插入到脱磷酸化的pET-G9CCRD中得到pET-G9NC (null)。 PCR扩增以及向载体的整合与上述同样进行。pET-G9NC(null)编码具有将人的M型半乳凝 素9的第149位Pro开始至第177位Ser的29个氨基酸序列置换为His-Met序列的氨基 酸序列的多肽。即是具有序列1所示的碱基序列，编码具有序列2所示的氨基酸序列的多 肽。
[0303] (B)半乳凝素9突变体重组蛋白质的表达和纯化
[0304] 将上述工程（A)得到的表达用质粒载体pET-G9NC (nul 1)导入大肠杆菌 (BL21(DE3))。导入通过电穿孔法进行。即将感受态BL21(DE3)和质粒载体水溶液混合，通 过使用I. 8kV电压的电穿孔法进行转染。
[0305] 重组蛋白质的表达通过将大肠杆菌于含有2% (w/v)葡萄糖和IOOii g/ml氨 苄青霉素的2X YT培养基中培养，当600nm的吸光度达到0. 7时，添加0. IM异丙基硫 代-P -D-半乳糖苷（最终浓度0. ImM)，诱导重组蛋白质的表达来进行。于20°C培养18小 时后，通过离心收集菌体，悬浮于 IOmM Tris-HCl(pH 7.5),0. 5M NaCl, ImM DIT, ImM PMSF 中。将悬浮液进行10分钟超声波处理后，加10% (w/v)Triton X-100 (最终浓度1% )，于 4°C下搅拌30分钟。于15, OOOXg下离心30分钟，将得到的上清液中的重组蛋白质通过使 用乳糖-琼脂糖的亲和层析进行纯化。
[0306] 结果纯度高的标准品以比较高的收率获得。得到的重组蛋白质的电泳结果如 图 2 所示。SDS-PAGE 条件如下：Gel, Acrylamide-BIS(12 % gel),电泳用缓冲液，25mM Tris-192mM 甘氨酸-0? 1 % SDS,泳动条件，180V, 45min.，染色，CBB, 60 °C /30min. 电泳样品吸附于Strata Clean? Resin(Stratagene)，用IX样品缓冲液（62. 5mM Tris-HCl，Ph6. 8, 2% (w/v)SDS, 5% (W/V)2-ME，Glycerol)调整到 0? 2mg/ml，98°C /3min. 热处理后以每条带约2 y g的蛋白质量进行电泳。
[0307] 纯化的G9NC(null)于4°C下可以稳定保存90天以上。而野生型的半乳凝素 9(M-type、G9(M))在同一保存条件下在2周以内大部分被分解（参照图3)。该分解被认为 是由于纯化半乳凝素标准品中含有来自大肠杆菌的蛋白水解酶引起的。
[0308] 实施例2
[0309] 比较野生型的半乳凝素9 (S-type、G9 (S):带有最短连接肽的同种型）和 G9NC(null)对存在于人组织中的蛋白水解酶的敏感性。向溶解于PBS的半乳凝素中加 1/100(重量比）的基质金属蛋白酶-3(MMP-3)或弹性蛋白酶，于37°C下保温。任一场合 下G9 (S)大部分都在1?2小时被分解，而相反G9NC (null)在2小时后还完全没有被分解 (参照图4和5)。
[0310] 实施例3
[0311] 为了研究寄予半乳凝素9生物活性的变异导入的效果，研究了对M0LT-4细胞 (来自人Tcell leukemia的细胞株）的凋亡诱导活性和对外周血嗜酸性细胞的趋化活性 (eosinophil chemoattractant activity、ECA activity)〇
[0312] (a)细胞培养物
[0313] MOLT -4 (T细胞）由ATCC获得。所有细胞系都在添加了 10% FCS的RPMI - 1640 培养基（Sigma、圣路易斯、美国）中维持在5% CO2的条件、37°C下。为了抑制Gal - 9的 活性，在培养用培养基中添加30mM的乳糖。作为对照使用同浓度的蔗糖。
[0314] (b)凋亡分析
[0315] (1)利用PI进行细胞周期（apoptosis)解析（PI法）
[0316] 将被凋亡诱导处理的细胞于4°C、IOOOrpm下进行5分钟离心处理后，将细胞团再 悬浮于PBS(300iU)，一边涡旋、一边向细胞悬浮液慢慢添加100%冷乙醇（700iU)，使终 浓度变为70%乙醇。于4°C下进行30分钟温育处理，对细胞进行固定，然后加PBS (Iml)，于 4°C、IOOOrpm下进行5分钟离心处理后，将细胞团再悬浮于PBS (440 ill)。将细胞与2. 5mg/ ml的核酸酶A(10 ii 1，终浓度50 ii g/ml，Sigma,圣路易斯、密苏里州、美国）一起于37°C下 进行30分钟温育处理，然后与2. 5mg/ml的碘化丙锭（4 ill ;PI，终浓度20 ii g/ml，Sigma) - 起于4°C、暗中进行10分钟温育处理。通过尼龙筛除去变成集块的细胞后，于PBS中对细胞 进行计数，通过流式细胞仪（Sandstrom, aK. et al.，J Immunol Methods, 240:55 (2000)以 及 Zhang L.et al.，Cancer Lett, 142:129(1999))对染色细胞进行解析。
[0317] (2) TUNEL(TdT-mediated 标记 dUTP nick end labeling)法
[0318] 对于通过DNA的片段化产生的末端，用在DNA末端附加核苷酸的酶（TdT :末端 脱氧核苷酸转移酶）整合标记的核苷酸（dUTP-biotin或FITC-dUTP等）后，对作为凋 亡的显著特征的细胞核DNA的片段进行检测。在实验中，使用MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct (MBL、名古屋、日本）。根据试剂盒销售商的指示，象下述那样进行实验。即，将进行 了凋亡诱导的细胞（约2X IO5个/样品）用含有0. 2% FSA的PBS洗，然后加4%多聚甲 醛（0. lMnaH2PL4, pH7. 4中），于4°C下进行30分钟固定化后，用含有0. 2% FSA的PBS洗。 向细胞团加70%冷乙醇后于一 20°C下进行30分钟温育处理，使透过性亢进。用含有0. 2% FSA的PBS洗后，向细胞团加TdT反应液（TdT、FITC-dUTP以及TdT缓冲液的混合物），搅拌 后，于37°C下进行1小时温育处理，用含有0. 2% FSA的PBS洗后，再悬浮于含有0. 2% FSA 的PBS中，对染色细胞通过流式细胞仪进行解析。
[0319] (c) T细胞解析
[0320] 用按照各个孔每孔3 ii g/ml的抗⑶3抗体（Immunotech, Marseille、法国）的TBS 液（pH8. 0)对24孔板于4°C下温育过夜处理后，除去抗⑶3抗体，用PBS洗涤孔，得到用抗 ⑶3抗体包被的孔板。
[0321] 使用HIST0PAQUE(登录商标、SIGMA)从加肝素的血液中分离单核白细胞细胞。 然后，使用C4阳性分离试剂盒（Cd4-positive isolation kit ;DYNAL, Oslo,挪威）以及 Dynabeads (登录商标）M - 4500)8 (DYNAL, Oslo,挪威），按照试剂盒制造销售商所述那样 分别分离⑶4阳性T细胞以及⑶8阳性T细胞。为了对T细胞进行活化，将⑶4阳性T细 胞或⑶8阳性T细胞于含有10% FCS的RPMI - 1640中调整为IX IO6个/ml的细胞，在 37°C下在用抗⑶3抗体包被的板上于5% CO2培养箱中温育处理20?24小时，然后与重组 体半乳凝素9(野生型G9(S)或突变体G9NC(null)) -起于37°C下在5% CO2培养箱中进 行温育处理。然后，象上述（b)那样，进行凋亡?分析。即，将细胞于37°C下与50i!g/ml的 PI (Sigma) -起在暗处进行温育处理。将染色细胞通过流式细胞仪（Sandstrom, K. et al.，J Tmmun〇I Methods, 240:55 (2000)以及 Zhang L. et al.，Cancer Lett, 142:129 (1999))进行 解析。
[0322] 对于非活化（静息）T细胞与与重组体半乳凝素9(野生型G9⑶或突变体 G9NC(null)) -起于37°C下在5% CO2培养箱中进行温育处理后，与上述同样进行凋亡?分 析。
[0323] (d)结果
[0324] 将伴随凋亡出现的DNA片段化通过琼脂糖凝胶电泳和FACS进行研究，结果表明无 论使用那一种方法，G9NC (null)都保持与G9(S)同等或在其以上的凋亡诱导活性（图6,表 1)。通过Chamber法研究ECA活性，结果表明G9NC (null)与G9⑶比较，表现出更高的活 性（图7)。
[0325] 表 1
[0326] 已经凋亡的MOL - 4细胞的比例（％ )

【权利要求】
1. 蛋白质或其盐，其特征是半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质 的连接肽或其附近区域被改变。
2. 权利要求1所述的蛋白质或其盐，其特征是：改变由在半乳凝素9或基本上具有与 半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域的氨基酸序列中缺失、取代或添加的 1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列形成，与半乳凝素9比较，至少对于连接肽的分解敏 感性被改变。
3. 权利要求1或2所述的蛋白质或其盐，其特征是：基本上具有与半乳凝素9同等活 性的蛋白质与半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70%以上同源性。
4. 权利要求1?3中任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：（1)和⑵借助于⑶连 接，其中⑴为具有半乳凝素9的N末端侧的糖链识别区域（NCRD)或与该区域具有基本 上同等活性的多肽；（2)为具有半乳凝素9的C末端侧的糖链识别区域（CCRD)或基本上与 该区域具有同等活性的多肽；（3)为在半乳凝素9的连接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添 加的1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽。
5. 权利要求1?4任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：（1)和⑵借助于⑶连 接，其中（1)为具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或基本上与它具有同等活性、且具有 与序列3所示的氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽，或具有在序列3所 示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1?8个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽；（2)为 具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或基本上与它具有同等活性、且具有与序列4所示的 氨基酸序列至少70%以上同源性的氨基酸序列的多肽，或具有在序列3所示的氨基酸序 列中至少缺失、取代或添加1?21个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽；（3)为在序列7? 9中任一个序列表示的氨基酸序列中缺失（不过，序列7中的1?32以及1?44的缺失、 和序列8中1?12的缺失除外）、取代或添加1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成 的改变连接肽。
6. -种核酸，其特征是具有编码权利要求1?5任一项所述的蛋白质的碱基序列。
7. 权利要求6所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
8. 权利要求6或7所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
9. 一种重组载体，其特征是含有权利要求6?8任一项所述的核酸。
10. 权利要求9所述的重组载体，其特征是除了含有权利要求6?8任一项所述的核酸 夕卜，还含有编码标记蛋白质和/或肤的喊基序列。
11. 一种转化体，其特征是含有权利要求6?8任一项所述的核酸或权利要求9或10 所述的重组载体。
12. 权利要求11所述的转化体，其特征是：转化体宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
13. -种药物，其特征是：作为有效成分含有从权利要求1?5中任一项所述的蛋白 质、权利要求6?8中任一项所述的核酸、权利要求9或10所述的重组载体和权利要求11 或12所述的转化体中选择的成分。
14. 权利要求13所述的药物，其特征是免疫调节剂。
15. 权利要求13所述的药物，其特征是抗肿瘤药。
16. 权利要求15所述的药物，其特征是抗来自于包含脑肿瘤（多形形恶性胶质瘤等）、 脊髓肿瘤、上颚洞癌、胰液腺癌、齿肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉头癌、甲 状腺癌、甲状旁腺癌、肺癌、胸膜肿瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大肠癌、胆管 癌、胆囊癌、胰脏癌、肝癌、肾脏癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢肿瘤、肾上腺癌、子宫颈 癌、子宫体癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、纤毛上皮瘤、恶性骨肿瘤、软部肉瘤、乳癌、皮肤癌、 恶性黑色素瘤、基底细胞瘤、白血病、伴随骨髓化性的骨髓纤维症、恶性淋巴瘤、恶性淋巴肉 芽肿病、浆细胞瘤、神经胶质瘤等癌和肉瘤的肿瘤的抗肿瘤药。
17.权利要求13所述的药物，其特征是该药物是针对下面疾患或疾病、或病的症状的 药物： (A) 炎症性疾患，来自于在各脏器中发生的各种急性和慢性炎症、变态性和自身免疫性 炎症、感染症等中的疾病； (B) 急性和慢性疾患，来自于包括支气管炎、支气管肺炎、间质性肺炎、肺炎、细支气管 炎、急性纵隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心内膜炎、心肌炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽 炎、喉头炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性肠炎、虫垂炎、缺血性大肠炎、药物性 大肠炎、直肠炎在内的肺以外的其它脏器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重症 肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬变、胆囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性肾炎、膜 性肾炎、丝球体肾炎、IgA肾症、各种膀胱炎、脑髓炎、乳腺炎、皮炎、表层角膜炎、干性角结膜 炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周围炎在内的炎症等疾病； (C) 来自于神经性炎症（例如、神经性胃炎、神经性膀胱炎等）、癌或伴随炎症疼痛的疾 病； (D) 变态性炎症疾患，全身性过敏性、支气管哮喘、过敏性肺炎、花粉症、变态性鼻炎、变 态性结膜炎、免疫复合体引起的变态性疾患、血管神经性浮肿等在内的疾病； (E) 自身免疫性的炎症（自身免疫疾患），来自于全身性（慢性关节风湿病、全身性 红斑狼疮、结节性多发性动脉炎、强皮症、多发性肌炎?皮肤肌炎、肖格伦综合征、贝切特病 等）、神经系（多发性硬化症、重症肌无力症、HAM(HTLV-1脊髓症）、肌萎缩性侧索硬化症 等）、内分泌性（巴泽多病、桥本病、1型糖尿病等）、血液（特发性血小板减少性紫斑病、自 身免疫性溶血性贫血、再生不良性贫血等）、呼吸器（结节病、肺纤维症等）、消化管（溃疡 性大肠炎、克罗恩病等）、肝脏（自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管 炎、自身免疫性胆管炎等）、肾·尿路系（抗嗜中性白细胞细胞质抗体相关肾炎、血管炎、肺 肾综合征（Goodpasture)、抗丝球体基底膜抗体病等）等疾病； (F) 感染症，由于病原体伤害生物体的细胞?组织?脏器产生的疾患、或起因于给人带 来感染症的病原体的疾患，病原体来自于1)细菌（包括螺旋体、衣原体、立克次体）、2)病 毒、3)真菌、4)植物（藻类）、5)原虫、6)寄生虫（吸虫、条虫、线虫）、7)节足动物，包括细 菌性感染症（霍乱、瘟疫、大肠杆菌感染症等）、螺旋体感染症（钩端螺旋体病等）、衣原体 感染症（鹦鹉病等）、立克次体感染症（斑疹伤寒、破伤风等）、病毒性感染症（带状疱疹、 病毒性出血热、狂犬病等）、真菌症（念珠菌病、隐球菌病、曲霉菌病等）、原虫性疾患（阿米 巴性痢疾、疟疾、弓形体病等）、寄生虫（吸虫症、线虫症等）、此外还包括支原体感染症（支 原体肺炎等）、分支杆菌感染症（结核、非定型抗酸菌症等）疾病； (G) 皮肤科领域的疾患，i)皮肤感染症、包括变态性炎症和自身免疫性炎症等在内的 皮炎症，干癣、水疱症、脓疱症、角化、角化异常症等具有特有炎症的皮肤疾患、ii)来自于由 于美容皮肤科相关的损伤或老化，与a)黑色素代谢调节（美白）、b)毛发成长（生发）的 调节、C)胶原产生调节有关的皮肤科领域的疾患（包括老化）； (H) 生活习惯病，来自于包括高脂血症、动脉硬化症、高血压、糖尿病等在内的疾病； (I) 有关正常细菌丛的维持的异常； (J) 来自于包括淀粉样变性、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨折等在内的疾病； (K) 脑、神经领域中的炎症反应，例如伴随着脑梗塞、心肌梗塞等缺血性病变的进展出 现的炎症、综合失调症； (L) 痛风； (M) 骨质疏松症；或 (N) 间质性肺炎。
18.分析或检查试剂，特征是作为有效成分含有选自于权利要求1?5中任一项所述的 蛋白质、权利要求6?8中任一项所述的核酸、权利要求9或10所述的重组载体以及权利 要求11或12所述的转化体的成分。
【文档编号】C12N5/10GK104292321SQ201410443899
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2005年3月29日 优先权日:2004年3月29日
【发明者】西望, 平岛光臣, 山内清明, 伊藤爱子 申请人:株式会社嘉尔药物