一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，涉及涉及一种虎杖毛状根的诱导及利用生物反应器扩大培养的方法，具体为一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法。本发明以虎杖植株野生带芽茎段为外植体，成功诱导出虎杖组培苗，并建立了虎杖组织培养体系，并成功诱导出虎杖毛状根体系，且建立了虎杖毛状根生产白藜芦醇体系，成功通过气升式生物反应器使虎杖毛状根生产白藜芦醇，并对白藜芦醇进行了含量测定及提取分离。通过虎杖毛状根生产白藜芦醇，与现今生产方式相比，具备在无激素培养基上快速生长的特性。因此该方法操作简单、成本较低、不受气候、土地等自然条件的限制等优点，为今后进行工业化生产提供了可靠地来源和物质基础。
【专利说明】一种虎杖毛状根生产白黎芦醇及扩大培养的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及涉及一种虎杖毛状根的诱导及利用生物反应器扩 大培养的方法，具体为一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇（Resveratrol, 3,4 ' ，5-trihydroxy-trans-stilbene)即反式 3, 4'，5-三羟基芪，为二苯乙烯类化合物，以游离态和糖苷结合态两种形式存在于虎杖、 葡萄、花生等多种植物中，其中以虎杖中含量最为丰富。是一种重要的植物抗毒素。白藜芦 醇具有多种药理活性，如抗菌、抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗艾滋病毒活性等，能修复非 典型肺炎方剂所致的细胞DNA损伤，尤其对人类健康的大敌一肿瘤和心脏病的治疗和预防 有明显的作用。
[0003] 虎杖为寥科虎杖属多年生草本植物，是我国传统中药材，广泛分布于华东、中南 及陕西、甘肃、四川等地，虎杖提取物具有抗炎、预防心血管疾病等多种药理活性，主要活 性成分为白藜芦醇和大黄素。据统计,虎杖再生量为9. 8*106kg/年，其可持续采挖量为 4. 95*106kg/年，市场需求量为6. 0*106kg/年。因此，虎杖的野生资源已面临过度采挖的局 面。而据统计提取1吨白藜芦醇需要消耗500吨虎杖原料，但白藜芦醇在植物体内含量普 遍较低。
[0004] 为解决药用植物的供需矛盾，人们多采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽 培的药用植物中，一些药用植物生产周期很长，若以常规方法育种或育苗，需要花费较长时 间。还有一些药用植物因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加。另外 一些药用植物，则因病毒危害导致退化，严重影响了产量和品质。为保证药用植物资源的可 持续利用，利用生物工程的途径对珍贵资源进行细胞或组织培养、有效成分的关键基因克 隆与转化等技术，可能是解决中药产业化的有效途径。于是，积极研究药用植物资源的再生 技术，使有限的资源为人类持续利用迫在眉睫。而毛状根技术具有生长快速、不需外援植物 激素、合成次生代谢物能力强而稳定、不受季节和时间限制等优点。而Ri质粒转化的毛状 根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物代谢产物的工业 化生产提供了广阔前景。
[0005] 目前据报道虎杖已成功诱导毛状根，李卓玺等诱导虎杖毛状根中白藜芦醇的含量 为8. 21mg/kg ;于树宏等探讨影响虎杖毛状根高频诱导的因素，结果表明成熟叶片是转化 率较高的外植体，感染IOd左右可形成毛状根，平均诱导率为55. 66%，诱根密度为4. 30 ; 而苗晓燕等对虎杖毛状根DNA提取方法进行了研究，结果表明改良CTAB法解决了虎杖富含 多酚、多糖等类物质难以提取高质量DNA的问题，提取的DNA质量较好，纯度较高。而于树 宏等为虎杖毛状根制备虎杖苷进一步申请了专利，专利号为200510012809. 7,但目前只是 停留在实验阶段，还未有进一步进行产业化方面的研究。目前，利用虎杖毛状根生产白藜芦 醇已有报道，但利用生物反应器进行虎杖毛状根生产白藜芦醇产业化方面还未见报道。因 此，利用虎杖毛状根生产白藜芦醇，特别是通过生物反应器进行产业化，对解决药用植物次 生代谢产物白藜芦醇的工业化生产提供了的一条有效途径，对解决虎杖资源现状具有重要 意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，并通过 虎杖组织培养技术、毛状根培养技术及生物反应器来大量生产白藜芦醇，从而替代野生资 源，为白藜芦醇的生产提供一条有效的新途径。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] -种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，该方法包括以下步骤：
[0009] (1)外植体1的消毒
[0010] 取野外虎杖带芽茎段自来水流水冲洗3h，在超净工作台中酒精浸泡60s，无菌水 冲洗3-5遍，0. 1 %升萊浸泡5-8min (根据材料老嫩程度而定），无菌水冲5-6遍，用灭菌过 的滤纸吸干水分，备用。
[0011] (2)虎杖组培苗的诱导与继代培养
[0012] 将步骤（1)中所选用外植体1切成I. 5cm带芽茎段接种于MS+6-BA2. 5mg/ L+NAAO. 5mg/L，带长至 30d 后继续继代培养，选用 MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/ L+TDZO. 05mg/L，培养条件：温度25±2 °C，采用日光灯，光照1500-20001ux，光照时间 14-16h。每25-30天继代一次，继代2- 3次后待长出健壮、发育良好的完整虎杖组培苗备 用。
[0013] ⑶虎杖毛状根的诱导
[0014] 1)预培养
[0015] 将步骤⑵中获得的组培苗叶片（带叶柄，I. 0cm*l. Ocm)或茎（I. 5cm)，转接至MS 空白培养基中暗培养2天，培养温度25 ± 2°C。
[0016] 2)发根农杆菌的活化
[0017] 将发根农杆菌ATCC15834(由广东省林业科学研究院生物技术研究所馈赠）在YEB 固体培养基中活化，挑取单个菌落接种于YEB液体培养基中，在28°C，120r ^mirT1和黑暗条 件下振荡培养20h，使其达到生长对数期，以感染虎杖外植体2,测定其OD值为0. 2-0. 5。
[0018] 3)侵染与共培养
[0019] 将经过预培养的外植体2(叶片或茎）转移至已活化好的农杆菌菌悬液中，浸染 lOmin。然后用无菌滤纸吸取外植体2表面多余的菌液，将其接种于MS空白培养基+乙酰 丁香酮（AS) 20-50mg/L，于25°C黑暗条件下共培养2d。
[0020] 4)除菌及优化培养
[0021] 将步骤3)中共培养2天的外植体2开始除菌，用无菌水冲洗3次，转移至MS+头 孢噻]3亏钠（cefotaxime)500mg/L培养基中（即除菌培养基），25°C，14h · (Γ1散射光下进行 除菌培养。每5d转接一次，反复继代除菌，直到培养基无菌斑出现。将诱导出的虎杖毛状 根继续在1/2MS空白液体培养基中继续继代增值2-3次。
[0022] (4)虎杖毛状根PCR检测
[0023] 将步骤4)中获得的虎杖毛状根进行DNA提取，获得含有RolB和tms基因反应体 系，获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和紫外检测。RolB的扩增条带大小为422bp，tms的 大小为910bp。
[0024] (5)虎杖毛状根的根系优选及生物反应器的扩大培养
[0025] 将经PCR检测出的毛状根，且挑选除菌彻底，分枝多，生长快的毛状根剪成长 l-3cm，在IL气升式生物反应器中加入1/2MS空白液体培养基加入3%蔗糖、酸水解酪蛋白 〇-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、L-苯丙氨酸0-50mg/L，接种量为湿重的30g毛状根，要求全 部无菌，PH5. 8 - 6. 5,温度：25±2°C，暗培养，通气量为0. 05vvm，当毛状根生长达到对数期 时,称取湿重、干重。
[0026] (6)虎杖毛状根中白藜芦醇HPLC的含量测定
[0027] 将经HPLC含量检测虎杖毛状根中白藜芦醇的含量表明，虎杖毛状根中白藜芦醇 的含量为210-280 μ g/g，白藜芦醇苷为1500-2340 μ g/g。
[0028] (7)白藜芦醇的提取分离纯化
[0029] 将步骤（5)中虎杖毛状根干燥，粉碎，加蒸馏水（pH = 10)搅拌、过滤，将滤渣再次 浸提，过滤，合并滤液，调PH为弱酸性。将粗品用乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后进行硅胶柱 层析。将含有白藜芦醇的层析产物用适量乙醇反复结晶后，50°C真空干燥。密封于瓶中，避 光保存。
[0030] 本发明中所述培养基及专业术语：
[0031] (I)MS基本培养基为（单位为mg/L) :MS (Murashige and Skoog，1962)包括大量元 素（硝酸铵1650,硝酸钾1900,二水氯化钙440,七水硫酸镁370,磷酸二氢170)可配成20 倍母液，取母液50ml/L ;微量元素（一水硫酸锰22. 3,七水硫酸锌8. 6,六水氯化钴0. 025， 无水硫酸铜0. 025,硼酸6. 2,二水钥酸钠0. 25,碘化钾0. 83)配成母液200倍，取母液5ml/ L ;铁盐（七水硫酸亚铁28. 7,乙二胺四乙酸二钠37. 3)配成母液200倍，取母液5ml/L ;有 机（烟酸0.5,烟酸吡哆醇0.5,盐酸硫胺素0. 1，甘氨酸2.0)配成母液200倍，取母液5ml/ L，另加肌醇0. lg，蔗糖30g，固体培养基加琼脂粉6. 5g，本发明中1/2MS液体培养基是大量 元素减半，但硝酸铵含量不变，其余不变，PH5. 8-6. 5。
[0032] (2) YEB培养基配方（单位为g/L):牛肉浸膏5.0、酵母浸膏1.0、蛋白胨5.0、蔗糖 5. 0、七水硫酸镁0. 5、固体培养基加琼脂粉8g，PH7. 0。
[0033] (3)抗生素为头孢噻厢钠浓度（Cefotaxime),卡那霉素（kan)，羧节西林钠 Cb (Carbenicillin)
[0034] (4)本发明中所述激素为6-BA (6-苄基氨基腺嘌呤），NAA (萘乙酸），TDZ (噻苯 隆）
[0035] (5)本发明中所述外植体1为野生虎杖带芽茎段。
[0036] (6)本发明中所述外植体2为虎杖组培苗中剪切的叶片或茎。
[0037] (5)本发明中所述的干重是指虎杖毛状根于干燥箱中70°C干燥至恒重。
[0038] (6)本发明中所述的湿重是指取毛状根培养物，用滤纸吸取毛状根表面多余水分 吸干，称得湿重。
[0039] (7)本发明中所述3%蔗糖是指IL培养基中添加30g蔗糖。
[0040] (8)本发明中所述的毛状根诱导率
[0041] 毛状根诱导率=产生毛状根外植体2数/总外植体2数X 100%。
[0042] (9)虎杖外植体1增殖倍数的测定方法
[0043] 增殖倍数=(收获时的重量-接种量）/接种量
[0044] 增长率=(最终收获干重-接种干重）/接种干重
[0045] (10)本发明中所述的白藜芦醇产量测定方法
[0046] 白藜芦醇产量=收获干重*白藜芦醇含量
[0047] 本发明中所述生物反应器为IL气升式内环流发酵罐（南京天汇AIF-S-XX)，利用 通入反应器的无菌空气形成的上升流进行供氧和搅拌，通过对各参数的控制，来达到稳定 高产，降低虎杖原材料消耗等，各参数包括：温度、PH值、空气流量、搅拌转速、溶氧速度、泡 沫高度、压强等。通过对这些实验数据的设计，为后续放大培养虎杖毛状根的生产提供了重 要参考依据。
[0048] 基本操作条件：将发酵罐连接好进行灭菌后，于超净工作台中进行逐层均匀接种， 反应器中培养液的体积为1L，接种量为湿重的30g，接种后发酵罐放入恒温培养室中进行 暗培养，pH值为5. 8-6. 0,温度为25±2°C，通气量为0. 05vvm。在培养过程中，根据蒸发的 水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变。
[0049] 本发明的积极效果体现在：
[0050] (1)在本发明中，通过生物反应器的大规模生产，使虎杖生产白藜芦醇产业化提供 了一条有效途径，具有极大的适用性。
[0051 ] (2)本发明是在实验室条件下进行的，通过毛状根大量生产白藜芦醇，与野生和栽 培虎杖相比，可获得稳定的质量和产量，不受自然条件和时间的限制，不占用耕地面积，这 样节约了大量时间，人力。
[0052] (3)通过生物反应器中添加诱导子、前体物等，极大的提高了虎杖毛状根次生代 谢产物生物量，提高了白藜芦醇及其苷的含量。在本发明中，毛状根的产量可达到干重 15. 32- 21. 65g/L/周期（30-40天），其中白藜芦醇最高产量可达269. 48 μ g/g，白藜芦醇 及其苷的产量可达210-280 μ g/g和1500-2340 μ g/g，其毛状根增值率可达40-60倍。是 相同条件下普通毛状根的3-4倍，自然根的10倍。
[0053] (4)通过人工调控优化培养条件，可提高毛状根的生长和次生代谢产物的合成，极 大提高了白藜芦醇的产量。
[0054] (5)本发明中培养毛状根培养基不要添加任何激素，暗培养。因此可以大大降低生 产成本，提高了生产效率。
[0055] (6)虎杖毛状根生产周期一般为30天到40天，比野外生长时间（虎杖一般生长周 期为3-5年）要短很多。这样节约了时间，节约了虎杖野生资源，对环境保护也起到了一定 的作用。
[0056] (7)本发明工艺操作简单，重复性好，规模化生产迅速方便。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发 明上述主题的范围仅限于下述实施例，凡基于本
【发明内容】
所实现的技术均属于本发明的范 围。实施例中所用虎杖植株来自于四川省凉山州甘洛县。
[0058] 实施例1 :
[0059] (1)外植体1消毒
[0060] 选取虎杖幼嫩茎段作为外植体1，进行消毒处理，步骤如下：带芽茎段自来水流水 冲洗3h，在超净工作台中酒精浸泡60s，无菌水冲洗5遍，0. 1 %升汞浸泡5-8min，无菌水冲 6遍，用灭菌过的滤纸吸干水分，备用。
[0061] (2)芽的诱导及继代增值
[0062] 将步骤（1)中已灭好菌的外植体1转接至芽诱导培养基：MS固体基本培养基 +6-BA2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L中，7d后开始长出芽点，30d后长成完整植株。继续 继代培养，继代培养基：MS固体基本培养基+6-BA2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L+TDZ0. 05mg/L+蔗糖 30g/L，待长至发育良好的完整虎杖组培苗后，备用。生长条件：温度25 ± 2°C，采用日光灯， 光照 1500-20001ux，光照时间 14-16h。
[0063] (3)虎杖毛状根的诱导
[0064] 取步骤（2)所用虎杖组培苗叶片（带叶柄部分），转接至MS空白培养基中暗培养 2天，培养温度25±2°C。
[0065] (4)菌种的活化
[0066] 挑取保存在4°C YEB固体平板培养基上的发根农杆菌ATCC15834,挑取单个菌落于 YEB液体培养基中，在28°C，120r ^mirT1和黑暗条件下振荡培养20h，使其达到生长对数期， 以感染虎杖叶片。测定其OD值为0.4。
[0067] (5)侵染与共培养
[0068] 将步骤（3)中经过共培养的叶片用无菌解剖刀小心划伤叶片表面 (1.0cm*1.0cm)，然后转移至步骤（4)已活化好的菌种菌悬液中，侵染IOmin,然后用无菌滤 纸吸取外植体2表面多余的菌液，将其接种于MS空白培养基+AS20mg/L，于25°C黑暗条件 下共培养2d。
[0069] (6)除菌及优化培养
[0070] 将步骤（5)中经过共培养的虎杖叶片，用无菌水冲洗3次，转移至除菌培养基MS 固体基本培养基+cef500mg/L中，25°C，14h · Cf1散射光下进行除菌培养。每5d转接一次， 反复继代除菌，直到培养基无菌斑出现。除菌5天后开始长出毛状根，20d后开始长出大量 毛状根。将诱导出的至除菌完全后虎杖毛状根继续在1/2MS空白液体培养基中继续继代增 值2-3次。毛状根生长特点：根细长，多分支，无向地性，辐射状。
[0071] (7)虎杖毛状根的PCR检测
[0072] 将步骤（6)中获得的虎杖毛状根和叶片（对照），0. 2g，加入液氮迅速研磨成粉末， 转入到已加入800 μ 165°C预热的CTAB提取液和10 μ 1巯基乙醇的4ml离心管中，用力混 匀。离心管在65°C水浴下温浴lh，其间每隔10分钟轻轻倒转混匀，每次持续Imin左右。加 入等体积氯仿/异戊醇为24:1的混合液，轻轻颠倒混匀lOmin。在室温下，lOOOOr/min离 心lOmin，移上清液到新管中。加入等体积的异丙醇，出现絮状沉淀。颠倒摇匀，使絮状沉淀 聚集，并5000rpm离心5min收集沉淀。沉淀加入200 μ 1的无水乙醇润洗两次，5000rpm离 心5min倒出无水乙醇，放置几分钟，待乙醇挥发尽后，加入TE溶液100 μ 1溶解DNA。
[0073] 毛状根rolB基因的PeR检测，Ri质粒rolB基因的PeR引物由上海生工合成，上游 引物：5' GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3' ；下游引物P25' -GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3'， 在25yllPCR反应液中，Golden Easy PCR system(天根生化）12·5μ1，上、下引物各 1 μ 1 (终浓度20pmol/L)，模板DNA2 μ 1，用超纯水补足25 μ 1。94°C预变性5min，94°C变性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸 2min，35 个循环。
[0074] 扩增产物在I. 7%琼脂糖凝胶电泳和紫外检测进行分析，结果表明：PCR反应可 以从虎杖毛状根中扩增到预期的422bp和910bp左右的特异性片段，表明ATCC15834中 的rolB基因和tms基因的Ri TL-DNA和TR-DNA部分已整合到虎杖毛状根中。而未经 ATCC15834浸染的叶片未检测到特异性片段。
[0075] (8)虎杖毛状根的根系优选及生物反应器的扩大培养
[0076] 将经过步骤（7)检测过毛状根，且挑选除菌彻底，分枝多，生长快的毛状根剪成长 1- 3cm，在IL气升式发酵罐中加入1/2MS空白液体培养基+3 %蔗糖+酸水解酪蛋白lg/L+黑 曲霉10mg/L+L-苯丙氨酸15mg/L+NH4N038 2 5mg/L，接种量为湿重的30g，整个过程在超净工 作台中进行，要求全部无菌，pH值为5. 8-6. 5,温度为25±2°C，暗培养，通气量为0. 05vvm。 在培养过程中，根据蒸发的水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变。
[0077] 实施例2 :
[0078] (1)同实施例 1(1)
[0079] (2)芽的诱导及继代增值
[0080] 将步骤⑴中已灭好菌的茎段转接至芽诱导培养基：MS固体基本培养基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L中，7d后开始长出芽点，30d后长成完整植株。继续 继代培养，继代培养基=MS固体基本培养基+6-BAO. 5mg/L+IAA0. 5mg/L+TDZ0. 05mg/L+蔗糖 30g/L，待长至发育良好的完整虎杖组培苗后，备用。生长条件：温度25 ± 2°C，采用日光灯， 光照 1500-20001ux，光照时间 14-16h。
[0081] (3)虎杖毛状根的诱导
[0082] 取步骤⑵所用虎杖组培苗莖，转接至MS空白培养基中暗培养2天，培养温度 25±2°C。
[0083] (4)同实施例 1(4)
[0084] (5)侵染与共培养
[0085] 将步骤（3)中经过共培养的茎用无菌解剖刀划伤茎段（L 0cm*L Ocm)，然后转移 至步骤（4)已活化好的菌种菌悬液中，侵染lOmin，然后用无菌滤纸吸取茎表面多余的菌 液，将其接种于MS空白培养基+AS20mg/L，于25°C黑暗条件下共培养2d。
[0086] (6)除菌及优化培养
[0087] 将步骤（5)中经过共培养的虎杖茎，用无菌水冲洗3次，转移至除菌培养基MS固 体基本培养基+kan500mg/L中，25°C，14h · (Γ1散射光下进行除菌培养。每5d转接一次，反 复继代除菌，直到培养基无菌斑出现。除菌5天后开始长出毛状根，20d后开始长出大量毛 状根。将诱导出的至除菌完全后虎杖毛状根继续在1/2MS空白液体培养基中继续继代增值 2- 3次。毛状根生长特点：根细长，多分支，无向地性，辐射状。
[0088] (7)同实施例 1(7)
[0089] (8)虎杖毛状根的根系优选及生物反应器的扩大培养
[0090] 将经过步骤（7)检测过毛状根，且挑选除菌彻底，分枝多，生长快的毛状根剪成长 l-3cm，在IL气升式发酵罐中加入1/2MS空白液体培养基+3%蔗糖+酸水解酪蛋白3g/L+ 黑曲霉30mg/L+NH4N038 2 5mg/L，接种量为30g (湿重），整个过程在超净工作台中进行，要求 全部无菌，pH值为5.8-6.，温度为25±2°C，暗培养，通气量为0.05vvm。在培养过程中，根 据蒸发的水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变。
[0091] 实施例3:
[0092] (1)同实施例 1(1)
[0093] (2)芽的诱导及继代增值
[0094] 将步骤⑴中已灭好菌的+转接至芽诱导培养基：MS固体基本培养基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0. 5mg/L+蔗糖30g/L中，7d后开始出现芽点，30d后长成完整植株。继 续继代培养，继代培养基=MS固体基本培养基+6-BA2. Omg/L+NAAO. 5mg/L+蔗糖30g/L， 待长至发育良好的完整虎杖组培苗后，备用。生长条件：温度25±2°C，采用日光灯，光照 1500-20001ux，光照时间 14-16h。
[0095] (3) (4) (5)同实施例 1 步骤（3) (4) (5)
[0096] (6)除菌及优化培养
[0097] 将步骤（5)中经过共培养的虎杖组培苗叶片，用无菌水冲洗3次，转移至除菌培养 基MS固体基本培养基+cb300mg/L中，25°C，14h · Cf1散射光下进行除菌培养。每5d转接 一次，反复继代除菌，直到培养基无菌斑出现。除菌5天后开始长出毛状根，20d后开始长出 大量毛状根。将除菌完全的虎杖毛状根继续在1/2MS空白液体培养基中继续继代增值2-3 次。毛状根生长特点：根细长，多分支，无向地性，辐射状。
[0098] (7)同实施例1中的步骤（7)
[0099] (8)虎杖毛状根的根系优选及生物反应器的扩大培养
[0100] 将经过步骤（7)检测过毛状根，且挑选除菌彻底，分枝多，生长快的毛状根剪成长 l-3cm，在IL气升式发酵罐中加入1/2MS空白液体培养基+3%蔗糖+酸水解酪蛋白lg/L+ 黑曲霉30mg/L-苯丙氨酸15mg/L+NH 4N03825mg/L，接种量为30g (湿重），整个过程在超净工 作台中进行，要求全部无菌，PH5. 8 - 6. 5,温度：25±2°C，暗培养，通气量为0. 05vvm。在培 养过程中，根据蒸发的水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变。
[0101] 实施例4
[0102] 虎杖毛状根中白藜芦醇含量测定（HPLC测定）
[0103] (1)标准曲线的绘制
[0104] 分别称取白藜芦醇及其苷2. 5mg(对照品来自北京世纪奥科生物技术有限公司， 含量98%以上），置于25ml容量瓶中，甲醇溶液溶解，配制成含白藜芦醇及其苷0. 10mg/ml 对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液I. 〇、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0ml，置于IOml容量瓶中，甲醇 稀释至刻度，制成不同溶度的对照品溶液。
[0105] (2)供试品溶液的制备
[0106] 取实施例1-3中任意一项实施例中得到的毛状根，于电热鼓风干燥箱中70°C烘 干，研成粉末，取毛状根粉末〇. lg，精密称定，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，加热回流 30min，冷却至室温，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤 液，即得。
[0107] (3)色谱条件
[0108] 色谱柱：日本岛津CLC-ODS柱（150mm*6mm，i. d. 5 μ m);流动相为乙腈：水= 41:59，流速：1.01111/1^11，柱温 ：301：;进样量：1(^1^，检测波长：30311111。理论塔板数不低于 3000,分离度大于1. 5。分别以以上不同溶度的溶液，每次进样量10 μ L，按照上述色谱条件 测定各峰面积。分别以峰面积和含量进行线性回归。峰面积积分值Y为纵坐标，对照品进 样量X为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归。
[0109] (4)测定法
[0110] 分别紧密吸取吸取对照品溶液和供试品溶液各1〇μ 1，注入HPLC中，测定，即 得。根据检测结果获得虎杖毛状根中白藜芦醇含量为210-280μ g/g，白藜芦醇苷为 1500-2340 μ g/g〇
[0111] 实施例5
[0112] 白藜芦醇的提取分离纯化：
[0113] 将实施例1-3中任意一项实施例步骤（8)中虎杖毛状根干燥，并粉碎至一定粒度， 并加入事先调节pH值=10的碱性水溶液，匀速搅拌并加热煮沸lh，趁热过滤；以相同的方 法再提取一次。并用lmol/LHCL将滤液调节PH = 3,静置。待滤液PH无变化，则白藜芦醇 沉淀完全，将沉淀离心分离，真空干燥。
[0114] 将上述粗品溶解后以乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩后，以一定目数的硅胶扮样，上 柱，进行硅胶柱层析，以体积比为2:1的乙酸乙酯-石油醚等度洗脱，定量接收洗脱液，并用 紫外分光光度计于307nm监测其吸光值，以TLC跟踪检测（展开剂为氯仿：乙酸乙酯：甲酸 =5:4:1)，待洗脱完全，合并相同洗脱液，真空旋干，即得纯度较高的白藜芦醇产品。
[0115] 对比例1 :
[0116] 虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法步骤同实施例1中的步骤及培养条 件，仅改变外植体2,测定外植体2对虎杖毛状根诱导的影响，影响结果见下表：
[0117]
【权利要求】
1. 一种虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在于该方法包括以下步 骤： (1) 植物材料的选取与处理 选取野生虎杖带芽茎段切成2-4cm的小段为外植体1，并对其进行消毒处理； (2) 植物组培苗的诱导 将步骤（1)中外植体1接种于诱导培养基上，在温度为25±2°C，光照强度 1500-20001ux，光照时间14-16h，在25天后，将其虎杖诱导芽进行继代培养； (3) 组培苗继代培养 将步骤（2)中获得的诱导芽接种于继代培养基中，继续继代培养，培养条件同步骤（2); 待叶片完全张开，长至成熟组培苗后用于虎杖毛状根的培养； (4) 虎杖毛状根的诱导及继代培养 将步骤（3)中获得的成熟组培苗叶片或茎作为外植体2用于虎杖毛状根诱导；具体步 骤如下： a、 外植体2的预培养：将叶片或茎在MS空白培养基中暗培养两天； b、 菌种活化：发根农杆菌在YEB培养基中活化； c、 共培养：将活化后的发根农杆菌与虎杖叶片、茎侵染10_30min后，放置MS空白培养 基中暗培养两天； d、 除菌培养：将共培养后的叶片或茎在含有头孢噻肟钠或卡那霉素或羧苄西林钠的 MS空白培养基中除菌培养，直到除菌完全； 培养条件：温度为25±2°C，暗培养，每3-6天除菌一次，直到除菌完全； e、 继代培养：将除菌完全长出毛状根0. 1-0. 5g接种于1/2MS空白液体培养基中进行继 代培养2-5次，每20天继代培养一次，均在25 ±2°C的条件下培养； (5) 虎杖毛状根PCR检测 DNA提取：提取虎杖毛状根DNA ; PCR体系：获得含有rolB和tms引物的PCR体系； 采用琼脂糖凝胶电泳获得目标条带； (6) 生物反应器大规模培养虎杖毛状根 在1L气升式内环流发酵罐中加入1/2MS空白液体培养基，另加入3%蔗糖、酸水解酪蛋 白0-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、L-苯丙氨酸0-50mg/L，接种量为湿重的30g毛状根，要求 全部无菌，口11值为5.8-6.5，温度：25±21：，暗培养，通气量为0.05^111条件下进行培养， 在培养过程中，根据蒸发的水量通过蠕动泵进行定时补水，保持总体积不变； (7) 虎杖毛状根的提取分离； (8) 采用HPLC测定虎杖毛状根中白藜芦醇的含量。
2. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：步骤（1)中所述外植体1为野生虎杖带芽茎段，步骤（4)中所述外植体2为虎杖组培苗 中剪切的叶片或茎。
3. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：步骤（2)和步骤（3)中虎杖外植体1诱导芽培养基均为MS+6-BA2. 5mg/L+NAA0. 5mg/L， 继代培养基为 MS+6-BA0. 3mg/L+NAA0. 5mg/L+TDZ0. 05mg/L，pH 值为 5. 8-6. 0。
4. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：步骤（4)要求外植体2叶片大小为1. Ocm*l. Ocm，茎长为1. 5cm。
5. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：所述的步骤（4)中发根农杆菌为ATCC15834。
6. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：所述的步骤（4)中头孢噻肟钠浓度为10-500mg/L，卡那霉素10-300mg/L，羧苄西林钠 10-300mg/L〇
7. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：所述的步骤（4)中将侵染发根农杆菌的外植体2放入除菌培养基中，温度为25±2°C，暗 培养，每3-6天除菌一次，直到除菌完全。
8. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：所述的步骤（4)中将进行除菌处理后的毛状根继代培养室在温度为25±2°C，暗培养中 振荡培养，所用培养基为1/2MS空白培养基，无任何激素，摇床转速为120r/min。
9. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：所述的步骤（5)中虎杖毛状根中整合了来自于Ri质粒的诱导毛状根的基因rolB和 tms〇
10. 根据权利要求1中所述的虎杖毛状根生产白藜芦醇及扩大培养的方法，其特征在 于：步骤（6)中加入质量百分含量为3%蔗糖、酸水解酪蛋白0-5g/L、黑曲霉0-100mg/L、 L_苯丙氨酸0-50mg/L，提高白藜芦醇及其苷的生物量；步骤（6)中所述的生物反应器为1L 气升式内环流发酵罐。
【文档编号】C12P7/22GK104372034SQ201410443907
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】洪汉君, 熊小灿 申请人:成都市三禾田生物技术有限公司