拟茎点霉rna聚合酶(rpb1)基因扩增引物及其设计方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了拟茎点霉RNA聚合酶(RPB1)基因扩增引物及其设计方法和应用。本发明设计的是针对拟茎点霉属真菌的通用引物。其上游引物PhR1-F有43个碱基：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物PhR1-R有43个碱基：AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。本发明设计的拟茎点霉RNA聚合酶基因扩增引物可以快速的对拟茎点霉属真菌进行大规模的遗传背景分析，为我国拟茎点霉的种类鉴定、地理种群鉴别或检验检疫工作提供了重要的工具。
【专利说明】拟茎点霉RNA聚合酶（RPB1)基因扩增引物及其设计方法和 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及拟茎点霉真菌鉴别【技术领域】，具体的说，涉及拟茎点霉RNA聚合酶 (RPB1)基因扩增引物及其设计方法和应用。
【背景技术】
[0002] 拟莖点霉属（Phomopsis (Sacc. ) Bubak)是半知菌亚门（Deuteromycotina)、腔孢 纲（Coelomycetes)、球壳抱目（Sphaeropsidales)、球壳抱科（Sphaeropsidaceae)中的重 要真菌属，其有性态为间座壳属（Diaporthe)，含有400多个不同的种、呈世界性分布，主要 集中在热带和亚热带地区。拟茎点霉属真菌是农业和林业上重要的病原菌，寄主植物共74 科，可引起多种植物病害，例如溃疡、烂茎、果腐、叶枯、枝枯、根腐、树皮坏死等。此外，该属 的部分种类还是植物的重要内生菌和腐生菌，甚至可以危害人或其他哺乳动物，在生态系 统中占有重要的地位。
[0003] RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerases)在基因表达的过程中扮演着很 重要的角色。早在1984年以前，生物化学家就已经在真核生物中成功地分离出3种RNA 聚合酶。其中，RNA聚合酶II由12个亚基组成（RPB1-RPB12)，负责转录生成hnRNA和 mRNA。RPB1 (the largest RNA polymerase subunit)基因负责编码 RNA 聚合酶 II 的大亚 基，具有单拷贝和进化速率慢的特点。
[0004] RPB1 基因片段与其他基因片段如 ITS (internal transcribed spacer)、RPB2、 EF(elong ation factor)等相结合，目前已广泛地应用于真菌的分类和系统发育研究。 RPB1基因适用于亲缘关系较近、外形相似的真菌间的分析比较，在拟茎点霉真菌种类鉴定、 地理种群鉴别或口岸检验检疫中具有重要应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一对可高效扩增拟茎点霉RPB1基因的扩增引物。
[0006] 本发明的另一个目的是提供上述引物的设计方法。
[0007] 本发明的进一步目的是提供上述引物在拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别和检验 检疫中的应用。
[0008] 本发明设计的拟茎点霉RPB1基因扩增引物其上游引物PhRl-F有43个碱基：CGC CAGGGITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物 PhRl-R 有 43 个碱基：AGCGGATAA CAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。
[0009] 本发明的拟茎点霉RPB1基因扩增引物设计的步骤为：登陆GenBank搜索目前已 测定全序列的60种拟茎点霉RPB1基因，去掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，设计出 扩增序列，并在5'端加入测序序列，从而获得一对通用引物：其上游引物PhRl-F有43个碱 基：CGCCAGGGITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物 PhRl-R 有 43 个碱基：AGC GGATAACAATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。扩增片断大小在 750bp 左右。
[0010] 可扩增拟茎点霉属真菌RPB1基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下： PCR反应体系为25yL，内含2X Taq MasterMix、10yM的引物PhRl-F和引物 PhRl-R、含 50 ?150ng 的 DNA 模板溶液、ddH20。
[0011] 2 X Taq MasterMix 12. 5 μ L PhRl-F lyL PhRl-R lyL Template 1 μ L ddH20 9. 5 μ L 扩增条件为：94°C预变性3min，然后94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，共35 个循环，最后在72°C充分延伸lOmin。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度 及亮度。
[0012] 本发明所述的拟茎点霉RPB1基因扩增引物能扩增拟茎点霉RPB1基因，均能获得 单一的目的DNA片段，产物大小为750bp左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其 步骤为：PCR扩增产物经初步定量后，浓度达lOOng/μΙ的样品委托公司进行双向直接测 序，测序引物为M13F-47(10yM)和RV-M(lOyM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测 序仪。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 本发明的拟茎点霉RPB1基因扩增引物对部分拟茎点霉RPB1基因进行扩增，均能获得 单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为750bp左右，经测序及与GenBank上同源序 列的比较，证实为拟茎点霉RPB1基因的扩增产物。本发明设计的拟茎点霉RPB1基因扩增 引物可以快速地对多种拟茎点霉进行大规模的遗传背景分析，准确鉴定某些难于鉴别的近 缘物种，为我国拟茎点霉种类鉴定、地理种群鉴别或检验检疫工作提供了重要的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1、图2均为PhRl-F/PhRl-R扩增不同拟茎点霉RPB1基因的电泳图谱。
[0015] 其中M :DNA分子量标准（lOObp DNA Ladder)，N :阴性对照，H20 :水对照，1 - 27 : 依次为扁桃拟莖点霉梨干枯拟莖点霉Λ/Α--')、 大豆拟莖点种腐病菌J7a )、苹果拟莖点菌J7 )、芒果 微客存、霉 QPhotnopsis mangiferae)、外飞殊生微客存、霉 QPhomopsis phyl lanthicola\ 柿苗拟莖点霉ro)、茶溃瘍拟莖点霉iAeae )、莖生拟莖点霉 石槽干腐菌Fersofliaaa)、葡萄生拟莖点霉菌 (Miomopsis viticola)、芦麥拟菩点、霉（Miomopsis asparagi )、綠拟菩点、霉（Miomopsis rhapic/is)、猫褐级撒吝点、霉 iPhomopsis vexans)> ? ^ M iPhomopsis cinnamom)、 蔓绿绒拟莖点霉)、花烛拟莖点霉a/? iAarii )、黄瓜 黑色根腐病菌5?6?το iioiofes )、栗拟莖点霉(/%ο〃?ο/7?·5· cas iaflea )、柿拟 莖点霉(/%〇?〇Asi5· i/iiosAF，)、茴香拟莖点霉/beflicWi)、十字花拟莖点霉 iPhomopsis cruciferae ) > ^β iPhomopsis amygdali ) > ]〇] j#?^M iPhomopsis 仙人掌拟莖点霉(/%ο?ο/7?·5· cacii)、橡胶拟莖点霉(/%ο?ο/7?·5· AeKeae)、小 麦拟莖点9 iPhomopsis con tro versa ) 〇
【具体实施方式】
[0016] 登陆GenBank搜索目前已测定线粒体DNA全序列的60种拟茎点霉RPB1基因，去 掉不完全和部分的序列，寻找保守序列，设计出扩增序列，并在5'端加入测序序列，从而获 得一对针对拟茎点霉属真菌RPB1基因的通用引物：其上游引物PhRl-F有43个碱基：CGCC AGGGITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG，下游引物 PhRl-R 有 43 个碱基：AGCGGATAAC AATTTCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。扩增片断大小在 750bp 左右。
[0017] 可扩增拟茎点霉属真菌RPB1基因的通用引物PCR反应体系和反应条件如下： PCR反应体系为25yL，内含2X Taq MasterMix、10yM的引物PhRl-F和引物 PhRl-R、含 50 ?150ng 的 DNA 模板溶液、ddH20。
[0018] 2 X Taq MasterMix 12. 5 μ L PhRl-F lyL PhRl-R lyL Template 1 μ L ddH20 9. 5 μ L 扩增条件为：94°C预变性3min，然后94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，共35 个循环，最后在72°C充分延伸lOmin。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度 及亮度。
[0019] 本发明所述的拟茎点霉RPB1基因增引物能扩增拟茎点霉RPB1基因，均能获得单 一的目的DNA片段，产物大小为750bp左右，并对所有PCR扩增产物进行直接测序。其步骤 为：PCR扩增产物经初步定量后，浓度达lOOng/μ 1的样品委托公司进行双向直接测序， 测序引物为M13F-47(10yM)和RV-M(lOyM)，序列分析仪为ΑΒΙ 3730型全自动DNA测序 仪。
[0020] 本发明的拟茎点霉RPB1基因扩增引物对部分拟茎点霉RPB1基因进行扩增，均能 获得单一的目的DNA片断，特异性扩增产物大小为750bp左右，经测序及与GenBank上同 源序列的比较，证实为包含拟茎点霉RPB1基因的扩增产物。其主要扩增的拟茎点霉真菌包 括以下种类： 扁桃拟莖点霉（Phomopsis amygdaliana)、梨干枯拟莖点霉（Phomopsis fukushii)、 大豆拟莖点种腐病菌（Phomopsis longicolla)、苹果拟莖点菌（Phomopsis mali)、芒果 拟莖点霉（Phomopsis mangiferae)、叶下珠生拟莖点霉（Phomopsis phyllanthicola)、 柿苗拟莖点霉（Phomopsis rojana)、茶溃瘍拟莖点霉（Phomopsis theae)、莖生拟莖点霉 (Phomopsis truncicolaMiura)、石槽干腐菌（Phomopsis versoniana)、葡萄生拟莖点霉菌 (Phomopsis viticola)、芦舆拟莖点霉（Phomopsis asparagi)、綜竹拟莖点霉（Phomopsis rhapidis)、爺褐纹拟莖点霉（Phomopsis vexans)、樟拟莖点霉（Phomopsis cinnamom)、 蔓绿绒拟莖点霉（Phomopsis philodendri)、花烛拟莖点霉（Phomopsis anthurii)、黄瓜 黑色根腐病菌（Phomopsis sclerotioides)、栗拟莖点霉（Phomopsis castanea)、柿拟 莖点霉（Phomopsis diospyr)、茴香拟莖点霉（Phomopsis foeniculi)、十字花拟莖点霉 (Phomopsis cruciferae)、杏拟莖点霉（Phomopsis amygdali )、苘麻拟莖点霉(Phomopsis abutilonis)、仙人掌拟莖点霉（Phomopsis cacti)、橡胶拟莖点霉（Phomopsis heveae)、小 麦拟莖点霉（Phomopsis controversa)。其电泳图谱如图1、图2所示，从而可对拟莖点霉 真菌进行分析鉴别。
【权利要求】
1. 拟茎点霉RNA聚合酶（RPB1)基因扩增引物，其特征是将测序序列和扩增序列结合在 一起，是一对针对拟茎点霉属真菌的通用引物，其上游引物PhRl-F有43个碱基：CGCCAGGG ITTTCCCAGTCACGACTGCAGCAAGGTGTTGGCTG ;下游引物 PhRl-R 有 43 个碱基：AGCGGATAACAATT TCACACAGGAGCGATGTCGTTGTCCATGTA。
2. 权利要求1所述扩增引物的设计方法，其特征包括如下步骤： 找出已测定全序列的60种拟茎点霉RPB1基因，去掉不完全和部分序列，进行同源性比 较，寻找保守序列，选取扩增序列，并在5'端加入测序序列，从而获得一对通用引物。
3. 权利要求1中所述拟茎点霉RNA聚合酶（RPB1)基因扩增引物在种类鉴定、地理种群 鉴别或口岸检验检疫中的应用。
【文档编号】C12R1/645GK104195262SQ201410491821
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】胡佳续, 郭京泽, 刘鹏, 王金成, 罗加凤, 廖芳, 黄国明 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心