一种具有5-氟尿嘧啶耐药性的人胃癌细胞系及其建立方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有5-氟尿嘧啶耐药性的人胃癌细胞系及其建立方法和应用。所述人胃癌细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：2013154。该人胃癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，成瘤率高，潜伏期短，均一性好，为胃癌研究提供新的更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料。该人胃癌细胞系具有成瘤性，而且产生的肿瘤具有顺铂耐药性，可用来分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而建立体外、体内两个相关联的药物筛选平台，是人胃癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。CCTCC NO：C201315420131120
【专利说明】一种具有5-氟尿嘧啶耐药性的人胃癌细胞系及其建立方 法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种具有5-氟尿嘧啶耐药性的人胃癌细胞 系及其建立方法和应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的主要疾病，其中，胃癌是全球发病率最高的 癌症之一，也是世界上第2位癌症死亡原因，仅次于肺癌。据2011年的Global Cancer Statistics报告，目前全球超过70%的胃癌新发病例和死亡都发生在发展中国家，其中东 亚高居榜首，发病率分别达到男性42. 4%和女性18. 3%。而根据中国抗癌协会临床肿瘤 协作中心（CSCO)列举的数据，目前全球每年新发胃癌有九十三万四千例，其中有近四十万 在中国内地，中国的胃癌发病已占全世界的42%。我国每年死于胃癌约30万人，死亡率为 25. 2/10万（男性：32. 8/10万，女性：17. 0/10万），占全部恶性肿瘤死亡的23. 2%。而在 上海，男性胃癌的发病率为47. 1/10万?63. 2/10万，女性为20. 1/10万?24. 8/10万，分 别占恶性肿瘤发病率的第1位和第2位。其中，胃腺癌的发生率占胃恶性肿瘤的95%。
[0003] 近年来，胃癌的治疗模式已从单一的手术治疗进入综合治疗加规范化手术的新治 疗模式，其中辅助化疗作为综合治疗的方法之一，已得到越来越多的关注。目前胃癌临床化 疗主要存在如下问题：首先，常用的化疗方案缺乏客观指标反应药物的抗癌敏感性；其次， 耐药现象的发生仍然是胃癌化疗中存在的最大问题。鉴于此，建立不同病理类型的胃癌细 胞系，尤其是具有耐药特性的细胞系，对于有效指导临床前研究和临床不同分型的治疗相 关性，具有必不可少的重要作用。同时由于运用临床肿瘤组织直接建立细胞系的成功率较 低，因此，通过运用临床肿瘤标本先建立动物模型，进而通过原代培养建立人源肿瘤细胞更 具有可行性，同时也接近于肿瘤的临床生物学特性，对药物的耐药性及敏感性具有良好的 预测性。
[0004] 胃癌细胞系在新药开发临床前应用的一个重要方面就是建立小鼠异种移植瘤模 型，用于预测抗癌药物的临床疗效。然而，目前建立的大多数胃癌细胞系受限于成瘤率低或 均一性差等问题，难以应用于大规模药物筛选。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题就是针对现有的人胃癌细胞系生物多样性低，与临床胃 癌的生物学性状相差较大等不足，提供一种新的具有5-氟尿嘧啶耐药性的人胃癌细胞系 及其建立方法和应用。
[0006] 因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种人胃癌细胞系，其 保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO :2013154。
[0007] 本发明所述人胃癌细胞系较佳地还包括如上所述的人胃癌细胞系的子代细胞。
[0008] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：如上所述的人胃癌细胞系在 制备使免疫缺陷小鼠产生胃癌的试剂中的用途。
[0009] 本发明所述的使免疫缺陷小鼠产生胃癌的试剂为本领域常规的试剂，该试剂的制 备方法较佳地为将本发明所述人胃癌细胞系混悬于各种溶剂中即得。其中所述溶剂为本 领域常规溶剂，较佳地为HBSS缓冲液，所述HBSS缓冲液的配方为：含500U/ml青霉素 G、 500 μ g/ml硫酸链霉素和1. 25 μ g/ml两性霉素 B。
[0010] 本发明所述试剂较佳地用于制备胃癌动物模型。其中所述胃癌动物模型的制备方 法为本领域常规方法，较佳地包括以下步骤：将所述使免疫缺陷小鼠产生胃癌的试剂接种 于免疫缺陷小鼠进行饲养，获得胃癌动物模型。其中所述免疫缺陷小鼠较佳地为裸小鼠或 严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），优选地为严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），其中 所述裸小鼠较佳地为NU/NU品系的裸小鼠。利用本发明所述细胞系制备的胃癌动物模型具 有5-氟尿嘧啶耐药性。
[0011] 其中所述的接种的方式为本领域常规使用的接种方式。所述接种方式较佳地包括 皮下穿刺接种，原位接种或者肾囊膜内接种，优选地为皮下穿刺接种。所述接种的细胞量较 佳地为I. 0?2X IO7个细胞，优选地为5. OX IO6个细胞。
[0012] 本发明所述胃癌动物模型的应用方法较佳地为，利用所得胃癌动物模型检测待测 化合物的抑制胃癌活性，将待测化合物施用于胃癌动物模型，观察和测量动物的体重与肿 瘤生长情况；施用后导致胃癌动物模型胃癌症状改善或治愈的待测化合物具有抑制胃癌活 性。
[0013] 其中所述的待测化合物施用的方法为本领域常规的施用方法，较佳地包括：尾静 脉注射、腹腔注射、灌胃、口服和肿瘤局部用药中的一种或几种方式施用于胃癌的荷瘤动 物。所述实验中的对照例较佳地为：同时使用不含待测化合物的溶剂施用于胃癌的荷瘤动 物作为对照实验组。
[0014] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种待测化合物抑制胃癌细 胞活性的体外检测方法，该体外检测方法包括以下步骤：将待测化合物施用于细胞模型中， 施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的待测化合物为具有抑制胃癌细胞活性的化合物，其 中所述的细胞模型是如上所述的人胃癌细胞系。
[0015] 本发明所述体外检测方法为本领域常规使用的方法，该体外检测方法较佳地包括 以下步骤：
[0016] (1)将本发明所述人胃癌细胞系或其子代细胞接种于96孔细胞培养板孔中，培养 24小时；
[0017] (2)将待测化合物稀释成不同浓度施用于细胞，化合物作用72小时后通过测定细 胞的活力，计算不同浓度的化合物对细胞的增殖抑制能力，计算化合物半数抑制浓度，用以 判断待测化合物的抗胃癌细胞的能力。
[0018] 其中步骤（1)所述人胃癌细胞系或其子代细胞的接种量较佳地为5000/孔。其中 步骤（2)所述半数抑制浓度检测方法较佳地包括ATP生物发光法或MTT法，本发明所述检 测方法优选地为ATP生物发光法。所述的ATP生物发光法是通过对细胞中的ATP进行定量 测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法，其中所述的ATP是活细胞新陈代谢 的一个重要指标，所述ATP生物发光法可以利用市售检测试剂盒进行。
[0019] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是：一种如上所述人胃癌细胞系 的建立方法，该建立方法包括以下步骤：
[0020] (1)获得新鲜的临床人胃癌手术切除标本，剪切成小块，皮下穿刺接种免疫缺陷小 鼠；
[0021] (2)穿刺接种70?90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培 养和传代培养。
[0022] 其中步骤（1)所述的新鲜的临床人胃癌手术切除标本剪切而成的小块的质量较 佳地为20?50mg。其中所述的免疫缺陷小鼠较佳地为严重联合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠） 或裸小鼠。其中所述的新鲜的临床人胃癌切除标本更佳的处理方式为：用新鲜的HBSS缓冲 液（所述HBSS缓冲液较佳地包含500U/ml青霉素 G、500 μ g/ml硫酸链霉素和1. 25 μ g/ml 两性霉素 B)漂洗。
[0023] 其中步骤（2)所述的原代培养方法是常规的哺乳动物细胞的原代培养方法；所述 的原代培养方法较佳地包括以下步骤：
[0024] 将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37°C孵箱5% CO2条件下培养；次日，将 培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入RPMI-1640培养液（含5%胎牛血清，lOOU/ml青霉素 G、 100 μ g/ml硫酸链霉素和0. 25 μ g/ml两性霉素 B)，静置培养。
[0025] 其中所述的传代培养方法是常规哺乳动物细胞的传代培养方法；所述的传代培养 方法较佳地包括以下步骤：待原代培养的细胞铺展到70%满时进行传代培养和纯化，吸弃 旧培养液，向瓶中加入新鲜的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，终止消化，加入新鲜的 RPMI-1640培养液，吹打使之脱离瓶壁形成细胞悬液；离心接种于新的培养瓶继续培养。
[0026] 所述传代培养方法中较佳地还包括细胞纯化的步骤，所述细胞纯化的方法较佳地 包括以下步骤：利用肿瘤细胞和成纤维细胞贴壁速率的不同，在传代接种于新的培养瓶20 分钟后吸取上清转移到新的培养瓶，多次差速贴壁去除成纤维细胞。
[0027] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0028] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0029] 本发明的积极进步效果在于：
[0030] 1、本发明建立的人胃癌细胞系性状稳定，可稳定多次传代，为胃癌研究提供新的 更接近于临床肿瘤生物学特性的实验材料；
[0031] 2、本发明建立的人胃癌细胞系在保留主要临床生物学特征的前提下，具有成瘤率 高，潜伏期短，均一性好等特点，可以成功制备胃癌动物模型，所制得的动物模型可以用于 基础研究及药物筛选，为基于中国人群遗传背景开展的研究提供了有力的科研资料，也为 新药临床前研究体内实验针对临床抗癌药物敏感性及耐药性的测试提供新的试验材料。
[0032] 3、本发明建立的人胃癌细胞系通过与裸小鼠体内传代亲本肿瘤相比较，可用来分 析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性，进而可以建立体外、体内两个相关联的药物筛 选平台，是人胃癌基础研究和临床前期应用的理想细胞系。
[0033] 4、本发明建立的人胃癌细胞系所成的裸鼠肿瘤还具有对胃癌临床一线药物5-氟 尿嘧啶的耐药性，是研究胃癌耐药机制的良好试验材料，具有很高的科研价值和开发意义。
[0034] 5、本发明建立的细胞系具高成瘤率，高均一性，又保持有临床胃癌分子背景，同时 来源于中国人群，符合中国人的遗传特征，对研发适合国人的抗胃癌新药具有十分重要的 理论和临床意义。
[0035] 牛物材料保藏信息
[0036] 本发明的人胃癌细胞系，于2013年11月20日保藏在中国典型培养物保藏中 心（CCTCC)，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学邮编：430072,培养物名称为人胃癌细胞 GAXC066,保藏编号为 CCTCC NO :C2013154。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1为GAXC066细胞的形态学观察（放大一百倍视野）。
[0038] 图2为GAXC066细胞的染色体分析。其中图2 (A)为GAXC066细胞；图2 (B)为小 鼠细胞染色体。
[0039] 图3为GAXC066细胞免疫组化染色结果（DAB法）。其中图3 (A)为阴性对照； 图3(B)为癌胚抗原（CEA);图3(C)为细胞角蛋白（Cytokeratin);图3(D)为波形蛋 白（Vimentin);图3(E)为糖类抗原19-9(CA19-9);图3(F)为人类表皮生长因子受体 2(HER-2)。
[0040] 图4为GAXC066细胞倍增时间曲线。
[0041] 图5为GAXC066细胞周期分析结果。
[0042] 图6为体外测试多个抗癌药物对GAXC066细胞增殖的抑制作用结果。其中图6 (A) 为顺钼对GAXC066的生长抑制作用；图6(B)为伊立替康对GAXC066的生长抑制作用；图 6(C)为5-氟尿嘧啶对GAXC066的生长抑制作用；图6(D)为紫杉醇对GAXC066的生长抑制 作用 ；图6出）为表柔比星对6八乂0)66的生长抑制作用；图6$)为多西紫杉醇对64乂0)66的 生长抑制作用。
[0043] 图7为GAXC066细胞的成瘤性结果。
[0044] 图8为GAX⑶66细胞在裸小鼠体内成瘤的病理组织切片（放大10倍视野）。其中 图8(A)为正常肺组织；图8(B)为对应标本移植瘤块；图8(C)为GAXC066细胞接种瘤块。
[0045] 图9为体内测试顺钼和5-氟尿嘧啶对GAXC066细胞裸小鼠模型的肿瘤生长抑制 作用结果图。
【具体实施方式】
[0046] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0047] 顺钼购自江苏豪森药业，5-氟尿嘧啶购自天津金耀氨基酸有限公司，生理盐水购 自浙江天瑞药业有限公司，细胞培养试剂均购买自美国Invitrogen公司。
[0048] 实施例1GAXC066细胞的制备
[0049] 从南通肿瘤医院获得新鲜的临床胃癌切除标本（患者性别：男，年龄：72岁，民族： 汉，籍贯：江苏省南通市。），临床诊断结果为低分化胃腺癌。
[0050] 用新鲜的HBSS缓冲液（含500U/ml青霉素 G、500 μ g/ml硫酸链霉素和1. 25 μ g/ml 两性霉素 B)漂洗后，切成20?50mg的小块，皮下穿刺接种于免疫缺陷动物SCID鼠 （SCID 鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司）。穿刺接种70?90天后，将荷瘤动物处 死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和传代培养。
[0051] 原代培养步骤为：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37°C孵箱5% CO2条 件下培养；次日，将培养瓶慢慢翻转平放，向瓶内加入RPMI-1640培养液（含5%胎牛血清， 100U/ml青霉素 G、100 μ g/ml硫酸链霉素和0. 25 μ g/ml两性霉素 B)，静置培养；待细胞铺 展到70%满时先进行传代，再纯化，之后放入37%恒温培养箱中培养。传代的方法是吸弃 旧培养液，向瓶中加入新鲜的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后，终止消化，加入新鲜的 RPMI-1640培养液，吹打使之脱离瓶壁形成细胞悬液；离心接种于新的培养瓶继续培养。
[0052] 纯化的方法是将所得细胞悬液接种于新的培养瓶，20分钟后，吸取上清转移到新 的培养瓶，由于成纤维贴壁速率较快，在新的培养基中培养20分钟后，细胞悬液中的成纤 维细胞大部分贴壁生长，所以细胞悬液中的肿瘤细胞得到了纯化，将上述步骤重复多次，即 达到了纯化肿瘤细胞的目的。
[0053] 本发明将来源于肿瘤组织的原代培养及传代培养细胞系命名为人胃癌细胞 GAXC066,于2013年11月20日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :C2013154。提交保藏的细胞系是传代30代后的细胞系。
[0054] 实施例2GAXC066细胞的生物学特性及应用
[0055] 本发明采用RPMI1640培养并用差速贴壁法纯化GAXC066细胞，使其能体外长期 生长和稳定传代。当细胞传至20代以上，细胞性状逐渐稳定，进行相关的生物学、遗传学 和组织来源鉴定，直至第50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的 GAXC066主体细胞呈大柳叶形，无接触抑制特性。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体 数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该细胞能在裸小鼠体内可形成肿瘤，具 有致瘤性。该细胞和其来源的临床肿瘤标本、裸小鼠体内传代亲本肿瘤形成对应关系，可为 研究体外、体内和临床抗癌药物敏感性及耐药性的相关性提供新的试验材料。具体如下：
[0056] a.形态学观察
[0057] 将培养GAXC066细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行观察，结果见 图1(图1为GAXC066细胞的形态学观察100X所示），可见GAXC066主体细胞呈大柳叶形， 无接触抑制特性。
[0058] b.染色体的鉴定
[0059] 在培养的GAXC066细胞中加入秋水仙素，使其终浓度为0. 25 μ g/ml，再于37°C孵 箱中继续培养4小时。采集分裂中期的细胞，用固定液进行固定，然后将细胞悬液滴于预冷 的载物片上，用Giemsa染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图2,其中图2 (A)为 GAXC066细胞；图2(B)为小鼠细胞染色体。结果可见，GAXC066细胞连续传代后，染色体仍 保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，染色体众数为51±2,占80. 89%，表现为超二倍体，存 在多数中央及亚中央着丝粒染色体（图2(A)，1000X);而裸小鼠的染色体数2n = 40,且均 为顶端着丝粒（图2(B)，1000X)，据此可与人类染色体相区别。可见该细胞为异倍体（超 二倍体），染色体数目和结构畸变，符合恶性肿瘤的遗传学特征。
[0060] C.短片段重复序列（STR)鉴定
[0061] 短串联重复序列（short tandem repeat, STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上， 由数个碱基对作为核心单位（2-6个碱基对），串联重复形成的一类DNA序列（重复次数为 10?60多次，基因片段在400碱基对以下）；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从 而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯 一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。
[0062] 收集新鲜培养的GAXC066细胞，用AxyPr印基因组DNA小量试剂盒（购自Axygen 公司的 AxyPrep? Multisource Genomic DNA Miniprep Kit，货号为 AP-MN-MS-GDNA)提取 细胞基因组DNA，用5'端荧光标记的引物进行PCR扩增，对所得产物进行测序，计算各个短 片段重复序列的重复数。
[0063] 提取细胞的基因组DNA，对STR位点进行特异性扩增，通过测序分析包括 Amelogenin，TH01，TPOX，D13S317, vWA，D16S539, D5S818, CSFlPO 以及 D7S820 等各个 STR 位点的序列重复数，并和ATCC，DSMZ等细胞保存库的数据库进行查询对比，未返回相同的 遗传图谱，可证明其独一无二性，且在原代培养过程中未发生和其他细胞的交叉污染，STR 位点的引物序列如序列表中SEQ ID NO: I-SEQ ID NO. 18所示，具体请参见表1和表2 :
[0064] 表I STR位点的引物序列
【权利要求】
1. 一种人胃癌细胞系，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO :2013154。
2. 如权利要求1所述人胃癌细胞系的子代细胞。
3. 如权利要求1所述的人胃癌细胞系在制备使免疫缺陷小鼠产生胃癌的试剂中的用 途。
4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的使免疫缺陷小鼠为SCID小鼠或裸小 鼠。
5. -种待测化合物抑制胃癌细胞活性的体外检测方法，其特征在于，该体外检测方法 包括以下步骤：将待测化合物施用于细胞模型中，施用后抑制细胞增殖或导致细胞凋亡的 待测化合物为具有抑制胃癌活性的化合物，其中所述的细胞模型是权利要求1所述的人胃 癌细胞系。
6. -种如权利要求1所述人胃癌细胞系的建立方法，其特征在于，该建立方法包括以 下步骤： (1) 获得新鲜的临床人胃癌手术切除标本，剪切成小块，皮下穿刺接种免疫缺陷小鼠； (2) 穿刺接种70?90天后，将荷瘤动物处死，取出肿瘤组织，进行癌细胞的原代培养和 传代培养。
7. 如权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤（1)所述的小块的质量为20? 50mg〇
8. 如权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤（1)所述的免疫缺陷小鼠为SCID 小鼠或裸小鼠。
9. 如权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤（1)所述的新鲜的临床人胃癌切除 标本用HBSS缓冲液漂洗后，再进行皮下穿刺接种，所述的HBSS缓冲液包含500U/ml的青霉 素G，500 ii g/ml的硫酸链霉素和1. 25 ii g/ml的两性霉素B。
10. 如权利要求6所述的建立方法，其特征在于，步骤（2)所述的细胞的原代培养包括 以下步骤：将肿瘤组织剪切成小块，置入培养瓶中，于37°C孵箱5% C02条件下培养；次日 向瓶内加入RPMI-1640培养液，所述RPMI-1640培养液含5%胎牛血清，100U/ml青霉素G， 100 y g/ml硫酸链霉素和0. 25 y g/ml两性霉素B，静置培养；步骤（2)所述的细胞的传代培 养包括以下步骤：吸弃旧培养液，向瓶中加入新鲜的〇. 05%胰蛋白酶溶液，待细胞脱落后， 加入新鲜的DMEM/F12培养液，仔细吹打，使之脱离瓶壁形成细胞悬液；收集全部细胞，离 心，分别接种于新的培养瓶继续培养，所述百分比为质量百分比。
【文档编号】C12R1/91GK104403996SQ201410499357
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月25日 优先权日:2014年9月25日
【发明者】强福林, 胡刚, 汤旭蓁, 张一心, 方后顺, 汪宗宇, 秦宵然 申请人:上海睿智化学研究有限公司, 南通市肿瘤医院