茄子抗根结线虫相关基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了茄子抗根结线虫相关基因及其应用，其具有Seq.ID.No.1所示的核苷酸序列。本发明根据Mi基因序列设计两个特异引物，采用RACE方法获得茄子Mi同源基因的全长序列，利用RT-PCR技术验证其功能，为茄子抗根结线虫分子育种奠定初步基础。
【专利说明】茄子抗根结线虫相关基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和农业领域，具体的涉及一种茄子抗根结线虫相关基因及 其应用。
【背景技术】
[0002] 现在已经克隆的抗线虫基因主要集中于番茄、辣椒、甜菜、马铃薯和小麦，其中以 番茄Mi基因研究的最为详细。抗线虫基因编码的蛋白大多含有保守的结构域，如C-端存在 富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat, LRR)，N-端存在核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉链（leucine zipper，LZ)，跨膜结构域（transmembrane domain，TM)等。第一个克隆到的抗线虫基因是Hsl pi^1,它来自甜菜，只有抗甜菜胞囊线虫 的作用，其编码的蛋白有一个LRR结构域和一个TM结构域，但是其LRR结构域很小，序列与 其它R基因编码的蛋白的LRR有明显差异。番茄Mi是利用图位克隆从秘鲁番茄So I anum peruvianum中分离到的，属于LZ-NBS-LRR家族。马铃薯抗线虫基因 Gpa2、番爺的抗根腐线 虫基因 Hero A和小麦抗胞囊线虫基因 Cre3等都属于NBS-LRR家族，只是在N端的连接序 列不同。在不同植物上克隆出来的抗根结线虫基因大多属于NBS-LRR家族（除了 Hslpi^1), 对Gpa2、HeroA、Mi、Cre3进行序列分析发现，大多具有NBS-LRR保守序列，因此可以通过同 源序列克隆抗根结线虫基因。陈儒钢等利用同源序列克隆的方法，分别从抗根结线虫的番 茄和辣椒材料中克隆到抗根结线虫基因 SlMi及CaMi，并利用农杆菌介导的遗传转化方法 把辣椒的CaMi转入根结线虫敏感的番茄中，获得了抗根结线虫的番茄转基因株系并应用 于育种中。张丽英等利用同源序列克隆的方法将克隆得到的SlMi基因通过农杆菌介导法 转入到缺乏抗性的莴苣中，为莴苣抗根结线虫育种、为异源基因在莴苣中的成功应用奠定 了基础。
[0003] 近年来，人们除了对番茄、辣椒直接抗根结线虫基因克隆外，还对其相关的WRKY 基因进行克隆。WRKY转录因子是一类转录调控因子，它参与抗病反应，同时影响植物的衰 老、抗胁迫能力以及生长和发育。在辣椒上已成功克隆6个WRKY基因。李淑敏等从辣椒中分 离到 6 个 WRKY 基因 WRKY-a、WRKY-b、WRKY-c、WRKYl、CaWRKYl 和 CaWRKY2,这 6 个 WRKY 基因 在接种根结线虫36h后的辣椒根尖、茎、叶片中都表达，而CaWRKYl基因在根结线虫接种36h 后的辣椒根尖、叶片中表达，在茎中不表达，这表明辣椒WRKY-b、WRKY-c、CaWRKYl和WRKYl 这4个基因在辣椒中表现为组成型表达，而WRKY-a、CaWRKY2基因是诱导型表达，CaWRKYl 基因的表达具有组织特异性。郑井元等克隆出一个辣椒在早期应答南方根结线虫侵染时的 抗性相关转录因子CaRKNIF2。实时荧光定量PCR分析表明该基因在线虫侵染3h后表达量 即明显上升，到12h时，表达量达到最大，表明CaRKNIF2参与了辣椒与南方根结线虫的不亲 和互作。在不同组织进行的实时荧光定量PCR分析显示，该基因在根尖组织中的表达量最 高，具有组织特异性，表明其在参与根尖组织的应急反应中具有重要功能。
[0004] 茄子在我国深受大众喜爱，经济效益较高，但同时也易受根结线虫的危害。根结线 虫是一类寄生在植物根系，破坏植物正常生理代谢，造成植株死亡的病害。它们可以侵染很 多种经济作物，给农业生产带来了严重危害。其中，南方根结线虫为优势种，能给许多园艺 作物特别是蔬菜和果树带来毁灭性灾难。目前，控制根结线虫主要是通过轮作、土壤熏蒸1 和化学药物防治。但是，这些方法还不能完全控制根结线虫病的发生。例如土壤熏蒸，熏蒸 剂严重破坏环境，并且很多熏蒸剂被限制使用。化学药剂防治根结线虫是不可取的，因为它 不会成为一个高效和持久的控制方法。因此，克隆和验证抗性基因是实现转基因育种的一 条高效途径。野生茄子种质资源丰富，具有许多优良性状，其中托鲁巴姆对根结线虫具有较 高的抗性。因此，利用分子生物技术从托鲁巴姆中克隆抗根结线虫基因，对于了解茄子根结 线虫病害的发生机制、抗病分子机理和抗病性育种有着非常重要的意义。
[0005] 从不同物种里克隆出70多个R基因，其中大多数抗性基因的克隆都是根据 NBS-LRR保守区域设计引物，采用PCR技术从植物DNA或cDNA中扩增得到同源片段，如咖 啡、棉花、野生稻等。NBS即核苷酸结合位点，存在于真核生物的许多蛋白中，主要功能是负 责ATP的水解和释放信号。NBS包含三个区域，kinase-la区、kinase_2a区、kinase_3a区。 LRR即富亮氨酸重复序列，是长度在24个氨基酸之内的多重重复，主要功能是决定寄主与 病原的特异性识别。在园艺作物中已经克隆的抗线虫基因主要有甜菜抗胞囊线虫Hsl pra' 马铃薯抗白线虫Gpa2、番茄的抗根腐线虫Hero、辣椒抗根结线虫CaMi、番茄抗根结线虫Mi， 其中以Mi研究最为详细。番茄的Mi基因，它编码一个富亮氨酸重复序列并且对根结线虫、 蚜虫、粉虱具有较高的抗性。Mi基因可以被转基因表达，转入到感病番茄和亲缘关系近的物 种中对根结线虫具有明显抗性。但是，当烟草和拟南芥被侵染根结线虫后，Mi-L 2基因不 表现抗性。目前，利用NBS-LRR保守区域设计引物，克隆得到的同源基因片段可以与分子标 记相结合，借助遗传图谱将同源基因片段定位在染色体上，找到抗病基因。Qi等通过此方法 将向日葵抗锈蚀病R4基因定位于向日葵的13号连锁群上。前人对茄子抗根结线虫基因的 研究较少，茄子抗根结线虫的基因尚未被克隆。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种茄子抗根结线虫相关基因，其具有Seq. ID. No. 1所示 的核苷酸序列。
[0007] 本发明另一个目的是提供一种茄子抗根结线虫相关基因在茄子选育和抗根结线 虫选育中的应用。
[0008] 本发明根据已知抗线虫基因 NBS-LRR保守结构域设计引物，以野生茄托姆巴鲁 cDNA为模板克隆抗性基因同源片段，并分析这些序列的相关性，利用RT-PCR技术验证其功 能，确定抗根结线虫基因片段；根据Mi基因序列设计两个特异引物，采用RACE方法获得茄 子Mi同源基因的全长序列，利用RT-PCR技术验证其功能，为茄子抗根结线虫分子育种奠定 初步基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1 :茄子根系RNA完整性的琼脂糖凝胶电泳检测结果（1 :根系RNA);
[0010] 图 2 :5' 端和 3' 端 RACE PCR 扩增电泳结果（1 :5' 端 RACE ;2 :3' 端 RACE);
[0011] 图3 :重组质粒PCR检测结果（1 :重组质粒的5'端PCR产物）；
[0012] 图4 :重组质粒PCR检测结果（1 :重组质粒的3'端PCR产物）；
[0013] 图5 :根结线虫侵染前后茄子Mi同源基因在根、茎、叶中相对表达量。
【具体实施方式】
[0014] 若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0015] 实施例1 :
[0016] I. 1 材料
[0017] 1.1.1植物材料
[0018] 实验材料为野生茄托鲁巴姆。
[0019] I. 1. 2南方根结线虫悬浮液
[0020] (1)取被侵染的茄子根系，洗去根表土，切成2_4mm长根放入IOOOml烧瓶中。
[0021] (2)加入200ml 0· 5% NaClO溶液于烧瓶，加盖，搅动3-5min。
[0022] (3)立即把碎片同溶液倒入200目和500目网筛组，用自来水充分洗下200目网筛 上的卵。用自来水缓慢洗500目网筛内的卵5分钟，并集中于一处。
[0023] (4)500目网筛内的线虫收集于250ml烧杯内，定容至100ml。
[0024] (5)用吸管取0. 5ml悬浮液移入盛有4. 5ml自来水的小烧杯内，充分摇匀。
[0025] (6)立即取0. 5ml稀释的悬浮液于计数皿上，用少许自来水滴入主数皿内，使幼虫 随机落在计数皿底。
[0026] (7)在立体解剖镜下计1/4计数皿底上的虫数。
[0027] (8)从（4)步开始重复一次，两次记录虫数平均数乘以80,便得到原悬浮液每毫升 所含幼虫数目。
[0028] I. L 3 试剂盒
[0029] RNA 提取试剂盒、PrimeScript? RT reagent Kit、pMD18_T Vector 克隆试剂盒、 凝胶回收试剂盒、TakaRa SYBRl8 PreMix Ex Taq?。
[0030] 1.1.4常用储液
[0031] X-Gal、IPTG、Amp、LB 液体培养基、Tris 缓冲液。
[0032] 1. 2 方法
[0033] I. 2. 1材料的准备
[0034] (1)将托鲁巴姆种子播种于装有经热力消毒的砂壤土和粗砂土（1:1混合）的陶盆 内，播完种子的陶盆置于20-25°C温室工作台上，培养42天，2-4真叶期进行接种。将南方 根结线虫悬浮液（1000个/L)贴近植株倒入5ml于每盆中。
[0035] (2)分别取未接种前植株的叶片、茎段、根系和接种后6h、12h、24h植株的叶片、茎 段、根系，经过液氮冷冻，-80°C保存。
[0036] 1. 2. 2总RNA提取与cDNA的合成
[0037] 以托鲁巴姆的嫩叶为材料，提取托鲁巴姆总RNA，总RNA的提取参照RNA提取试剂 盒说明书上的操作步骤，cDNA的合成参照PrimeScript? RT reagent Kit说明书上的操作 步骤，分装后直接用于PCR或置于-20°C冰箱保存。
[0038] (1)用液氮研磨适量的茄子叶片，并将磨好的样品移至2ml离心管中，装至2/3就 可以。离心管一定提前用液氮预冷，操作要快，避免样品反复冻融；
[0039] (2)吸取Iml TakaRa RNAiso Reagent试剂加入样品中，枪头不能碰到离心管和样 品，盖上离心管盖，并摇晃使混匀，静置5Min ;
[0040] (3) 12000r/Min4°C离心5Min，吸取上清液转移至另一新的I. 5ml离心管中；
[0041] (4)加入上清液体积1/5的氯仿，充分摇晃混匀呈浮浊色，静置5Min，12000r/ Min4°C 离心 5Min ;
[0042] (5)吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中，切忌吸出白色中间层，加入 500ul氯仿混匀摇晃，静置5Min ;
[0043] (6) 12000r/Min4°C离心5Min，吸取上清液转移至另一新的I. 5ml离心管中；
[0044] (7)加入与上清等体积的异丙醇，室温静置lOMin，12000r/Min4°C离心lOMin，试 管底部出现沉淀；
[0045] (8)小心弃去上清，尽量将上清去除干净，可将离心管盖子打开倒置于干净的纸 上，缓慢沿离心管壁加入lml75%乙醇，轻轻上下颠倒几下，洗涤沉淀；
[0046] (9) 12000r/Min4°C离心5Min，小心弃去乙醇上清液，也需倒置，室温干燥沉淀 2-5Min，加入适量DEPC水，溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待沉淀完全溶解后 于-80°C保存。
[0047] 利用核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，并保证A260/A280和A260/A230的值不小于 1.8。使用 TakaRa PrimeScript RT Reagent Kit 试剂盒进行反转录。
[0048] 按下列组分配制RT反应液（反应液配制在冰上进行）：
[0049]
【权利要求】
1. 一种茄子抗根结线虫相关基因，其具有Seq. ID. No. 1所示的核苷酸序列。
2. -种载体，其特征在于含有上述基因。
3. 一种爺子抗根结线虫相关基因在爺子选育和抗根结线虫爺子选育中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104313035SQ201410554602
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】杨旭, 成玉富, 张宇, 翁伟 申请人:扬州大学