整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片、以及用所述微流控芯片进行基因突变检测的方法。所述微流控芯片包括细胞裂解室和细胞液滤过单元，所述细胞液滤过单元的下游连通至基因扩增及检测池；所述上游和下游之间设有过滤器。本发明无需对全血中的核酸进行提取，将全血稀释后直接加入到芯片中，通过加热裂解法在芯片上提取DNA，进行扩增，反应液中加入荧光染料钙黄绿素作为指示剂，不需任何仪器，在1小时内即可实现对结果的可视化检测。
【专利说明】整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微 流控芯片及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基因突变检测方法和检测芯片，尤其涉及一种整合全血核酸提 取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片、以及用所述微流控芯片进行基因突变 检测的方法。
【背景技术】
[0002] 骨髓增殖性肿瘤（MPN)，主要包括慢性粒细胞白血病（CML)、真性红细胞增多症 (PV)原发性血小板增多症（ET)与原发性骨髓纤维化（PMF)等。2008年WHO血液系统肿瘤 的诊断标准中，将是否存在JAK2 V617F基因突变列入PV、ET、PMF的诊断标准。现有的突变 检测方法多为基于限制性长度多态性（RFLP)、扩增特异性突变检测系统（ARMS)、直接测序 及高分辨率烙解分析（high resolution melting, HRM)等技术。
[0003] 其中，RFLP基于凝胶介质，其检测操作的人力与时间成本较高、且由于存在酶切不 完全，易于污染等问题，并不适合实验室高通量筛查的需求。ARMS虽然可用于检测简单形式 的突变，且可通过荧光定量完成单次闭管检测，但由于反应体系过于复杂，无法对多种突变 进行同时筛查。直接测序虽可直接获得核酸的详细序列信息，但目前技术成本仍然较高、检 测灵敏度较低（20% )，且由于双脱氧核苷酸终止技术具有极大的致畸毒性，并不适合小规 模实验室开展检测。HRM是新型的基因分型技术，利用异源双链间的错配所导致的熔解温度 变异，可快速可靠的完成简单突变的筛查，但该方法对样本前处理要求高，DNA模板中的残 余蛋白及RNA、缓冲液的离子强度等因素均可导致熔解曲线漂移进而影响结果判读。
[0004] 目前常用的HRM分析方法如传统产物熔解分析、小片段内参法或非标记探针法的 检测灵敏度可达为5%。但JAK2 V617F突变为体细胞获得性突变，如何提高检测灵敏度对 于提高MPN患者的早期诊断并提示临床开展区别于反应性增生的早期治疗干预具有重要 的现实意义。由于这些方法均需特殊仪器，操作繁琐，因此建立简单、高灵敏度的用于MPN 患者的早期分子诊断已为目前亟需解决的问题。
[0005] 环介导等温扩增（LAMP)是2000年日本学者发明的一种在一个温度下进行得的 基因扩增技术，此技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测。此技术具有特 异性强、灵敏度高、响应速度快、结果判定简单、应用范围广、操作方便、价格低廉等特点。 Minnucci 等（Minnucci G, et al. A novel, highly sensitive and rapid allele-specific loop-mediated amplification assay for the detection of the JAK2V617F mutation in chronic myeloproliferative neoplasms, Hematopoiesis, 2012, 97(9):1394-1400)利 用LAMP技术针对JAK2 V617F突变型DNA进行了检测，但是不能检测出野生型及杂合型的 临床样本，且不能实现核酸提取、扩增及检测一体化。
[0006] 微流控技术是在微米尺度结构中操控纳升至皮升级体积流体的技术与科学，可 以将分析装备微型化、集成化和高通量化，直至将一个生物或化学实验室微缩到一块几平 方厘米的芯片上-即所谓"芯片实验室"。由于其具有分析速度快、可集成化、便于携带 等优点，目前已广泛用于氨基酸、蛋白质、细胞等的检测和分析。该技术的小尺度结构增 强了流体的层流效应、表面张力效应和热传导效应，使许多物理和化学过程发生了质的变 化，为生物分子诊断提供了广阔的应用前景。微流控芯片（Microchip)与LAMP核酸分析 技术结合可实现多重，原位，定量，高通量和高集成地分析核酸分子，对于发展强大的生物 分子床边快速诊断具有重大意义。Fang等利用LAMP-Microchip实现了甲型流感病毒的 检测（Fang XE, et al. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip, Anal. Chem, 2011，83:690-695)，但其检测 样本为已提取的DNA、而非全血样品，也不能实现微流控芯片上核酸提取、扩增及检测的一 体化。
[0007] 而目前针对全血的基因突变检测，都需从全血中提取DNA或RNA，且需要相应的检 测系统，如PCR分析仪或凝胶电泳仪等，尚无用于整合全血核酸提取、扩增及基因检测的一 体化微流控芯片。
【发明内容】
[0008] 为了克服现有技术仅能采用已提取DNA检测、不能实现微流控芯片上核酸提取、 扩增及检测的一体化的缺陷，本发明提供了一种整合全血核酸提取、扩增及可视化检测肿 瘤基因突变的微流控芯片，以及利用所述微流控芯片进行基因突变的检测方法，尤其是 JAK2 V617F基因突变的检测方法。
[0009] 本发明第一个方面是提供一种整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突 变的微流控芯片。
[0010] 本发明第一个方面所述的微流控芯片包括细胞裂解室和细胞液滤过单元；其中， 所述细胞裂解室设有样品加入口和液体流出口；其中，所述细胞液滤过单元的上游连通所 述细胞裂解室的液体流出口，所述细胞液滤过单元的下游连通至基因扩增及检测池；所述 上游和下游之间设有过滤器，所述过滤器的滤孔孔径优选为25-35 μ m、例如30 μ m。 toon] 在本发明第一个方面的一种优选实施例中，所述细胞液滤过单元与基因扩增及检 测池之间设有可闭合的通道。所述可闭合的通道可以是带有夹子的弹性管、阀门中的任意 一种或几种，更优选为阀门，最优选为螺丝阀。
[0012] 在本发明第一个方面的一种优选实施例中，所述细胞裂解室中，从所述样品加入 口处，至液体流出口之间，设有样品流动通道。其中，所述样品流动通道可以是直线型、曲线 形或其组合，更优选为曲线形，如Z型、S型、U型、C型等弯曲的形状。
[0013] 其中，所述样品流动通道长度优选为至少20cm。
[0014] 其中，样品加入口可以连通所述样品流动通道，或者可以位于所述样品流动通道 的上方。
[0015] 其中，所述样品加入口可以是阀门，如单向阀、双向阀或三通阀。其中，所述样品加 入口也可以是橡胶件，将注射器从所述橡胶件中插入进行注射，注射器拔出后，橡胶件在弹 性作用下将注射器形成的针口封闭。
[0016] 在本发明第一个方面的一种优选实施例中，所述滤器可以是至少一层过滤网、或 至少一层填料组成，或者由过滤网和填料的组合制成，并优选为由多层滤网和/或多层填 料组成。
[0017] 在本发明第一个方面的一种优选实施例中，所述细胞液滤过单元中，在液体进口 与所述过滤器之间形成有一空间，优选地，所述空间的体积由所述液体进口至过滤器之间 逐步变大。
[0018] 在本发明第一个方面的一种优选实施例中，所述过滤器为中间放大、两端内缩的 形状。更优选地，所述过滤器下游一端的面积小于上游一端的面积。
[0019] 在本发明第一个方面的一种优选实施例中，所述微流控芯片还可以包括扩增引 物。
[0020] 在本发明第一个方面的一种优选实施例中，所述微流控芯片还可以包括显色剂。
[0021] 在本发明第一个方面的更优选实施例中，所述微流控芯片为检测JAK2 V617F基因 突变的微流控芯片，其中，所述显色剂为钙黄绿素，所述扩增引物至少包括如下序列：
[0022] GCATCTTTATTATGGCAGAGAG ；
[0023] TGCTCTGAGAAAGGCATTA ；
[0024] GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0025] TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0026] GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0027] TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0028] GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC ；
[0029] GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC。
[0030] 本发明第二个方面是提供一种检测基因突变的方法，包括：
[0031] 将全血样品注射至一细胞裂解室，在所述细胞裂解室内裂解；
[0032] 所述裂解室连通至细胞液滤过单元，所述滤过单元中设有过滤器，所述过滤器的 滤孔孔径为25-35 μ m、例如30 μ m ;裂解液通过所述过滤器进行过滤；
[0033] 在所述细胞液滤过单元下游连接有扩增及检测池，扩增及检测池内包被有扩增引 物，过滤后的液体进入所述扩增及检测池，加入显色剂，进行扩增反应；通过颜色判断是否 存在基因突变。
[0034] 在本发明第二个方面中，所述方法采用本发明第一个方面所述的微流控芯片进行 实施。
[0035] 在本发明第二个方面中，所述全血样品可以是全血的稀释样品，如用水稀释的样 品，全血与水按照1 : 10体积比稀释。
[0036] 在本发明第二个方面的一种优选实施例中，所述基因突变为JAK2 V617F基因突 变，所述显色剂为钙黄绿素，所述扩增引物至少包括如下序列：
[0037] GCATCTTTATTATGGCAGAGAG ；
[0038] TGCTCTGAGAAAGGCATTA ；
[0039] GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0040] TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0041] GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ；
[0042] TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ；
[0043] GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC ；
[0044] GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC。
[0045] 其中，所述显色剂为钙黄绿素时，所述判断是通过观察扩增即检测池中是否出现 绿色产物进行实施。
[0046] 其中，所述裂解的温度条件优选为90_105°C、更优选为92_100°C、更优选为 95-98。。。
[0047] 其中，所述裂解的时间优选为至少1分钟，更优选为至少1. 5分钟，更优选为至少 2分钟，如1-5分钟，更优选为2-4分钟，更优选为3-3. 5分钟。
[0048] 其中，所述扩增反应的温度条件优选为60_70°C，更优选为62_68°C，更优选为 63-65。。。
[0049] 其中，所述扩增反应的时间优选为至少30分钟，更优选为至少45分钟，更优选为 至少1小时，如30分钟至5小时，更优选为45分钟至3小时，更优选为1小时至2小时。
[0050] 应当理解的是，本发明上述内容中，各个方面以及各种实施例之间，可以由本领域 技术人员不受限制的进行任意组合，并且所述组合也在本发明上述内容范围内。
[0051] 如上所述，本发明提供了一种整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突 变的微流控芯片，以及用所述微流控芯片进行基因突变检测的方法，本发明无需对全血中 的核酸进行提取，将全血稀释后直接加入到芯片中，通过加热裂解法在芯片上提取DNA，进 行扩增，反应液中加入荧光染料钙黄绿素作为指示剂，不需任何仪器，在1小时内即可实现 对结果的可视化检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图1为本发明微流控芯片设计示意图；
[0053] 图2为本发明微流控芯片中裂解液滤过单元放大结构示意图；
[0054] 图3为本发明方法的JAK2 V617F杂合突变患者的全血样本检测结果照片。
【具体实施方式】
[0055] 参照图1，本发明的一种实施例中，微流控芯片分为细胞裂解室1，细胞液滤过单 元2及基因扩增及检测池3,其中，在细胞液滤过单元2及基因扩增及检测池3之间设计螺 丝阀4进行流体控制。芯片制作采用软光刻技术及微加工技术，SU-8光刻胶制作阳模，激 光雕刻技术制作微反应扩增池阳模，最终制作PDMS-玻璃杂合微流控芯片。
[0056] 如图2所示，所述细胞液滤过单元2包括壳体以及壳体内的过滤器21，裂解液从液 体入口 22进入后，通过过滤器21进行过滤。如图2所示，过滤器可以是多层滤网结构，也 可以是多层填料结构，当使用多层填料结构时，填料之间形成液体通道，用于过滤。
[0057] 在液体入口 22和过滤器21之间，形成有空腔，并且空腔逐步增大直至过滤器21 位置。过滤器21由上至下逐步变大、达到最大处逐步内缩，形成类似于梭形的形状。
[0058] 以检测JAK2 V617F基因突变为例，设计针对JAK2 V617F基因突变的野生型及突 变型的LAMP反应引物，如下：
[0059] F3 ：GCATCTTTATTATGGCAGAGAG
[0060] B3 ：TGCTCTGAGAAAGGCATTA
[0061] J2M ：GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC
[0062] ASO-W ：TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC
[0063] J2W ：GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC
[0064] ASO-M ：TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC
[0065] FIP ：GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC
[0066] BIP ：
[0067] GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC
[0068] 反应体系：5 μ mol/1 F3 I μ 1、5 μ mol/1 B3 I μ 1、40 μ mol/1 FIP I μ 1、 40ymol/l BIP 1μ1、40μπιο1/1 J2M 1μ1、40μπιο1/1 ASO-W 1μ1、40μπιο1/1 J2W Ιμ?、 40ymol/l ASO-M 1 μ IUO X Thermopol 2. 5 μ I, dNTPUOOmM Mg2+3yl,FD UBst DNA 1 μ 1> Calcein 1 μ 1〇
[0069] 检测方法如下：
[0070] 将引物通过注入-蒸发法包被与芯片对应的扩增基检测池3中，完成功能化芯片。 选择JAK2 V617F杂合突变的患者，将1 μ 1全血与去离子水I : 10稀释后直接注入芯片细 胞裂解室1，关闭螺丝阀4,95°C裂解3分钟。开启螺丝阀4,裂解液通过裂解液滤过单元2 后进入扩增基检测池3,关闭螺丝阀，然后在扩增基检测池中加入含有钙黄绿素的反应液。 用未固化的聚二甲基硅氧烷封堵进出口，于65°C热板上反应1小时。直接根据扩增池中是 否产生绿色产物判断结果，如图3所示。
[0071] 从图3中可以看出，本发明采用全血样品进行检测，与阳性对照相似，JAK2 V617F 基因突变野生型、以及突变型均得到了绿色产物，这说明：本发明所述的芯片和方法能够采 用全血样品为检测对象，检测JAK2 V617F基因突变。
[0072] 附图中各附图标记含义如下：
[0073] 1-细胞裂解室；
[0074] 11-样品加入口；
[0075] 2-裂解液滤过单元；
[0076] 21-过滤器；
[0077] 22-液体进口；
[0078] 3-扩增及检测池；
[0079] 4-螺丝阀；
[0080] NC-阴性对照扩增检测结果；
[0081] M-包被野生型引物及探针扩增检测结果；
[0082] W-包被突变引物及探针扩增检测结果；
[0083] PC-阳性对照扩增检测结果。
[0084] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1. 一种整合全血核酸提取、扩增即可视化检测肿瘤基因突变的微流控芯片，其特征在 于，包括细胞裂解室和细胞液滤过单元；所述细胞裂解室设有样品加入口和液体流出口； 其中，所述细胞液滤过单元的上游连通所述细胞裂解室的液体流出口，所述细胞液滤 过单元的下游连通至基因扩增及检测池；所述上游和下游之间设有过滤器，所述过滤器的 滤孔孔径为25-35 ii m。
2. 根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞液滤过单元与基因扩增 及检测池之间设有可闭合的通道。
3. 根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述闭合通道为螺丝阀。
4. 根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞裂解室中，从所述样品加 入口处，至液体流出口之间，设有曲线形样品流动通道。
5. 根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述样品流动通道长度至少为 20cm〇
6. 根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述过滤器由多层滤网和/或多层 填料组成。
7. 根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括扩增引物。
8. 根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括显色剂。
9. 一种检测基因突变的方法，其特征在于，包括： 将全血样品注射至一细胞裂解室，在所述细胞裂解室内裂解； 所述裂解室连通至细胞液滤过单元，所述滤过单元中设有过滤器，所述过滤器的滤孔 孔径为25-35 y m ;裂解液通过所述过滤器进行过滤； 在所述细胞液滤过单元下游连接有扩增及检测池，扩增及检测池内包被有扩增引物， 过滤后的液体进入所述扩增及检测池，加入显色剂，进行扩增反应；通过颜色判断是否存在 基因突变。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因突变为JAK2V617F基因突变，所 述显色剂为钙黄绿素，所述扩增引物至少包括如下序列： GCATCTTTATTATGGCAGAGAG ； TGCTCTGAGAAAGGCATTA ； GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ； TGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ； GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAC ； TGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC ； GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGAAATGGACAACAGTCAAACAAC ； GCTTTCTCACAAGCATTTGGTTTTAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC。
【文档编号】C12M1/34GK104312913SQ201410554594
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月17日 优先权日:2014年10月17日
【发明者】关明, 汪骅, 张心菊, 吴之源, 许笑, 刘维薇, 周丹秋 申请人:复旦大学附属华山医院