一种噬菌体的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种噬菌体的检测方法，S100、培养基的制备：制备适于噬菌体宿主菌生长的宿主培养基；S200、菌悬液的涂布：在所述宿主培养基上涂布噬菌体宿主菌菌悬液，形成检测培养基；S300、噬菌体的检测：包括：气体中噬菌体检测：先将所述检测培养基在待测区域暴露放置，再进行培养，并利用奥梅粱斯基公式计算气体中噬菌体数量；以及液体中噬菌体检测：先将待测液体涂布在所述检测培养基上，再进行培养，并计算液体中噬菌体数量。本发明不仅能够准确地检测发酵生产工业厂区气体中的噬菌体数量，而且能够准确地检测发酵生产工业厂区例如下水道、洗消池等处液体中的噬菌体数量。
【专利说明】一种噬菌体的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其是涉及一种噬菌体的检测方法。
【背景技术】
[0002] 噬菌体（Bacteriophage)是在 1907 年和 1909 年分别由 Twort 和 D. Herelle 各自 独立发现，噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引 起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体作为病毒的一种，具有病毒特有的一些特性：个体 微小；不具有完整细胞结构；只含有单一核酸。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知 的噬菌体都是在细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基 酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖，一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长， 也不能复制。
[0003] 发酵工业常受噬菌体的危害，当出现噬菌体的时，轻则导致发酵周期长、影响产 量，重则引起工厂停产，例如在发酵工业应用较广泛的是枯草芽孢杆菌，由于其具有发酵周 期短、产物丰富、可利用开发价值高等优点，使它能够应用在食品加工、农业生产、能源开发 等多个方面，但枯草芽孢杆菌极易感染噬菌体，枯草芽孢杆菌发酵工业受到的危害也尤其 严重，因此对噬菌体的检测显得尤为重要。
[0004] 目前对噬菌体检测的研究虽然已有很多，例如实验室检测发酵液噬菌体多采用双 层平板琼脂法、发酵厂区空气中噬菌体的检测大多采用浮游细菌采样器检测等，但是目前 的噬菌体的检测方法至少存在如下所述的缺点：
[0005] 1、缺乏检测发酵生产工业厂区下水道、洗消池等液体中噬菌体的有效检测方法。
[0006] 2、实验室双层平板琼脂法的操作难度较大，其准确度难以把握，需要专业人士操 作才能完成，不适于发酵工业的大批量、快速检测。
[0007] 3、利用浮游细菌采样器检测噬菌体费时、费力，而且需要专门的浮游细菌采样器， 其价格较高，不利于降低生产成本，尤其是影响对于中小企业的发展等。
[0008] 因此，目前噬菌体检测的检测方法有待进一步改进。
【发明内容】
[0009] 为解决上述技术问题，本发明公开了一种噬菌体的检测方法，该方法包括：
[0010] S100、培养基的制备：制备适于噬菌体宿主菌生长的宿主培养基；
[0011] S200、菌悬液的涂布：在所述宿主培养基上涂布噬菌体宿主菌菌悬液，形成检测培 养基；
[0012] S300、噬菌体的检测：
[0013] 包括：
[0014] 气体中噬菌体检测：先将所述检测培养基在待测区域暴露放置，再进行培养，并利 用奥梅粱斯基公式计算气体中噬菌体数量；以及
[0015] 液体中噬菌体检测：先将待测液体涂布在所述检测培养基上，再进行培养，并计算 液体中噬菌体数量。
[0016] 其有益效果：不仅能够准确地检测发酵生产工业厂区气体中的噬菌体数量，而且 能够准确地检测发酵生产工业厂区例如下水道、洗消池等处液体中的噬菌体数量；操作非 常简单，不需要专业人士也可以完成检测，省时省力，适用范围更加广泛，尤其适用于快速、 大批量的工业检测；检测时的要求条件极其简单，整个检测过程均不使用特殊仪器或或价 格昂贵的设备，只需要冰箱、灭菌器、培养皿、温箱等常见设备，适用范围更广，有利于进一 步降低企业、尤其是中小企业的生产成本。
[0017] 可选的，所述噬菌体宿主菌为枯草芽孢杆菌、根瘤菌或大肠杆菌。由此，本发明可 以对多种噬菌体宿主菌的发酵工业进行检测，从而使本发明的噬菌体的检测方法的适用范 围更加广泛，应用价值更大。
[0018] 可选的，所述宿主培养基为营养琼脂培养基、YM培养基或LB培养基。由此，宿主 培养基能够适于多种噬菌体宿主菌的生长，进而可以对多种噬菌体宿主菌的发酵工业进行 检测。
[0019] 可选的，所述营养琼脂培养基包含：9. 0?12.0克蛋白胨、2.0?4.0克牛肉膏、 4. 0?6. 0克氯化钠、12. 0?16. 0克琼脂、以及1000毫升蒸馏水；
[0020] 或者，所述YMA培养基包含：2. 0?3.0克酵母膏、0. 1?0.3克硫酸镁、0.4?0.8 克磷酸氢二钾、〇. 1?〇. 3克氯化钠、0. 05?0. 1克氯化钙、8. 0?12. 0克甘露醇、10?20 克琼脂、以及800毫升蒸馏水；
[0021] 或者，所述LB培养基包含：8. 0?15. 0克胰蛋白胨、4.0?8.0克酵母膏、10. 0? 15. 0克氯化钠、12. 0?18. 0克琼脂、以及1000毫升蒸馏水。
[0022] 由此，噬菌体宿主菌可以在培养基上保持良好生长，进而能够实现对噬菌体的有 效检测。另外，培养基制备方法简单，制备所用原料也容易获得，从而有利于节约制备成本。
[0023] 可选的，步骤SlOO还包括：烘干培养基。发明人发现，当培养基的水分被烘干以 后，不仅噬菌体宿主细菌可以保持正常生长，而且可以减少杂菌污染的概率，进而有利于提 高检测的准确性。
[0024] 可选的，烘干培养基的条件为：35?50摄氏度、10?20分钟。由此，在此条件下， 既可以烘干培养基，又不会破坏培养基的营养成分，确保噬菌体宿主菌生长良好，进而有利 于提商检测的准确性。
[0025] 可选的，在步骤S300中检测气体中的噬菌体时，气体中噬菌体数量的计算公式 为：
[0026] C1 = Ioooxson1Zat
[0027] 其中，C1为每立方米气体中的噬菌体数量（cfu/m3)，N 1为每个培养皿的噬菌斑数 量（个/皿），A为培养皿的面积（cm2)，T为暴露放置时间（min);
[0028] 在步骤S300中检测液体中的噬菌体时，液体中噬菌体数量的计算公式为：
[0029] C2 = N2Xl/V
[0030] 其中，C2为液体中噬菌体数量（个/ml) ,N2为每个培养皿的噬菌斑数量（个/皿）， V为中涂布所用菌悬液的体积（ml)。
[0031] 由此，本发明将奥梅粱斯基公式推算为：C = 1000X50N/AT，将液体检测时的计算 公式推算为：C2 = N2X 1/V，使检测气体和液体时计算起来非常方便、快捷。
[0032] 可选的，在步骤100中，制备培养基所用的培养皿为6?15厘米的培养皿，此尺寸 的培养皿不仅可以确保实现本发明的检测目的，而且避免了尺寸大的培养皿造成价格升高 的问题，从而有利于进一步降低生产成本，尤其是在大批量工业检测中，降低生产成本的效 果极其显著，从而有利于促进企业的更好发展；
[0033] 或/和，在步骤S200中，涂布所用噬菌体宿主菌菌悬液的体积为0. 1?0. 2毫升， 发明人发现，利用菌悬液〇. 1?〇. 2毫升菌悬液涂布，能够确保噬菌体可以有效寄生在宿主 菌上，过多或过少均会导致噬菌体难以寄生在宿主菌上。
[0034] 可选的，在步骤S300中，所述检测培养基在待测区域暴露放置的时间为20?35 分钟，发明人发现，暴露放置的时间为20?35分钟时，可以使检测气体的准确性与利用浮 游细菌采样器检测的准确性基本一致，确保检测的准确性最佳，而缩短或延长暴露放置时 间均会导致检测的准确性降低；
[0035] 或/和，步骤S200还包括菌悬液的制备：将噬菌体宿主菌的菌苔接种于灭菌的培 养液中，在摇床中35?39摄氏度、160?250转/分钟培养10?70小时，从而可以有效制 备菌悬液，且确保菌悬液中的噬菌体宿主菌保持良好的性能。
[0036] 可选的，在步骤S300中，在30?40摄氏度条件下对培养基进行倒置培养20?70 小时。由此，噬菌体可以在宿主菌生长良好，培养后的噬菌斑清楚可见，从而有利于进一步 提1?检测的准确性。
[0037] 根据本发明的噬菌体的检测方法，可以取得至少如下所述的有益效果：
[0038] 1、根据本发明的噬菌体的检测方法，本发明的噬菌体检测方法检测气体的准确性 与利用浮游细菌采样器检测气体的准确性基本一致、检测液体的准确性与利用双层平板琼 脂法检测的准确性也基本一致。因此，本发明的噬菌体检测方法能够准确地检测气体和液 体中的噬菌体。
[0039] 2、根据本发明的噬菌体的检测方法，不仅能够准确地检测发酵生产工业厂区气体 中的噬菌体数量，而且能够准确地发酵生产工业厂区例如下水道水、洗消池等处液体中的 噬菌体数量。
[0040] 3、根据本发明的噬菌体的检测方法，检测液体和检测气体的操作步骤基本相同， 例如步骤SlOO和S200相同，以及所用培养基也可以相同，一方面可以一次准备即可同时检 测气体和液体，另外一个方面也取得一种原料多种用途理想效果，从而有利于进一步降低 生产成本。
[0041] 4、根据本发明实施例的噬菌体的检测方法，可以检测多种不同种类的噬菌体，检 测时，只需选择使用相应的噬菌体宿主菌和宿主培养基即可，从而检测范围更广泛，实用价 值更大，能够满足多方面的需求。
[0042] 5、根据本发明的噬菌体的检测方法，操作简单，不需要专业人士也可以完成检测， 省时省力，适用范围更加广泛，尤其适用于快速、大批量的工业检测。
[0043] 6、根据本发明的噬菌体的检测方法，检测时的要求条件极其简单，整个检测过程 均不使用特殊仪器或或价格昂贵的设备，只需要冰箱、灭菌器、培养皿、温箱等常见设备，从 而不仅使本发明的噬菌体检测方法适用范围更广，而且有利于进一步降低企业、尤其是中 小企业的生产成本，具有更广泛的适用范围和更巨大的推广价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变 得明显和容易理解，其中：
[0045] 图1是根据本发明实施例中的噬菌体的检测方法的操作流程示意图；
[0046] 图2是根据本发明实施例中的噬菌体的检测方法的操作流程示意图。
【具体实施方式】
[0047] 下面通过具体的实施例，并结合附图对本发明做进一步的详细描述。需要说明的 是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，实施例 是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0048] 在本发明中，如无特殊说明，所用专业术语按照以下所述理解：
[0049] 1)奥梅粱斯基公式：是由前苏联的奥梅梁斯基提出，目前已被广泛采用的换算沉 淀菌与浮游菌关系的公式，具体公式如下：
[0050] C = NX 100/AX5/TX 1000/10 = 50000N/AT
[0051] 其中，C为每立方米气体中菌落数（cfu/m3)，N为经培养后每个培养基上的菌落数， A为培养平皿面积（cm2)，T为暴露放置时间（min)。
[0052] 可以将奥梅粱斯基公式推算为如下计算公式：
[0053] C = 1000X50N/AT
[0054] 2)双层琼脂平板法：先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主 细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基，培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。
[0055] 3)噬菌体宿主菌：噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内，因此， 能被某种噬菌体寄生的细菌为该噬菌体的噬菌体宿主菌。
[0056] 对于本领域的普通技术人员而言，可以根据本发明的描述或本领域的普通知识理 解上述术语在本发明中的具体含义。
[0057] 在本发明的一个方面，本发明公开了一种噬菌体的检测方法。根据本发明的实施 例，如图1和2所示,该方法包括：
[0058] S100、培养基的制备
[0059] 制备适于噬菌体宿主菌生长的宿主培养基。制备时，先将培养基制备试剂灭菌，冷 却至合适温度，然后将培养基制备试剂倒入培养皿中，制成宿主培养基。
[0060] S200、菌悬液的涂布
[0061] 在步骤SlOO所制备的宿主培养基上涂布噬菌体宿主菌菌悬液，形成检测培养基。
[0062] 在涂布时，可预先将噬菌体宿主菌的菌苔接种于灭菌的培养液中，混匀后发酵培 养，然后涂布在SlOO制备的宿主培养基上，形成检测培养基。
[0063] 需要特别说明的是，本发明所用的噬菌体宿主菌以及适于其生长的宿主培养基均 不受特别限制，例如，噬菌体宿主菌可以选用一切可用的噬菌体宿主，宿主培养基的种类可 以选用一切可用的适于噬菌体宿主菌生长的培养基等。
[0064] S300、噬菌体的检测
[0065] 检测噬菌体时，利用S200中已经涂布宿主菌菌悬液的检测培养基进行检测，根据 不同种类的检测对象，检测方法操作如下：
[0066] 气体中噬菌体的检测：
[0067] 检测对象为气体时，例如发酵厂区的空气，先将检测培养基在待测区域暴露放置 一段时间，再将检测培养基移至温箱中进行培养，培养后通过眼观即可对培养皿上的噬菌 斑数量进行统计，最后利用奥梅粱斯基公式即可计算气体中噬菌体数量。
[0068] 液体中噬菌体的检测：
[0069] 检测对象为液体时，例如发酵生产工业厂区下水道、洗消池等处的水体，先将待测 液体涂布在检测培养基上，再对检测培养基进行培养，培养后通过眼观即可对培养皿上的 噬菌斑数量进行统计，再结合S200中涂布所用菌悬液的体积，从而能够计算液体中噬菌体 数量，例如假设培养皿上的噬菌斑数量为30个，S200中涂布所用菌悬液的体积0. 1毫升， 则待测液体的噬菌体数量为：300个/毫升。
[0070] 相关技术人员应该理解的是，在上述技术方案的基础上，本发明的噬菌体检测方 法还可以借鉴一切现有技术手段进行检测，例如调整培养基配方、无菌操作等，这些变化均 落在本发明的保护范围之内。
[0071] 为了使本【技术领域】的技术人员进一步理解该技术方案，下面列举一个具体的实施 实例。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的：
[0072] 实施例1空气中枯草芽孢杆菌噬菌体的检测
[0073] 试验地：山东京青科技有限公司发酵厂区。
[0074] 检测方法如下：
[0075] 1)制备营养琼脂培养基：
[0076] 营养琼脂培养基的配方如下：
[0077] 10. 0克的蛋白胨、3. 0克的牛肉膏、5. 0克的氯化钠、14. 0克的琼脂、以及1000毫 升蒸馏水。
[0078] 在121摄氏度高压灭菌15分钟，待灭菌冷却至55摄氏度后倒入直径9厘米培养 皿中，待培养基冷却后，于干燥箱中45摄氏度、10分钟烘干培养基水分，制成宿主培养基。
[0079] 2)菌悬液的涂布：培养液配方为：配方10. 0克蛋白胨、3. 0克牛肉膏、5. 0克氯化 钠、以及1000毫升蒸馏水，在121摄氏度高压灭菌15分钟，冷却后将枯草芽孢杆菌菌苔接 种于灭菌的培养液中，摇床37摄氏度220转/分钟培养24小时，形成菌悬液；吸取0. 2毫 升菌悬液涂布在培养皿中的培养基上，形成检测培养基。
[0080] 3)检测：选取厂区内5个地点的空气为检测对象，地点分别是发酵车间、原料车 间、空压机房、干燥车间、浓缩车间，按照《室内空气质量标准》（GB/T18883-2002)的要求进 行，每个地点设置5个采样点，即室内墙角对角线交点为1个采样点，该交点与四墙角连线 的中点为另外4个采样点。培养皿开盖暴露放置在采样点处，使检测培养基与空气充分接 触，暴露放置30分钟，将培养皿盖合上后在恒温培养箱中35摄氏度倒置培养24小时，培养 后通过眼观对培养皿上的噬菌斑数量进行统计，同时，在相同条件下，利用浮游细菌采样器 测定上述5个地点的噬菌斑数量，以此为对照。
[0081] 利用公式计算空气中噬菌体的数量，具体如下：
[0082] C1 = N1XlOOA X 5/T X 1000/10 = 50000VAT
[0083] 其中，C1为每立方米气体中菌落数（cfu/m3)，N 1为经培养后每个培养基上的菌落 数，A为培养平皿面积（cm2)，T为暴露放置时间（min)。
[0084] 检测结果如表1所示，由表1可以得出，利用本发明的噬菌体检测方法检测空气中 噬菌体数量，与利用浮游细菌采样器检测空气中噬菌体的数量基本一致，总体略低于浮游 细菌采样器测得的噬菌体的数量，具体是：发酵车间低〇. 2%、原料车间低2. 2%、空压机房 相同、干燥车间低1. 9%、浓缩车间低0. 3%，差别较小。因此，本发明的噬菌体检测方法可 以准确检测空气中噬菌体含量，且不需要浮游细菌采样器，省时省力，从而有利于降低生产 成本，促进企业的更好地发展。
[0085] 表1空气中噬菌体数量统计表
[0086]
【权利要求】
1. 一种噬菌体的检测方法，其特征在于，该方法包括： S100、培养基的制备：制备适于噬菌体宿主菌生长的宿主培养基； S200、菌悬液的涂布：在所述宿主培养基上涂布噬菌体宿主菌菌悬液，形成检测培养 基； S300、噬菌体的检测： 包括： 气体中噬菌体检测：先将所述检测培养基在待测区域暴露放置，再进行培养，并利用奥 梅粱斯基公式计算气体中噬菌体数量；以及 液体中噬菌体检测：先将待测液体涂布在所述检测培养基上，再进行培养，并计算液体 中噬菌体数量。
2. 根据权利要求1所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，所述噬菌体宿主菌为枯草 芽孢杆菌、根瘤菌或大肠杆菌。
3. 根据权利要求1所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，所述宿主培养基为营养琼 脂培养基、YM培养基或LB培养基。
4. 根据权利要求3所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，所述营养琼脂培养基包含： 9. O?12. O克蛋白胨、2. O?4. O克牛肉膏、4. O?6. O克氯化钠、12. O?16. O克琼脂、以 及1000毫升蒸馏水； 或者，所述YM培养基包含：2. 0?3. 0克酵母膏、0. 1?0. 3克硫酸镁、0. 4?0. 8克 磷酸氢二钾、〇. 1?〇. 3克氯化钠、0. 05?0. 1克氯化钙、8. 0?12. 0克甘露醇、10?20克 琼脂、以及800毫升蒸馏水； 或者，所述LB培养基包含：8.0?15. 0克胰蛋白胨、4.0?8.0克酵母膏、10. 0?15. 0 克氯化钠、12. 0?18. 0克琼脂、以及1000毫升蒸馏水。
5. 根据权利要求1所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，步骤SlOO还包括：烘干培 养基。
6. 根据权利要求5所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，烘干培养基的条件为：35? 50摄氏度、10?20分钟。
7. 根据权利要求1?6中任一项所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，在步骤S300 中检测气体中的噬菌体时，气体中噬菌体数量的计算公式为： C1 = 1000X50N/AT 其中，C1为每立方米气体中的噬菌体数量（cfu/m3)，N 1为每个培养皿的噬菌斑数量（个 /皿），A为培养皿的面积（cm2)，T为暴露放置时间（min); 在步骤S300中检测液体中的噬菌体时，液体中噬菌体数量的计算公式为： C2 = N2XlA 其中，C2为液体中噬菌体数量（个/ml)，N2为每个培养皿的噬菌斑数量（个/皿），V 为涂布所用菌悬液的体积（ml)。
8. 根据权利要求7所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，在步骤SlOO中，制备培养基 所用的培养皿为直径6?15厘米的培养皿； 或/和，在步骤S200中，涂布所用噬菌体宿主菌菌悬液的体积为0. 1?0. 2毫升。
9. 根据权利要求7所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，在步骤S300中，所述检测培 养基在待测区域暴露放置的时间为20?35分钟； 或/和，步骤S200还包括菌悬液的制备：将噬菌体宿主菌的菌苔接种于灭菌的培养液 中，在摇床中35?39摄氏度、160?250转/分钟培养10?70小时。
10.根据权利要求7所述的噬菌体的检测方法，其特征在于，在步骤S300中，在30? 40摄氏度条件下对培养基进行倒置培养20?70小时。
【文档编号】C12R1/92GK104313182SQ201410570832
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】郭中信, 冯阿芳, 赵丽, 郭倩 申请人:山东京青农业科技有限公司