一种副猪嗜血杆菌的二重pcr检测方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体为一种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。本发明以具有该病原体基因型特点的保守性16SrRNA基因，及其毒力因子编码基因vtaA基因，作为PCR检测的两个基因靶点，将扩增该2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异性等各项参数调整优化，建立直接从样品中一次检测副猪嗜血杆菌的二重PCR方法。本发明方法体系可用于检测具有呼吸道症状和(或)关节肿大的病猪肺组织和关节液的副猪嗜血杆菌，既可以准确检测病原体，还可以对其毒力因子编码基因结构变异进行分析，从而掌握其变异趋势，起到一箭双雕作用。
【专利说明】-种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种能检测副猪嗜血杆菌的二重PCR方法。
【背景技术】
[0002] 副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS)为一种多形态、非溶血性、不运动、革 兰氏阴性菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，为猪的格氏病（Glasser 's disease)病原菌，广 泛存在于普通饲养猪群上呼吸道，可引发猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。随着养猪业的 发展，该菌感染引起的疾病已经成为影响全球养猪业的一种重要细菌性疾病，给养殖业带 来巨大经济损失，已经引起各国对副猪嗜血杆菌研究的高度重视，我国是养猪大国，研究副 猪嗜血杆菌快速准确的检测方法对于养殖业具有重要意义。
[0003] 副猪嗜血杆菌对于营养要求比较苛刻，在实验中较难培养，同时在采样过程中分 离率也较低，采用传统病原学诊断方法具有较大难度，并且传统的血清型诊断方法有操作 繁琐复杂，耗时耗力，特异性和灵敏性低等多种不足。由于细菌16SrRNA序列保守性极高， 是细菌分类鉴定较为理想的靶序列，所以可用16S rRNA可对副猪嗜血杆菌进行检测。副猪 嗜血杆菌是猪呼吸道的常在菌或条件性致病菌，而且常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆 环病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等猪呼吸道病原微生 物混合或继发感染，所以区分出正常栖生菌株与致病性菌株是确诊的关键所在，而毒力因 子是区分致病性与非致病菌株的重要标志物。研究表明与毒力相关的自转运蛋白VtaA具 有良好的免疫原性，并且该转运蛋白基因只在感染的机体内表达，自转运蛋白具有粘附素、 红血球凝集素和侵袭素的一些特征。且自转运蛋白与细菌的粘附、入侵和毒力有关，能够介 导生成生物被膜和产生血清抗性，是副猪嗜血杆菌的一种重要的毒力因子。
[0004] 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基础上加以改进，于一个PCR反应体 系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。所以建立副猪嗜血 杆菌的PCR检测方法对于养殖业HPS的防治具有重要意义，可以为其防治提供有力的技术 手段。
【发明内容】
[0005] 鉴于副猪嗜血杆菌是当前集约化猪场的常见重要病原体，且往往与其他常见病原 体混合感染，传统的诊断技术如细菌分离、免疫学实验等费时费力，不适于临床快速诊断， 也不适于大规模的流行病学调查的现状，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一 种直接从样品中检测副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。本发明的方法在检测病原体的同 时，可以对其毒力因子编码基因结构变异进行分析，从而掌握其变异趋势。
[0006] 本发明本着既能检测病原体又能分析其重要毒力因子编码基因变异特点的原则， 从已发表的文献中筛选出具有该病原体基因型特点的保守性基因片段16SrRNA(821bp)，同 时筛选该病原体重要的毒力因子编码基因片段VtaA基因（406bp)，作为PCR检测的两个基 因靶点，将扩增这2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系，通过对退火温度、特异 性等各项参数调整优化，建立直接从样品中检测副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法。
[0007] 本发明是通过以下的技术方案实现的。
[0008] -种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法，以具有副猪嗜血杆菌基因型特点的保守 性基因片段16SrRNA和毒力因子编码基因片段VtaA基因，作为PCR检测的两个基因靶点， 将扩增这2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电 泳检测鉴定PCR扩增产物；其中：扩增16SrRNA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所 示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示；扩增VtaA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 3 所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所（见表1)示。
[0009] 表1副猪嗜血杆菌16SrRNA基因和VtaA基因引物
[0010]
【权利要求】
1. 一种副猪嗜血杆菌的二重PCR检测方法，其特征在于：以具有副猪嗜血杆菌基因型 特点的保守性基因片段16SrRNA和毒力因子编码基因片段vtaA基因，作为PCR检测的两个 基因靶点，将扩增这2个基因片段的2对引物放在一个PCR反应体系进行扩增，再通过琼脂 糖凝胶电泳检测鉴定PCR扩增产物；其中： 扩增16SrRNA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO. 2所示； 扩增vtaA基因的上游引物的序列如SEQ ID NO. 3所示；下游引物的序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 如权利要求1所述的二重PCR检测方法，其特征在于：所述PCR反应体系如下：cDNA 模板1μ 1，2对上、下游引物各0. 5μ 1，PCR Mix 12. 5μ 1，超纯水补充至25μ 1 ;PCR反应条 件：95°C预变性5min，进入95°C 60s，58°C lmin和72°C lmin的循环，循环35次，最后72°C 延伸5min。
【文档编号】C12Q1/68GK104293966SQ201410572510
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】朱建国, 韩少鹏 申请人:上海交通大学