焦磷酸测序法同时检测e2a-pbx1、tel- aml1和mll-af4融合基因的引物对及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种焦磷酸测序法同时检测E2A-PBX1、TEL-AML1和MLL-AF4融合基因的引物对及包含所述引物对的试剂盒，该试剂盒能够一次性检测E2A-PBX1、TEL-AML1、MLL-AF4(e9/e5)、MLL-AF4(e9/e4)和MLL-AF4(e10/e4)多种融合基因。通过对E2A-PBX1、TEL-AML1、MLL-AF4融合基因的mRNA设计引物，经过逆转录PCR后对产物进行测序分析，本试剂盒可以实现E2A-PBX1、TEL-AML1和MLL-AF4融合基因的快速、准确、高通量的检测。
【专利说明】焦磷酸测序法同时检测E2A-PBX1、TEL-AML1和MLL-AF4融 合基因的引物对及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法同时检测E2A-PBX1、 TEL-AML1和MLL-AF4融合基因的引物对，包含所述引物对的试剂盒及该试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002] E2A-PBX1、TEL-AML1、MLL-AF4 (e9/e5)、MLL-AF4 (e9/e4)、MLL-AF4 (el0/e4)融合基 因是急性淋巴细胞性白血病（ALL)中常见的融合基因。
[0003] 当前国内外广泛使用的分子生物学检测E2A-PBX1、TEL-AML1、MLL-AF4融合基因 的方法中，荧光原位杂交技术（FISH)只能进行定性检测、操作复杂；荧光定量PCR存在着 检测通量的局限性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片 (Biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。
[0004] 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量 样品进行测序分析的能力，为高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验提 供了非常理想的技术操作平台。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种焦磷酸测序法同时 检测E2A-PBX1、TEL-AML1和MLL-AF4融合基因的试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、高准确 度、检测迅速等优点。
[0006] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种焦磷酸测序法检测 E2A-PBXl、TEL-AMLl、MLL-AF4(e9/e5)、MLL-AF4(e9/e4)和MLL-AF4(elO/e4)融合基因的弓丨 物对，其特征在于，所述引物对包括：
[0007] (1)对于E2A-PBX1 基因，
【权利要求】
1. 一种焦磷酸测序法同时检测E2A-PBX1、TEL-AML1和MLL-AF4融合基因的引物对，其 中，所述的 MLL-AF4 融合基因包括 MLL-AF4 (e9/e5)、MLL-AF4 (e9/e4)和 MLL-AF4 (el0/e4) 中的任意一种或几种，其特征在于，所述引物对包括： (1) 对于E2A-PBX1基因， 扩增引物为： 上游引物：5' -GGCCTCCCGACTCCTACA-3'， 下游引物：5' -CTGGGGGTCTGTGGGITC-3'， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物为： 5，-GCTCCTCGGATACTCAA-3'; (2) 对于TEL-AML1基因： 扩增引物为： 上游引物：5' -CCATGCCCAITGGGAGAATAG-3'， 下游引物：5' -TCGTGGACGTCTCTAGAAGGAITC-3 '， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5' -GATTCATTCCAAGTATGC-3' (3) 对于 MLL-AF4(e9/e5)和 MLL-AF4(e9/e4)基因： 扩增引物为： 上游引物：5' -CCGCCCAAGTATCCCTGTAAAAC-3，， 下游引物： 5，-AGCGGCTTCACTCAGACCCTAAAGGAGGCGGCCATGAA-3,， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5，-AAAACAAAAACCAAAAGA-3, (4) 对于 MLL-AF4(elO/e4)基因： 扩增引物为： 上游引物：5 ' -TCTCCAATGGCAATAGITCTAAGC-3'， 下游引物：5' -GCTCAGCTGTACTAGGCGTATGT-3 '， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5' -TGGACTTCATTGGAGTAG-3'。
2. -种焦磷酸测序法同时检测E2A-PBXUTEL-AML1和MLL-AF4融合基因的试剂盒，所 述的 MLL-AF4 融合基因包括 MLL-AF4 (e9/e5)、MLL-AF4 (e9/e4)和 MLL-AF4 (el0/e4)中的任 意一种或两种，其特征在于，所述试剂盒包含如下引物： (1)对于E2A-PBX1基因， 扩增引物为： 上游引物：5' -GGCCTCCCGACTCCTACA-3'， 下游引物：5' -CTGGGGGTCTGTGGGITC-3 '， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物为： 5，-GCTCCTCGGATACTCAA-3'; (2) 对于TEL-AML1基因： 扩增引物为： 上游引物：5' -CCATGCCCAITGGGAGAATAG-3'， 下游引物：5' -TCGTGGACGTCTCTAGAAGGAITC-3 '， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5' -GATTCATTCCAAGTATGC-3' (3) 对于 MLL-AF4(e9/e5)和 MLL-AF4(e9/e4)基因： 扩增引物为： 上游引物：5' -CCGCCCAAGTATCCCTGTAAAAC-3，， 下游引物： 5，-AAAGGAGGCGGCCATGAA-3,， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5，-AAAACAAAAACCAAAAGA-3, (4) 对于 MLL-AF4(elO/e4)基因： 扩增引物为： 上游引物：5 ' -TCTCCAATGGCAATAGITCTAAGC-3'， 下游引物：5' -GCTCAGCTGTACTAGGCGTATGT-3 '， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5' -TGGACTTCATTGGAGTAG-3'。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括质控品，所述质控品 包括阳性对照品和阴性对照品。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含有E2A-PBX1、 TEL-AML1、MLL-AF4(e9/e5)、MLL-AF4(e9/e4)和 MLL-AF4(elO/e4)的质粒的混合液， 所述的阴性对照品为不含 E2A-PBX1、TEL-AML1、MLL-AF4 (e9/e5)、MLL-AF4 (e9/e4)和 MLL-AF4(elO/e4)的质粒溶液。
5. 权利要求1所述的引物对在制备用于检测E2A-PBX1、TEL-AML1和MLL-AF4融合基 因的试剂上的应用。
6. 权利要求2或权利要求3所述的试剂盒在制备用于检测E2A-PBX1、TEL-AML1和 MLL-AF4融合基因的试剂上的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104328178SQ201410589115
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】邵棠, 李玲, 陈庆, 段彪 申请人:邵棠