用于活化干细胞的方法和装置制造方法

用于活化干细胞的方法和装置制造方法
【专利摘要】本文描述的本发明实施方案包括用于刺激干细胞源中的间充质干细胞分化为能够形成骨的成骨细胞的方法和装置。所述装置和方法包括以有效形成活化干细胞的方式将干细胞源(诸如骨髓抽吸物，脂肪组织和/或纯化的异体干细胞)暴露于活化剂。
【专利说明】用于活化干细胞的方法和装置
[0001] 本申请是中国申请200980153430.4的分案申请，该母案的国际申请日为2009年 10月30日，本分案采用了与该母案一致的发明名称。
[00(间相关申请
[0003] 本专利申请要求享有下列申请的申请日：2008年10月31日提交的美国临时专利 申请系列号61/110, 096,标题为"利用生长因子的体外刺激活化骨髓抽吸物W改善骨形成 的装置值EVICE FOR ACTIVATING BONE MARROW ASPIRATE USING EX VIVO STIMULATION BY GROWTH FACTORS FOR IMPROVED BONE FORMATION)"，和 2009 年 2 月 13 日提交的美国临时 专利申请系列号61/152, 335,标题为"用于形成骨髓抽吸产物的方法和装置（METHOD AND DEVICE FOR FORMING A BO肥MARROW ASPIRATE PR孤UCT)"，其内容在此完整引入作为参 考。

【技术领域】
[0004] 本文描述的发明主题涉及用于活化干细胞的装置和方法，包括使用体外刺激活化 骨髓抽吸物中的干细胞。发明主题还涉及包含该类活化干细胞的植入物。
[0005] 发明背景
[0006] 为了提供最多的骨形成，希望移植已经显示成骨细胞表型的细胞，因为该类细胞 可能显示骨形成活性。但是，骨髓干细胞在体外分化为成骨细胞涉及在成骨培养基中的培 养Qaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64:295-312)，可能导致该类细胞体外增殖的降 低。此外，成骨培养基的使用包括向细胞中添加成分（例如，生长因子），如果该些成分与细 胞一起给患者施用可能具有非故意的副作用。
[0007] 因此，本领域需要从干细胞（例如，人骨髓干细胞）体外产生骨祖细胞，成骨细胞 或成骨细胞表型细胞的简单和可靠的方法，其中可W方便的将将所需细胞与用于产生骨祖 细胞，成骨细胞或成骨细胞表型细胞的因子分离。
[000引发明概述
[0009] 本发明的一个方面是制备用于促进哺乳动物骨生长的植入组合物的方法，包括 (a)将干细胞与一种或更多种活化剂接触24小时或更短时间W制备活化干细胞，化）从活 化干细胞分离活化剂W形成基本上不含活化剂的活化干细胞群，和（C)将基本上不含活化 剂的活化干细胞群与骨移植替代物混合从而制备用于促进哺乳动物骨生长的植入组合物， 其中至少一种活化剂促进干细胞分化为成骨细胞或成骨前体细胞。成骨细胞和/或成骨祖 细胞可W是骨祖细胞，成骨细胞或成骨细胞表型细胞。在一些实施方案中，将干细胞与一种 或更多种活化剂接触5分钟到1小时。在其他实施方案中，将干细胞与一种或更多种活化 剂接触5分钟到0. 5小时。干细胞可W，例如，获得自或分离自骨髓，脂肪组织，肌肉组织， 厮血，胚胎卵黄囊，胎盘，厮带，骨膜，胎儿皮肤，青少年皮肤，或血液。干细胞可W是胚胎干 细胞，出生后干细胞或成人干细胞。在一些实施方案中，干细胞是自体的（autologous),异 体的（allogeneic)或异种的（xenogeneic)。干细胞可W包括间充质干细胞。该类间充质 干细胞可W包括自体骨髓抽吸物。骨髓抽吸物可W在手术中吸出。获得干细胞后，可W将 它们浓缩W去除不必要的液体。可选的，干细胞可W从最初获得它们的组织或液体分离。
[0010] 活化剂可W，例如，调节细胞生长和/或分化，并且可W选自小分子，肤，生 长因子，细胞因子，配体，激素及其组合。活化剂的实例包括活化剂诸如转化生长因 子beta(TGF-目），成纤维细胞生长因子（FGF)，血小板衍生生长因子（PDGF)，骨形态发 生蛋白炬MP)，膜岛素生长因子（IGF),白介素-I(IL-I),白介素-11(比-11)，斯伐他汀 (simvastatsin)，地塞米松，氧留丽，音酒因子（sonic hedgehog)，干扰素，肿瘤坏死因子， 神经生长因子（NGF)，纤连蛋白，RGD肤，整合素，表皮生长因子巧GF)，肝细胞生长因子 (HGF)，角质形成细胞生长因子，成骨蛋白，及其组合。在一些实施方案中，活化剂选自BMP-2 ，TGF-beta3, PSGF-AB, PDGF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8,比-11，斯伐 他汀，地塞米松，氧留丽，音酒因子及其组合。在其他实施方案中，活化剂包括TGF-目和 FG讯，还可W包括PDGF。活化剂可W来自于自体来源。活化剂可用于采用溶液的方法。当 活化剂用于采用溶液的方法时，通过包括过滤，凝胶过滤，切向流动过滤，免疫沉淀，免疫吸 附，柱层析或其组合的方法从活化剂按照步骤化）分离活化干细胞。在其他实施方案中，将 活化剂连接到固相支持物。例如，通过共价粘附，吸附，非共价相互作用和/或其组合，将至 少一些活化剂直接或间接连接到固相支持物。在一些实施方案中，至少一些活化剂通过肤， 抗体，化学交联剂，焼撑链或其组合连接到固相支持物。
[0011] 骨移植替代物可W包括材料诸如巧盐。该类巧盐可W，例如，包括一水合磯酸一 巧，a-磯酸H巧，目-磯酸H巧，碳酸巧，或其组合。骨移植替代物还可W包括脱矿质骨 (demineralized bone)，磯酸轴盐，多聚体或其组合。该类多聚体可W是胶原，明胶，透明质 酸，透明质酸盐，轻丙基纤维素（HPC)，駿甲基纤维素（CMC),轻丙基甲基纤维素（HPMC)，轻 己基纤维素（肥C)，黄原胶（xantham gum),瓜耳豆胶（guar gum),藻酸盐或其组合。在一些 实施方案中，所述方法增加干细胞中碱性磯酸酶和/或骨形态发生蛋白炬M巧受体亚单位 的表达。该类方法还可W包括将植入组合物植入患者。
[0012] 本发明的另一个方面是通过本文所述方法制备的植入组合物。
[0013] 本发明的另一个方面是治疗受试者骨损伤、病症或疾病的方法，包括给受试者的 骨损伤、病症或疾病部位施用本文所述的植入组合物。该类骨损伤、病症或疾病可W是断裂 的骨，骨缺陷，骨移植物化one transplant),骨移植化one graft),骨癌，关节替换（joint replacement),关节修复（joint repair),骨融合，骨小平面修复化one facet repair),骨 退化，牙齿植入，牙齿修复，关节炎，骨重建，或其组合。
[0014] 本发明的另一个方面是用于活化干细胞的装置，包括固相支持物和至少一种促进 干细胞分化为成骨细胞或成骨前体细胞的活化剂，其中所述装置适于：（i)将干细胞与至 少一种活化剂温育，和（ii)在温育步骤（i)后将至少一种活化剂与干细胞分离。例如， 至少一种活化剂选自转化生长因子beta(TGF)，成纤维细胞生长因子（FGF)，血小板衍生 生长因子（PDG巧，骨形态发生蛋白炬MP)，膜岛素生长因子（IG巧，白介素-I(IL-I),白介 素-11 (比-11)，斯伐他汀，地塞米松，氧留丽，音酒因子，干扰素，肿瘤坏死因子，神经生长因 子（NGF)，纤连蛋白，RGD肤，整合素，表皮生长因子巧GF)，肝细胞生长因子（HGF)，角质形成 细胞生长因子，成骨蛋白，及其组合。
[0015] 在一些实施方案中，至少一种活化剂选自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB, PDGF-BB, FG F-2，TGF-betal，BMP-4，BMP-7，BMP-6，FGF-8，IL-ll，斯伐他汀，地塞米松，氧留丽，音酒因 子及其组合。在其他实施方案中，至少一种活化剂包括TGF-目和FG讯，还可包括PDGF。至 少一种活化剂可W，例如，来自于自体来源。活化剂可W位于固相支持物的溶液内或连接到 固相支持物。活化剂可W，例如，通过结合至少一种活化剂的抗体或肤连接到固相支持物。
[0016] 固相支持物可W包括柱基质材料，滤器，培养板，管或平皿，微量滴定板，珠子，盘， 或其组合。固相支持物可W是容器。固相支持物可W包括塑料，纤维素，纤维素衍生物，磁 性颗粒，硝酸纤维素，玻璃，玻璃纤维，胶乳，或其组合。固相支持物还可W包括亲和基质W 去除至少一种活化剂。当滤器存在于固相支持物中时，滤器可W保留细胞和骨移植替代材 料但允许至少一种活化剂穿过。可选的，滤器可W保留至少一种活化剂但允许干细胞穿过。 在一些实施方案中，固相支持物不结合干细胞或不与干细胞不利地相互作用。在其他实施 方案中，固相支持物可W结合干细胞但没有与干细胞不利地相互作用。
[0017] 装置还可W包括用于控制干细胞与至少一种活化剂温育时间的计时器。例如，在 温育步骤（i)后计时器可W触发至少一种活化剂与干细胞的分离。在一些实施方案中，具 有计时器的装置控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为24小时或更短。在其他实施 方案中，具有计时器的装置控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为5分钟到1小时。
[0018] 本发明的另一个方面是用于骨形成的装置，包括用于处理干细胞源的第一部件； 和用于W有效刺激干细胞源中间充质干细胞分化为成骨细胞的方式将干细胞源暴露于活 化剂的第二部件，其中可W将成骨细胞惨入可用于骨修复和/或生成的植入组合物干细胞 源可W是骨髓抽吸物，包括自体骨髓抽吸物在内，脂肪组织和/或纯化的异体干细胞。活化 剂可 W 包括，但不限于BMP-2，TGF-beta3，PSGF-AB，PDGF-BB，FGF-2，TGF-betal，BMP-4，BMP-7，BMP-6，FGF-8，IL-11，斯伐他汀，地塞米松，氧留丽和/或音酒因子。活化剂可W例如通 过接头直接连接到装置的固相支持物或栓系到固相支持物。在一个实施方案中，栓系选自 焼撑链，肤，抗体，化学交联剂，及其组合。
[0019] 在一个实施方案中，活化剂位于溶液中，并且第二部件还包括用于从间充质干细 胞去除活化剂的滤器部件或亲和基质（例如，含有肤或抗体）。
[0020] 一种实施方案包括用于活化骨髓抽吸物的装置。该装置包括用于将骨移植替代物 和从患者抽取的骨髓抽吸物混合W形成混合物的部件。该装置还包括W有效触发间充质干 细胞W增强成骨细胞表型的方式将混合物短暂暴露于固定或栓系的活化剂的部件。
[0021] 另一个实施方案包括用于活化骨髓抽吸物的装置，其包括用于处理从患者抽取的 骨髓抽吸物的部件。该装置还包括W有效触发间充质干细胞W增强成骨细胞表型的方式将 骨髓抽吸物暴露于活化剂的部件。
[0022] 本文还描述了另一活化骨髓抽吸物的装置，包括用于将骨移植替代物和从患者抽 取的骨髓抽吸物混合W形成混合物的部件。该装置还包括W有效触发间充质干细胞W增强 成骨细胞表型的方式将混合物暴露于固定或栓系的活化剂的部件。暴露后，从栓系或固定 的活化剂分离BMA，并将其与骨移植替代物混合。
[0023] 在一个实施方案中，一种方法包括将干细胞源（例如，骨髓抽吸物，包括自体骨髓 抽吸物）暴露于活化剂，其中干细胞中的间充质干细胞被刺激分化为成骨细胞。在一个实 施方案中，骨髓抽吸物在手术中抽取和/或使用从患者抽取的形式。可选的，在从患者抽取 后可将骨髓抽吸物进一步浓缩。该方法还包括将刺激或活化的干细胞（例如，间充质干细 胞）与合成的骨移植替代物混合W形成混合物，其中暴露包括W有效触发间充质干细胞增 强成骨细胞表型的方式将混合物短暂暴露于固定或栓系的活化剂。
[0024] 在一个实施方案中，活化剂与基质键合形成键合基质。在该实施方案中，将干细胞 源与键合活化剂温育一段时间，诸如5分钟到24小时，或5分钟到1小时，或15分钟到1 小时。在一个实施方案中，温育引起骨中骨形态发生蛋白炬M巧受体亚单位的上调。
[00巧]在一个实施方案中，干细胞源暴露于活化剂发生在干细胞溶液中，该方法还包括 从干细胞溶液去除活化剂，诸如利用亲和基质的形成和/或过滤。
[0026] 在另一个实施方案中，提供方法W形成能够刺激骨形成的祖细胞。方法操作包括 将骨髓抽吸物炬MA)与活化剂混合，并使用活化剂W触发间充质干细胞（MSCs)来增强成骨 细胞表型。该类方法可W触发间充质干细胞来增强或发展成骨细胞表型。该方法还包括将 骨移植替代物于从患者抽取的骨髓抽吸物混合W形成混合物；并W有效触发间充质干细胞 增强或发展成骨细胞表型的方式将混合物短暂暴露于固定或栓系的活化剂。
[0027] 在一些实施方案中，所述方法还包括给患者植入刺激的间充质干细胞，包括植入 活化剂W及干细胞源。
[002引更具体地，本发明
[0029] 1. 一种制备用于促进哺乳动物骨生长的植入组合物的方法，包括（a)将干细胞与 一种或更多种活化剂接触24小时或更短时间W制备活化干细胞，化）从活化干细胞分离活 化剂W形成基本上不含活化剂的活化干细胞群，和（C)将基本上不含活化剂的活化干细胞 群与骨移植替代物混合从而制备用于促进哺乳动物骨生长的植入组合物，其中至少一种活 化剂促进干细胞分化为成骨细胞或成骨前体细胞。
[0030] 2.项1的方法，其中将干细胞与一种或更多种活化剂接触5分钟到1小时。
[0031] 3.项1或2的方法，其中将干细胞与一种或更多种活化剂接触5分钟到0. 5小时。
[0032] 4.项1-3中任一项的方法，其中所述干细胞来自于骨髓，脂肪组织，肌肉组织，厮 血，胚胎卵黄囊，胎盘，厮带，骨膜，胎儿皮肤，青少年皮肤，或血液。
[003引 5.项1-4中任意一项的方法，其中所述干细胞是自体的，异体的或异种的。
[0034] 6.项1-5中任意一项的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞，出生后干细胞或成 人干细胞。
[003引7.项1-6中任意一项的方法，其中所述干细胞包括间充质干细胞。
[0036] 8.项1-4中任意一项的方法，其中所述干细胞包括自体骨髓抽吸物。
[0037] 9.项8的方法，其中所述骨髓抽吸物是在手术中抽取的。
[0038] 10.项8的方法，其中分离或浓缩骨髓抽吸物中的细胞。
[0039] 11.项1-10中任意一项的方法，其中所述活化剂可W调节细胞生长和/或分化，并 选自小分子，化生长因子，细胞因子，配体，激素及其组合。
[0040] 12.项1-11中任意一项的方法，其中所述活化剂选自转化生长因子 betaCTGF-目），成纤维细胞生长因子（FGF)，血小板衍生生长因子（PDGF)，骨形态发生蛋 白炬MP)，膜岛素生长因子（IGF),白介素-U比-1)，白介素-Il(IL-Il),斯伐他汀，地塞 米松，氧留丽，音酒因子，干扰素，肿瘤坏死因子，神经生长因子（NGF)，纤连蛋白，RGD 肤，整合素，表皮生长因子巧GF)，肝细胞生长因子（HGF)，角质形成细胞生长因子，成骨 蛋白，及其组合。
[0041] 13.项1-12中任意一项的方法，其中所述活化剂选自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB ，PDGF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11，斯伐他汀，地塞米松，氧 留丽，音酒因子及其组合。
[0042] 14.项1-13中任意一项的方法，其中所述活化剂包括TGF-目和FG讯。
[0043] 15.项14的方法，其中所述活化剂包括PDGF。
[0044] 16.项1-15中任意一项的方法，其中所述活化剂位于溶液中。
[0045] 17.项1-15中任意一项的方法，其中将所述活化剂连接到固相支持物。
[0046] 18.项17的方法，其中通过肤，抗体，化学交联剂或其组合将至少一些活化剂连接 到固相支持物。
[0047] 19.项1-18中任意一项的方法，其中通过包括过滤，凝胶过滤，切向流动过滤，免 疫沉淀，免疫吸附，亲和层析，柱层析或其组合的方法将活化干细胞与活化剂分离。
[0048] 20.项1-19中任意一项的方法，其中所述骨移植替代物包括巧盐。
[0049] 21.项20的方法，其中所述巧盐包括一水合磯酸一巧，a -磯酸H巧，目-磯酸H 巧，碳酸巧，或其组合。
[0050] 22.项20或21的方法，其中所述骨移植替代物还包括脱矿质骨，磯酸轴盐，多聚体 或其组合。
[0051] 23.项22的方法，其中所述多聚体是胶原，明胶，透明质酸，透明质酸盐，轻丙基纤 维素（HPC)，駿甲基纤维素（CMC)，轻丙基甲基纤维素（HPMC)，轻己基纤维素（肥C)，黄原胶， 瓜耳豆胶，藻酸盐或其组合。
[0052] 24.项1-23中任意一项的方法，其中所述方法增加干细胞中碱性磯酸酶和/或骨 形态发生蛋白炬M巧受体亚单位的表达。
[0053] 25.项1-24中任意一项的方法，还包括将植入组合物植入患者。
[0054] 26.通过项1-25中任意一项的方法制备的植入组合物。
[0055] 27. -种治疗受试者骨损伤、病症或疾病的方法，包括给受试者的骨损伤、病症或 疾病部位施用项26的植入组合物。
[005引 28.项27的方法，其中所述骨损伤、病症或疾病包括断裂的骨，骨缺陷，骨移植物， 骨移植，骨癌，关节替换，关节修复，骨融合，骨小平面修复，骨退化，牙齿植入，牙齿修复，关 节炎，骨重建，或其组合。
[0057] 29. -种用于活化干细胞的装置，包括固相支持物和至少一种促进干细胞分化为 成骨细胞或成骨前体细胞的活化剂，其中所述装置适于：（i)将干细胞与所述至少一种活 化剂温育，和（ii)在温育步骤（i)后将所述至少一种活化剂与干细胞分离。
[0058] 30.项29的装置，其中至少一种活化剂选自转化生长因子betaCTGF-目），成纤维 细胞生长因子（FGF)，血小板衍生生长因子（PDGF)，骨形态发生蛋白炬MP)，膜岛素生长因 子（IGF),白介素-U比-1)，白介素-Il(IL-Il),斯伐他汀，地塞米松，氧留丽，音酒因 子，干扰素，肿瘤坏死因子，神经生长因子（NGF)，纤连蛋白，RGD肤，整合素，表皮生长 因子巧GF)，肝细胞生长因子化GF)，角质形成细胞生长因子，成骨蛋白，及其组合。
[0059] 31.项29或30的装置，其中至少一种活化剂选自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB, P DGF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11,斯伐他汀，地塞米松，氧留 丽，音酒因子及其组合。
[0060] 32.项29, 30或31的装置，其中至少一种活化剂包括TGF-目和FG讯。
[0061] 33.项32的装置，其中至少一种活化剂还包括PDGF。
[0062] 34.项29-33中任意一项的装置，其中至少一种活化剂位于溶液中。
[0063] 35.项29-33中任意一项的装置，其中将至少一种活化剂连接到固相支持物。
[0064] 36.项29-35中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括柱基质材料，滤器，培 养板，管或平皿，长颈瓶，微量滴定板，珠子，盘，或其组合。
[0065] 37.项29-36中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括塑料，纤维素，纤维素 衍生物，磁性颗粒，硝酸纤维素，玻璃，玻璃纤维，胶乳，或其组合。
[0066] 38.项29-37中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括亲和基质W去除至少 一种活化剂。
[0067] 39.项29-38中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括，与至少一种活化剂结 合的，链霉亲和素，生物素，交联剂，抗体或肤。
[0068] 40.项29-39中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括容器。
[0069] 41.项29-40中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括滤器。
[0070] 42.项41的装置，其中所述滤器保留细胞和骨移植替代材料但允许至少一种活化 剂穿过。
[0071] 43.项41的装置，其中所述滤器保留至少一种活化剂但允许干细胞穿过。
[0072] 44.项29-43中任意一项的装置，其中所述固相支持物材料不结合干细胞或不会 与干细胞发生不利地相互作用。
[0073] 45.项29-44中任一项的装置，其中所述干细胞来自于骨髓，脂肪组织，肌肉组织， 厮血，胚胎卵黄囊，胎盘，厮带，骨膜，胎儿皮肤，青少年皮肤，或血液。
[0074] 46.项29-45中任意一项的装置，其中所述干细胞包括间充质干细胞。
[00巧]47.项29-46中任意一项的装置，其中所述干细胞包括自体骨髓抽吸物。
[0076] 48.项29-47中任意一项的装置，还包括用于控制干细胞与至少一种活化剂温育 时间的计时器。
[0077] 49.项48的装置，其中在温育步骤（i)后计时器触发至少一种活化剂与干细胞的 分离。
[007引 50.项48的装置，其中计时器控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为24小时 或更短。
[0079] 51.项48的装置，其中计时器控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为5分钟 至Ij 1小时。
[0080] 52.项48的装置，其中计时器控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为5分钟 到0. 5小时。

【专利附图】

【附图说明】
[0081] 图1图示说明本发明实施方案中原代人MSCs表达的碱性磯酸酶水平。在用成纤 维细胞生长因子（下文中称为"FGF-2") (lOOng/ml)或TGF beta3(250ng/ml)处理1小时 后将细胞在分化培养基中培养。然后使用实施例1描述的测定法测量细胞表达的碱性磯酸 酶水平。
[0082] 图2图示说明在将细胞暴露于活化剂24小时后，原代人间充质细胞（下文中称 为"MSCs")中3类骨形态发生蛋白（下文中称为"BMP")受体单位的相对mRNA拷贝数，即 81口3-14广14")，81口1?-18广18")和81口1?-11广11")。使用的活化剂是浓度为1叫/1111，10叫/ ml和l(K)ng/ml的血小板衍生生长因子（下文中称为"PDGF BB")，成纤维细胞生长因子（下 文中称为"FGF b")，和转化生长因子（下文中称为"TGF beta3")，暴露24小时。收集细胞， 并针对实施例1描述的全部3种BMP受体单位（即-1A，-IB和II)进行定量聚合酶链式反 应（下文中称为"PCR")。
[008引 图3图示说明在将原代MSCs暴露于PDGF BB，FGF b和TGF beta3 (使用Ing/ml， lOng/ml和lOOng/ml的浓度）一（1)小时后，3种BMP受体单位（即-1A，-IB和II)的相 对mRNA拷贝数。收集细胞，并针对实施例1描述的全部3种BMP受体单位（即-1A，-IB和 II)进行定量PCR。
[0084] 详细说明
[0085] 在本领域的当前状态，骨髓抽吸物（下文中称为"BMA")在手术中从患者抽取，与 骨移植替代物混合并重新植入手术部位W促进骨治愈。但是，尽管骨髓抽吸物可能包含一 些能够产生成骨细胞的结缔组织祖细胞，但是在实际能够促进骨形成的成骨细胞数目和类 型方面患者与患者之间存在巨大差异。
[0086] 本文描述了改善干细胞（例如，BMA)性能的方法，装置和植入物，通过增加细胞数 目或通过增加BMA或干细胞混合物中祖细胞的成骨潜能。本文描述的实施方案包括方法 和装置，简单来说，手术中在体外将干细胞暴露于一种或更多种外源活化剂，从而产生能够 刺激骨生长的祖细胞，然后从干细胞（即，通过活化剂活化的祖细胞）去除活化剂。活化剂 可W是，例如，小分子，肤，生长因子，细胞因子，配体或其他因子。活化剂可W从自体来源捕 获，获自商品化来源或制备得到（例如，通过重组方法）。
[0087] 在一些实施方案中，活化剂能够增加干细胞混合物的祖细胞中骨形态发生蛋白 (下文中称为BM巧受体亚单位的表达。活化剂的该种处理有助于，例如，在骨损伤或骨手术 部位增强祖细胞对内源性BMPs产生应答的能力。活化剂的该种处理还可W驱使干细胞沿 着成骨细胞途径分化。如本文所述，虽然通过用细胞因子处理较长时段（例如，几天）已经 活化干细胞，但是将干细胞暴露于活化剂所述较长时段不是必需的；在只暴露于活化剂约 15分钟到约3小时后干细胞就可W被活化并显示成骨潜能。
[0088] 此外，一些研究表明存在骨前体细胞体外生长必需的辅助细胞群。因此，即使在存 在成骨细胞因子混合物的条件下，高度纯化的骨前体细胞也可能不能扩增。因此，干细胞的 延长培养不一定是有益的。本文描述的方法和装置不涉及培养细胞的延长时段，它们是更 快的，从而避免了与延长的细胞培养有关的污染和花费的可能。
[0089] 因为本文描述的干细胞具有成骨潜能的增强、活化和/或分化可W通过将活化剂 栓系到装置上或装置内实现，W便干细胞混合物内包含的细胞可W被活化，并方便的与活 化剂分离，例如，通过从装置去除细胞。在细胞移植前从细胞分离活化剂减轻了活化剂本身 不需要的副作用的可能（例如，刺激不想要的应答或诱导有害的免疫应答）。
[0090] 干细胸源
[0091] 本文描述的方法，装置和植入物可W使用来自任何方便来源的干细胞。但是，优选 的是具有成骨潜能或可W被处理（例如，分化）W产生具有成骨潜能的细胞的干细胞。
[0092] 可用于本文所述方法，装置和植入物的干细胞源包括骨髓，脂肪组织，肌肉组织， 体外培养的自体间充质干细胞，异体的制成（off-the-shelf)间充质干细胞，厮血，胚胎卵 黄囊，胎盘，厮带，骨膜，胎儿和青少年皮肤，和血液。在一些实施方案中，干细胞是间充质干 细胞或包括间充质干细胞的细胞混合物（例如，骨髓抽吸物）。干细胞可W是自体，异体或 异种来源。干细胞可W是胚胎来源，出生后来源或成人来源。
[0093] 骨髓抽吸物是可用于本文所述方法，装置和植入物的一种干细胞源。该类骨髓抽 吸物可W是自体，异体或异种来源，在一些实施方案中，骨髓抽吸物是自体的。
[0094] 骨髓抽吸物包含W下细胞的复杂混合物：造血干细胞，红细胞和白细胞及它们的 前体，间充质干细胞和祖细胞，间质细胞及它们的前体，W及形成称为"基质"的结缔组织网 络的包括成纤维细胞，网织红细胞，脂肪细胞，和内皮细胞的一组细胞。基质细胞通过细胞 表面蛋白的直接相互作用和生长因子的分泌从形态上调节造血细胞分化，并涉及骨结构的 建立和支持。研究显示骨髓包含"前间质（pre-stromal)"细胞，其具有分化为软骨，骨和其 他结缔组织细胞的能力。BeresforcTOsteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow", Clin. Orthop. , 240:270, 1989。新近的证据显示该些细胞（称为多能性 间质干细胞或间充质干细胞）在活化时具有产生数种不同类型的细胞系（即，骨细胞，软骨 细胞，脂肪细胞，等）的能力。但是，间充质干细胞经常W极少量与多种其他细胞（即，红细 胞，血小板，中性粒细胞，淋己细胞，单核细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，脂肪细胞，等） 存在于骨髓抽吸物中。此外，它们分化为结缔组织组合的能力不仅取决于抽吸物中生物活 性因子的存在（其可W不同），但是在某种程度上还取决于供体的年龄。本文描述的方法和 装置通过提高干细胞样品中细胞的数目和干细胞分化为成骨细胞的潜能来解决该些问题。
[0095] 在一些实施方案中，干细胞包括间充质干细胞。间充质干细胞可W通过本领域技 术人员能够得到的方法进行鉴定。例如，可W通过集落形成单位测定（C即-巧或利用间充 质干细胞通常表达的标记物通过流式细胞术鉴定间充质干细胞。间充质干细胞通常表达诸 如CD27r，CD105+，CD73+的标记物，但显示CD34-和CD45-表型。
[0096] 当使用骨髓细胞时，该些细胞可W获自骼晴，股骨，腔骨，脊柱，肋骨或其他骨髓空 隙。在一些实施方案中，干细胞来自于自体液体（例如，骨髓抽吸物）。内腔骨髓抽吸物是 间充质干细胞的良好来源。
[0097] 在一些实施方案中，将干细胞用于分离步骤诸如离也，大小过滤，免疫磁性挑选 等，W便筛除"无关"细胞，并提高活化步骤的效率，或预选间充质干细胞W有利于植入材料 中的骨形成。尽管不是必需分离细胞类型和/或纯化间充质干细胞，在一些实施方案中该 是所希望的。
[0098] 当需要分离细胞类型时，可W将例如包括骨髓的生物样品进行离也W将样品成分 基于密度分离为各种组分，包括富含结缔组织生长促进成分的组分诸如间充质干细胞。从 而分离富含结缔组织生长促进成分的组分。此外，被离也的生物样品可W不含细胞培养基 材料。在一些实施方案，被离也的生物样品基本上由来自患者的组织材料（例如骨髓材 料任选的W及血液或其他组织材料）组成，随后将给所述患者植入所获分离和活化的干细 胞。
[0099] 活化剂
[0100] 在本文描述的方法和装置中使用活化剂W促进干细胞形成和/或分化为成骨细 胞。该类活化剂可W是，例如，小分子，肤，生长因子，细胞因子，配体，激素，W及调节生长和 分化的其他分子。活化剂可W从自体来源捕获，获自商品化来源或制备得到（例如，通过重 组方法）。
[0101] 可W使用的活化剂实例包括TGF，FGF，PDGF，BMP, IGF,白介素，比-1，比-11，TGF， NGF，EGF，HGF，斯伐他汀，地塞米松，氧留丽，音酒因子，干扰素，纤连蛋白，"RGD"或整合素肤 和/或蛋白，角质形成细胞生长因子，成骨蛋白，MSX1，NF邸1，RUNX2, SMAD1，SMAD2, SMAD3, S MAD4, S0X9, TNF, TWIST1, VDR, AHSG, AMBN, AMELY, BGLAP, ENAM, MINPP1, STATH, TUFT1, BMPl, C OLl 1A1, S0X9, ALPL AMBN, AMELY, BGLAP, CALCR, CDHl 1，DMPl, DSPP, ENAM, MINPP1, P肥X，RUNX 2, STATH, TFIP11, TUFT1, BGLAP, BMP3, BMP5, BMP6, C0L10A1, C0L12A1, C0L1A1, C0L1A2, C0L2A 1，COMP, FGFR1, GDF10, IGFl, IGF2, MSXl, ANXA5, CALCR, CDHl 1，COMP, DMPl, EGF, MMP2, MMP8, C 0L10A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L3A1, C0L4A3, C0L5A1, EGFR, FGFl, FGF3, IGF1R, TGFB2, VEGFA, VEGFB, C0L4A3, CSF3, FLTl, IGFl, IGF1R, IGF2, PDGFA, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR2, V EGFA, VEGFB, BMPl, CS巧，CSF3, FGFR1, FGFR2, FLTl, GDF10, IGFl, IGF1R, IGF2, PDGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, VEGFA, VEGFB, AHSG,沈RPINH1, CTSK, MMP10, MMP9, P肥X，AMBN ，AMELY, ENAM, STATH, TUFT1, BGN, COMP, DSPP, GDF10, CDHl 1，ICAM1, ITGB1, VCAM1, ITGA1, ITG A2, ITGA3, ITGAM, ITGB1, CD36, COMP, SCARB1, AMH, GDF2 炬MP9)，GDF3(Vgr-2)，GD巧（CDMP-I) ，GDF6, GD巧，IGFBP3, IL6, INHA (抑制素 a)，INHBA (抑制素 BA)，LEFTY 1，LTBP 1，LTBP2, LTB P4, N孤AL, ACVRl(ALK2)，ACVR2 A, ACV化1(ALKl)，AMHR2, BMPRlA(ALK3)，BMPRlB(ALK6)，BMP R2, 口GB5 (整合素 B5)，口GB7 (整合素 B7)，LTBP1, NR0B1, STAT1, TGFBlI 1，TGFBR1, (ALK5) TG FBR2, TGFBR3, TGFBRAP1, CDC25A, CDKNlA(p2 IWAFl/p2 ICIPl), CDKN2B(pl5LNK2B), FOS, GS C (goosecoid)，IGFBP3, ITGB5 (整合素 B5)，ITGB7 (整合素 B7)，JUN, JUNB, MYC, SERPI肥 I (P AI-I)，TGFBIII, TSC22D1 (TGFB1I4)，TGIFl, DLX2, IDl, ID2, JUNB, S0X4, STATl, BAMBI, BMP邸 ，CDKN2B(P15LNK2B)，CERl(Cerberus)，CH畑（chordin)，CST3, ENG巧vi-1)，EVIl, F邸PIB, HI PK2, NBLl 0AN)，NOG, PLAU (uPA)，RUNXl (AMLl)，SMURFl 和调节生长和分化的其他分子，W及 该些因子的组合。
[0102] 在一些实施方案中，活化剂包括转化生长因子beta(TGF-目），成纤维细胞生长因 子（FGF，包括酸性或碱性成纤维细胞生长因子（FB化或FB讯)，和/或成纤维细胞生长因 子-S(FGF-S))，血小板衍生生长因子（PDGF)，骨形态发生蛋白炬MP)家族（诸如BMP-1，B MP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6和/或BMP-7)，膜岛素生长因子（IGF)家族的成员（例 女口，膜岛素样生长因子-I和/或II)，白介素-I(IL-I), IL-11，斯伐他汀，地塞米松，氧 留丽，音酒因子，干扰素，肿瘤坏死因子，神经生长因子（NGF)，纤连蛋白，"RGD"或整合 素序列，表皮生长因子巧GF)，肝细胞生长因子化GF)，角质形成细胞生长因子，成骨蛋白 (Ops ;诸如0P-1，0P-2, 0P-3)，和调节生长和分化的其他分子，W及该些因子的组合。
[0103] 还可W使用与完整蛋白一样引发相同活化应答的肤活化剂。例如，可W使用与 TGF-目，FGFb和/或PDGF具有类似作用的蛋白的氨基酸片段或肤。可W使用来自本文所 述任意活化剂的或已知可用于活化干细胞的肤活化剂。在其他实施方案中，可W使用小分 子活化剂来活化干细胞。
[0104] 在许多实施方案中，在本文描述的方法和装置中包括TGF-目家族作为活化剂。 TGF-目家族包括一组结构相关蛋白，其在胚胎发育期间影响各种各样的分化过程。包 括在TGF目家族中的是基于包括7个半脫氨酸残基的保守性的初级氨基酸序列同源性。 该家族包括，例如，Mullerian抑制物（MIS),其是正常男性发育需要的炬e虹inger，et al.，化Uire, 345:167, 1990)，果禍decapentaplegic (DP巧基因产物，其是成虫盘的背-腹 轴形成和形态发生需要的（Padgett, et al.，化Uire, 325:81-84, 1987)，非洲爪赡Vg-基 因产物，其位于卵的植物极（Weeks，et al.，Cell, 51:861-867, 1987)，活化素（Mason，et al. , Biochem, Biophys. Res. Commun. , 135:957-964, 1986)，其能够诱导非洲爪赡胚胎的中 胚层和前部结构的形成（Thomsen, et al.，Cell, 63:485, 1990)，和骨形态发生蛋白炬MP' S， 诸如BMP-2到BMP-15)，其能够诱导重新的软骨和骨形成（Sampath，et al.，J. Biol. 化em.，265:13198, 1990)。TGF-目基因产物可W影响各种分化过程，包括脂肪形成，肌形成， 软骨形成，造血作用，和上皮细胞分化（综述参见Massague, Cell 49:437, 1987)，其在此完 整引入作为参考。
[0105] TGF-目家族的蛋白最初合成为大的前体蛋白，其随后在C端的大约110-140个氨 基酸的一簇碱性残基处经历蛋白水解切割。蛋白的C端区域都是结构相关的，不同的家族 成员基于它们的同源性程度被划分到不同的亚组。尽管特定亚组的同源性范围是70%到 90 %氨基酸序列同一性，但亚组之间的同源性是显著更低的，通常只有20 %到50 %。每种 情况下，活性物看起来是C端片段的二硫键连接的二聚体。对于已经被研究的大多数家族 成员来说，发现同二聚体物是有生物活性的，而对其他家族成员来说，例如抑制素扣ng，et al.，化化re，321:779，1986)和TGF-目s(Cheifetz，etal.，Cell，48:409，1987)，，还检测到 异二聚体，该些看起来比相应的同二聚体具有不同的生物学特性。
[010引 TGF-目基因超家族的成员包括TGF-目3, TGF-目2, TGF-目4 (鸡），TGF-目1，TGF-目 5 (非洲爪赡），BMP-2, BMP-4,果禍 DPP, BMP-5, BMP-6, Vgrl, 0P-1/BMP-7,果禍 60A, GDF-1, 非洲爪赡Vgt BMP-3,抑制素-目A，抑制素-目B，抑制素-a,和MIS。该些基因描述于 Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791，1998,其在此完整引入作为参考。
[0107] 在一些实施方案中，本文所述装置和方法中使用的TGF-目家族成员是TGF-目3。 。…引 成纤维细胸牛长巧子巧它们的弯体
[0109] 成纤维细胞生长因子（FGF巧包括进化上保守的多肤家族，涉及各种生物 过程包括形态发生，血管生成，和组织重建W及涉及许多疾病的发病机理（综述于 化nitz，Bioessays 22:108, 2000,在此特别完整引入作为参考）。该家族的各种成员在体 外和体内刺激较大范围细胞的增殖，范围从间充质到上皮和神经外胚层来源。FGFs在发育 期间W严格的时间和空间模式表达，在模式形成（patterning)和肢形成中具有重要作用 (Ornitz, Bioessays 22:108,2000)。
[0110] FGF家族的所有成员都具有约120个氨基酸的同源性核也结构域，其中28个氨基 酸残基是高度保守的，6个是相同的。对数种FGFs的结构研究鉴定出12个反平行目链， 每个均邻近包括核也区（在整个家族中都是保守的）的目-环。核也结构域包括主要的 FGFR和肝素结合位点。受体结合区与肝素结合区不同（综述于化nitz and Itoh, Gen. Biol. 2, 3005. 1，2001)。
[0111] 在一些实施方案中，本文描述的装置和方法中使用的FGF家族成员是FGF-2。
[0112] 来自人血小板的血小板衍生生长因子（PDG巧包含两条多肤序列-PDGF-B和 PDGF-A 多肤（Antoniades, H. N. and Hunkapiller, M. , Science220:963-965, 1983)。PDGF-B 由位于染色体7上的基因编码炬etsholtz，C. et al.，化Uire 320:695-699)，PDGF-A由 位于染色体 22 上值alla-Favera, R.，Science218:686-688, 1982)的 sis 癌基因编码 (Doolittle, R. et al.，Science 221:275-277,1983)。sis 基因编码猿肉瘤病毒（SSV) 的转化蛋白，其与PDGF-2多肤密切相关。人细胞C-SiS也编码PDGF-A链（Rao, C. D. et al.，Proc.化tl. Acad. Sci. USA83:2392-2396, 1986)。因为 PDGF 的两条多肤链由位于分离 染色体中的两个不同基因编码，人PDGF可W由二硫键连接的PDGF-B和PDGF-A异二聚体组 成，或由两种同二聚体（PDGF-BB同二聚体和PDGF-AA同二聚体）的混合物组成，或由异二 聚体和两种同二聚体的混合物组成。
[0113] PDGF可W商购获得，或获自人组织或细胞，例如，血小板，通过固相肤合成，或通 过重组DNA技术。培养的感染猿肉瘤病毒（其包含编码PDGF-A链的基因）的哺乳动物细 胞可W合成PDGF-A多肤，并将其加工为二硫键连接的同二聚体（Ro化ins et al.，化化re 305:605-608, 1983)。此外，PDGF-A同二聚体与经激发抗人PDGF的抗血清反应，分泌的 PDGF-A同二聚体的功能特性与血小板来源的PDGF类似。可W利用表达载体将C-Sis/ PDGF-B基因的CDNA克隆导入小鼠细胞，获得重组PDGF-B同二聚体。用于所述表达的C-Sis/ PDGF-B克隆获自培养的正常人内皮细胞（Collins, T.，et al.，化Uire216:748-750, 1985)。
[0114] 尽管许多活化剂已经用于活化成骨干细胞，本发明人产生的数据表明，在一些实 施方案中，TGF-目3, FGF-2和各种形式的PDGF是有用的。在其他实施方案中，用于活化干 细胞的装置和方法包括至少TGF-目3和FGF-2作为活化剂。
[0115] 在一些实施方案中，活化剂能够增加干细胞混合物的祖细胞中骨形态发生蛋白受 体亚单位的表达。利用该类活化剂的该种处理有助于，例如，在骨损伤或骨手术部位增强祖 细胞对内源性骨形态发生蛋白产生应答的能力。活化剂的该种处理还可W驱使干细胞沿着 成骨细胞途径分化。
[0116] 骨形态发生蛋白炬MPs)不仅诱导骨和软骨形成，而且是多功能性细胞因子，对许 多细胞类型具有各种各样的作用化Ogan et al.，Genes Dev. 10:1580-1594(1996) ;Reddi et al.,切 tokine Growth Factor Rev. 8:11-20(1997))。BMPs 是 TGF 目超家族的成员。在 人类中存在15-20种BMPs基因，3种BMP受体，和大量的起BMP枯抗剂作用的BMP相关蛋 白（Yamashita et al. Bone 19:569-574(1996))。BMP 通过 3 种 BMP 受体炬MPR-IA，-IB 和 II)的Smad信号转导途径起作用。当BMP二聚体结合II型受体时，它形成复合体并磯酸化 I型受体，其激活Smad途径。
[0117] 将原代成骨细胞暴露于外源生长因子可W调节该些受体的表达。Si^hatanadgit 等（J. Cell Physiol. 209(3) :912-22(2006))检测了原代成骨细胞的 TGF-betal，FGF-2, PDGF-AB和BMP-2处理，W及该些生长因子对细胞表面的细胞内受体的作用。Yeh等 (J. Cell. Physiol. 190 (3) : 322-31 (2002) J. Cell Wiysiol. 191 (3) : 298-309 (2002))观察 到在暴露于OP-I后，胎儿大鼠颇盖细胞中受体亚单位mRNA的差异调节模式。Xu等佑rowth Factors 24(4) :268-78(2006))检测了 TG讯eta3 对 BMPR-IB 的作用。尽管已经泛泛了解了 涉及BMPs结合它们的相应受体的信号转导途径的因子，它们受体亚单位的调节和表达模 式还没有被完全阐明。此外，研究人员还未意识到，用生长因子处理干细胞（例如，骨髓） 较短时间，然后去除生长因子，可W刺激成骨细胞和/或成骨前体的形成。 阳11引 活化干细胸
[0119] 如本文所述，可W通过短暂暴露于活化剂将干细胞成骨活化。该类活化的干细胞 分化为骨祖细胞，成骨细胞和/或成骨细胞表型细胞。此外，从活化的干细胞去除活化剂产 生不包括生长因子和细胞因子（当移植入受试者时它们可能具有非故意的副作用）的细胞 混合物。因此，不需要在生物活性分子混合物中的数天干细胞培养，该导致等待治疗患者的 进行中的疼痛和不能活动，骨损伤初次修复后用于插入植入物的额外手术，培养细胞的污 染，干细胞群或骨抽吸物中不想要的细胞类型的生长，W及维持培养和照顾受伤患者的额 外时间和花费。
[0120] 相反，可W通过与活化剂温育较短时间将干细胞活化用于移植和骨生长的刺激。 因此，例如，当患者被允许接受骨损伤或疾病的治疗时，可W活化自体或异体的干细胞（例 女口，骨髓抽吸物），当当患者进行手术时，立刻植入活化的干细胞（W及骨移植替代物，如果 所需的话）。
[0121] 本文使用的短语"活化的干细胞"表示干细胞被诱导分化为成骨前体细胞，能够增 殖并随后分化为骨形成细胞。该类骨形成细胞包括成骨细胞和成骨组细胞。骨形成细胞可 W通过它们的骨特异性标记物的表达来识别，诸如碱性磯酸酶，骨巧素，骨桥蛋白和BMP受 体。如本文所示，干细胞的活化可W只进行较短时间，例如，5分钟到24小时的时间段。将 干细胞暴露于活化剂的其他最佳时段是10分钟到2小时，或15分钟到1小时。在一些实 施方案中，将干细胞与一种或更多种活化剂接触5分钟到1小时，或将干细胞与一种或更多 种活化剂接触5分钟到0. 5小时。如本文所述，将骨髓抽吸物暴露于活化剂仅仅1小时就 引起碱性磯酸酶和BMP受体亚单位的表达。
[0122] 因此，本发明的一个方面是制备用于促进哺乳动物骨生长的植入物的方法。该方 法包括将干细胞暴露于一种或更多种活化剂24小时或更短（例如，约5分钟到24小时，或 约10分钟到2小时，或约15分钟到1小时）W形成活化的干细胞，将活化的干细胞与一种 或更多种活化剂分离W形成基本上不含活化剂的活化干细胞群，并将基本上不含活化剂的 活化干细胞群与骨移植替代物混合，从而制备用于促进哺乳动物骨生长的植入物。
[0123] 将干细胞暴露于足W活化干细胞为成骨或成骨前体表型的浓度的一种或多种活 化剂。本领域技术人员可W容易的确定该种浓度是什么样的，例如，通过观察何种浓度导致 碱性磯酸酶和BMP受体亚单位表达的增加或上调。合适活化剂浓度的实例包括使用浓度为 约0. Olng/ml到约1 y g/ml的活化剂。在一些实施方案中，活化剂使用的浓度为约0. Ing/ ml 到约 500ng/ml,或约 Ing/ml 到约 lOOng/ml。
[0124] 如本文所述，干细胞可W来自于任何方便的来源。但是，优选的是具有成骨潜能或 可W被处理（例如，分化）W产生具有成骨潜能的细胞的干细胞。可用于本文所述方法， 装置和植入物的干细胞源包括骨髓，脂肪组织，肌肉组织，厮血，胚胎卵黄囊，胎盘，厮带，骨 膜，胎儿和青少年皮肤，和血液。在一些实施方案中，干细胞是间充质干细胞或包括间充质 干细胞的细胞混合物。干细胞可W是自体，异体或异种来源。干细胞可W是自体，异体或异 种来源。干细胞可W是胚胎来源，出生后来源或成人来源。在一些实施方案中，干细胞是自 体或异体的骨髓抽吸物。
[0125] 通常，不需要将干细胞与非干细胞分离，或从其他细胞类型纯化活化的（成骨的） 干细胞。但是，如果本领域技术人员希望从非干细胞纯化干细胞，或从未活化的干细胞和其 他细胞类型纯化活化的、成骨的干细胞，本领域技术人员可W通过任何方便的鶴方法该么 做。例如，可W离也骨髓W基于密度将抽吸物成分分离为各种组分，从而获得富含间充质干 细胞的组分。还可W使用识别并结合活化的成骨干细胞的细胞表面表达的因子（例如，BMP 受体）的抗体，将细胞进行免疫纯化。
[0126] 如本文所示，本文所述活化干细胞的方法和装置中使用的活化剂可W是能够活化 干细胞成骨潜能的任何活化剂。实例将在本文叙述和说明。
[0127] 当干细胞被活化时，它们开始表达具有成骨祖细胞特征的因子。例如，如本文所 述，碱性磯酸酶（成骨细胞分化的早期标记物，由原代人间充质干细胞表达）的水平增加。 参见，例如，图1，其中与未处理的对照细胞相比，用TGF目3(H角形）或FGF-2(正方形）处 理间充质干细胞仅仅1小时就观察到碱性磯酸酶表达随时间的增加，表明接受处理的细胞 显示更有效的分化应答。
[012引在一些实施方案中，使用本文所述方法和装置的干细胞活化还可W增加BMP受体 亚单位的水平。如本文所述，在暴露于活化剂（Ing/ml, lOng/ml和10化g/ml的PDGF BB, FGF b和TGF beta3)仅仅一（1)小时（图3)或24小时（图2)后，原代间充质干细胞中3种 BMP受体单位（即BMPR-IA，BMPR-IB和BMPR-II)的mRNA拷贝数增加。因此，在植入手术 部位前用活化剂处理干细胞（例如，间充质干细胞）仅仅较短时间就可W增强细胞在植入 后对内源BMP的更有效应答。
[0129] 通过任何方便的方法将活化干细胞与它们已经接触的一种或多种活化剂分离，从 而形成基本上不含活化剂的活化干细胞群。当包含干细胞的组合物（例如，植入组合物）不 显示活化剂的副作用（该将阻止干细胞组合物（或植入组合物）的施用）时，干细胞群是基 本上不含活化剂的。因此，少量的活化剂仍可W存在于活化干细胞群（或植入组合物）中， 只要活化剂的量是，例如，小于lOng/ml，或小于Ing/ml，或小于0. Ing/ml或小于0. Olng/ ml O
[0130] 将细胞与小分子和大分子分离的方法是本领域技术人员可W获得的。例如，通过 将细胞息浮于培养基或盐水并通过离也收集细胞来清洗干细胞。数种该类清洗产生基本上 不含活化剂的活化干细胞群。在另一个实例中，将细胞通过保留活化剂但允许细胞穿过的 柱来将细胞与活化剂分离。该类柱可W具有结合或保留活化剂的基质；例如，所述柱可W是 凝胶过滤柱，亲和纯化柱，或离子交换柱。
[0131] 因此，可W将活化剂引入溶液中的干细胞源（即，骨髓抽吸物）。在指定温育时间 后，通过包括过滤，凝胶过滤，免疫沉淀，免疫吸附，柱层析或其组合的方法将活化干细胞与 活化剂分离。例如，利用固定活化剂并允许活化剂从干细胞去除或分离的抗体或结合蛋白 或肤来去除活化剂。在一些实施方案中，可W通过手术中的过滤法（诸如切向流动过滤，利 用合适的分子量筛截W允许活化剂从溶液的手术中去除）从细胞去除溶液中的活化剂。
[0132] 在另一个实施方案中，将分离的干细胞惨入骨移植替代物，然后暴露于本文描述 的活化剂。可W利用任何方便的方法将从骨髓干细胞/骨移植替代物的复合物中去除活化 齐U，例如，通过数轮骨髓干细胞/骨移植替代物的复合物的沉淀W及去除包含活化剂的液 体上清洗涂液。
[0133] 在一些实施方案中，通过使用本文描述的装置将活化的干细胞与它们已经接触的 一种或更多种活化剂分离。 阳134] 巧于活化干细胸的装晉
[0135] 本发明的另一个方面是活化干细胞例如分化为可W刺激骨生长的细胞（例如，成 骨祖细胞，成骨细胞等等）的装置。该装置在本文所述方法中的使用允许将干细胞，干细胞 混合物和干细胞组合物（例如，植入组合物）与至少一种活化剂温育足W活化干细胞的时 间，然后将活化干细胞与至少一种活化剂分离，W产生基本上不含活化剂的活化干细胞和/ 或活化的干细胞组合物。
[0136] 因此，例如，本发明的一个方面是包括固相支持物和连接到该固相支持物的一种 或更多种活化剂的装置。活化剂可W直接连接到固相支持物（例如，通过吸附或通过共价 键）或活化剂可W间接连接到固相支持物（例如，通过接头，抗体，肤，适体，焼撑链，生物 素-链霉亲和素，等）。
[0137] 固相支持物可W是任何材料，活化剂可与其直接或间接连接，其中所述材料不结 合干细胞或不与干细胞不利地相互作用。因此，固相支持物可W是柱基质材料，滤器，培养 板，管或平皿，微量滴定板（或微量滴定板的孔），珠子（例如，磁珠），盘，W及与干细胞相 容的其他材料。固相支持物可W从各种材料制备，诸如塑料，纤维素，纤维素衍生物，磁性颗 粒，硝酸纤维素，玻璃，玻璃纤维，胶乳，和其他基质材料。如果需要，固相支持物可W用抑制 干细胞结合或降低固相支持物中材料反应性的物质进行包被。
[0138] 可W使用本领域技术人员已知的各种技术（该在专利和科学文献中进行了充分 描述）将活化剂连接到固相支持物。在本发明的背景下，术语"连接的"或"连接"表示非 共价结合，诸如吸附，共价连接（其可W通过活化剂和支持物上功能团之间的直接连接或 可W是通过间接连接）。
[0139] 可W通过将溶于合适缓冲液的活化剂与固相支持物接触合适量的时间来实现一 些固相支持物材料（例如，塑料）上的吸附。接触时间随温度而变，但通常在约1小时到 约1天。通常，例如，将塑料微量滴定板（诸如聚苯己帰或聚氯己帰）的孔与约IOng到约 10 y g(和优选的约10化g到约1 y g)的活化剂量接触足W固定足够量的活化剂。
[0140] 活化剂与固相支持物的共价连接通常通过首先将支持物与双功能试剂反应来实 现，所述双功能试剂将与支持物与活化剂上的功能团（诸如轻基或氨基）两者均发生反 应。例如，利用苯酿或者通过支持物上的酵基与结合伴侣的胺W及活性氨的缩合，活化剂可 W被共价连接到具有合适聚合物涂层的支持物（参见，例如，Pierce Immunotechnology Catalog and Han化ook, 1991, A12-A13)。双功能试剂可W是交联剂，具有双功能团的接头， 肤，焼撑链，适体，或其他双功能分子。
[0141] 活化剂可W通过结合剂诸如抗体非共价连接到固相支持物，其中抗体连接或吸附 到固相支持物并非共价结合活化剂。可选的，活化剂可W通过生物素-链霉亲和素非共价 连接到固相支持物，其中生物素或链霉亲和素连接到固相支持物。当链霉亲和素连接到固 相支持物时，生物素连接到活化剂。连接到活化剂的生物素将结合链霉亲和素，从而将活化 剂固定到固相支持物上。
[0142] 在一个实例中，包括柱基质或过滤材料，活化剂与其共价结合。然后将干细胞（例 女口，骨髓抽吸物）通过该基质一段时间或在该基质中温育一段时间，例如5分钟到24小时 的时间段，最佳时间段是15分钟到1小时。
[0143] 对活化剂的该种暴露已经显示增加BMP受体亚单位和碱性磯酸酶表达。例如，图2 和3说明3种活化剂（PDGF BB，FGF b和TGF-目3)上调BMPR-IB亚单位，并且在特定浓度， BMPR-IA和BMPR-II亚单位相对于背景增加。对该类活化剂的暴露用于活化或触发间充质 干细胞W增强成骨细胞表型。
[0144] 因此活化剂可W是FGF b，TGF-目3和/或PDGF BB。在其他实施方案中，固相支 持物上的活化剂包括BMP多肤。其他活化剂可W同样连接到固相支持物上，例如，本文所列 活化剂的任意一种。活化剂可W来自自体来源，和异体来源，或通过制备得到（例如通过重 组技术）。
[0145] 数种或许多活化剂可W连接到相同固相支持物上。例如，普遍接受的是BMPs在异 二聚体（即BMP-2/BMP-7组合）中比在同二聚体制剂（它们目前是商品化供应的）中更有 效。因此，对于本文描述的装置和方法实施方案来说，活化剂可W连接到固相支持物，随后 在再植入术之前分离。因此，在本文描述的现有设备和方法的使用中，对于使用多种活化剂 的可能性具有增加的灵活性。
[0146] 在一些实施方案中，装置适于将植入组合物暴露于一种或更多种活化剂选定的时 间（例如，24小时或更少，和/或本文描述的其他时间），W便活化植入组合物中的干细胞。 该类装置适于将植入组合物与本文描述的至少一种活化剂温育，然后允许活化剂与植入组 合物的分离。因此，植入材料（例如，骨移植替代物）和植入组合物内的干细胞保留在装置 中，而活化剂被去除。装置的使用产生基本上不含活化剂的植入组合物。
[0147] 该装置因此包括将干细胞和/或骨移植替代物与活化剂分离的工具。例如，该装 置可W包括滤器，其排除较大的材料诸如干细胞和/或骨移植替代物，但允许溶液中的活 化剂穿过过滤材料，从而将干细胞和/或骨移植替代物与活化剂分离。在将植入组合物与 活化剂温育后，将容纳植入组合物和活化剂的温育室引流并用合适的介质（例如，缓冲液， 盐水，缓冲盐水，培养基）清洗。因此，该装置可W产生包含活化干细胞并且基本上不含活 化剂的干细胞组合物（例如，植入组合物）。
[0148] 本文描述的装置还可W包括用于控制干细胞与至少一种活化剂温育时间的计时 器。例如，在温育步骤（i)后计时器可W触发至少一种活化剂与干细胞的分离。因此，例如， 计时器可W起始包含至少一种活化剂的溶液的引流或去除。此外，或可选的，计时器可W起 始溶液的添加W清洗干细胞和/或骨移植替代材料。在一些实施方案中，具有计时器的装 置控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为24小时或更短。在其他实施方案中，具有计 时器的装置控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为5分钟到1小时。
[014引 枯入物
[0150] 在一个实施方案中，将如本文所述制备的活化干细胞（例如，骨髓抽吸物）与合成 骨移植替代物（诸如beta磯酸H巧化eta-TCP)) W形成植入组合物。在一个实例中，在组 织移植处使用活化干细胞（例如，活化的骨髓抽吸物）和合成骨移植替代物的混合物。可 W在通过暴露于活化剂将干细胞活化之前或之后，将干细胞与合成骨移植替代物组合。但 是，在移植前，将干细胞暴露于活化剂或接触活化剂W便植入组合物中的干细胞是活化干 细胞。
[0151] 骨移植替代物可W是固体材料，当在合适条件下将其放置于活性骨中或其附近 时，固体材料可W作为通过骨形成活化干细胞形成新骨的支架。可W使用的骨移植替代物 的实例描述于美国专利号5, 383, 931 ;6, 461，632 ;7, 044, 972 ;7, 494, 950 ;和美国申请公开 号20060008504,其中每篇均在此完整具体引入作为参考。
[0152] 骨移植替代物可W包括含巧盐的成分。例如，骨移植替代物可W包括一水合磯酸 一巧，a-磯酸H巧，碳酸巧，脱矿质骨，磯酸轴盐和，任选的，多聚体。多聚体可W是可吸收 的多聚体。在一些实施方案中，多聚体包括同聚体或共聚纤维，它们具有不超过约15mm的 纤维长度，约50:1到约1000:1的长宽比，或两者（和任选的还包括连续的强化纤维）。
[015引多聚体可W是胶原，明胶，透明质酸，透明质酸盐，轻丙基纤维素她C)，駿甲基纤 维素（CMC)，轻丙基甲基纤维素（HPMC)，轻己基纤维素她C)，黄原胶，瓜耳豆胶，和/或藻酸 丈h ITTT. O
[0154] 可W使用的骨移植替代物的实例包括，但不限于，beta-TCP(例如，Synthes制备 的ChronO巧，胶原，生物玻璃（例如，45S5生物玻璃），Bio化S (基于磯酸巧的骨移植替代 物），P巧gen P-15(结合天然形式的轻磯灰石的合成P-15肤）和AlloGraft (脱矿质骨基 质，基于异源移植的骨移植替代物）。
[0巧5] 通常，将活化干细胞与骨移植替代物温育或混合W形成植入组合物。在一些实施 方案中，植入组合物是浆（putty);在其他实施方案中，植入组合物是足W流过注射器针头 的液体。例如，植入组合物可W具有约0. 3到约0. 0或约0. 41到约0. 55的液体成分与固 体成分的比例。
[0156] 另一个实施方案包括在体外使用活化剂W及干细胞源炬MA)较短时间（即，5分钟 到60分钟）W便刺激干细胞进入成骨细胞途径。在体外温育后，将干细胞和活化剂的组合 一起植入。 。157] 治巧方法
[015引包含活化干细胞和骨移植替代物的植入组合物可用于修复和治疗骨损伤，病症或 疾病。该类骨损伤，病症或疾病的特征在于骨丢失（骨量减少或骨质溶解）或骨破坏或损 伤。该类骨损伤、病症或疾病包括但不限于断裂的骨，骨缺陷，骨移植物，骨移植，骨癌，关节 替换，关节修复，融合，小平面修复，骨退化，牙齿植入和修复，源于疾病的骨缺陷（例如，关 节炎），源于重建手术的骨缺陷，和与骨和骨组织有关的其他疾病。骨缺陷的实例包括但不 限于骨的间隙，变形或不结合的骨折。骨退化的实例包括但不限于骨量减少或骨质疏松症。 在一个实施方案中，骨缺陷源于诛儒症。组合物还可用于关节替换或修复，其中所述关节是 脊椎，膝，臀部，酣骨，指骨，肘，踩，紙骼的关节或其他关节联接/非关节联接的关节。
[0159] 可W通过将组合物压入或惨入骨部位，或注射植入组合物，来施用所述植入组合 物。当通过注射施用时，注射器可W具有约12到约ISgauge的针头，其中使用的最大注射 压力不超过约40磅。在一个实施方案中，所述组合物还包括连续的强化纤维。
[0160] 下列非限制性的实施例进一步说明本发明的一些方面。
[0161] 实施例1 :材料和方法
[0162] 使用下列材料和方法实施本发明的一些方面。 阳16引 细胸的分仆^
[0164] 将传代3次的人间充质干细胞（Lonza，Wa化ersville，MD)按照6X104细胞/35mm 孔的密度种于基础培养基（Stem Cell Technologies, Vancouver,Canada),并在 37°C 温 育2天。将细胞用PBS清洗，并用溶于新鲜基础培养基的l(K)ng/ml生长因子（FGF-2或 TGF目3, R&D Systems, Minneapolis, MN)活化1小时，用PBS清洗，然后在新鲜基础培养基或 成骨分化培养基（Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)中 37°C温育 7-14 天。 阳1巧]连时PCR
[016引 利用 RNeasy Plus Mini Kit 和 QIA S虹edder Mini Spin 柱（Qiagen)从用各种 活化剂处理的细胞中制备总RNA。还从未处理的细胞制备总RNA作为对照。通过化qMan Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)使用随机六聚物和 Oligo dT 产生 cDNA。用于实时的引物和探针组如下：
[0167] huBMPRlA_2 fwd (沈Q ID N0:1) :5'-TAACCAGTATTTGCAACCCACACT-3'.
[016引 huBMPRlA_2 rev (沈Q ID N0:2) :5'-GAGC AAAACC AGCC ATCGAA-3'.
[0169] huBMPRlA_2 探针（SEQ ID N0:3) :5'-CCC CCT GTT GTC ATA GGT CCG TTT TTT GAT-3' （FAM/TAMRA).
[0170] huBMPRlB_l fwd (沈Q ID N0:4) :5'-CCA AAG GTC TTG CGT TGT AAATG-3'.
[017。 huBMPRlB_l rev (沈Q ID N0:5) :5'-CAT CGT GAA ACAATA TCC GTCTGT-3'.
[0172] HuBMPRIB_l 探针（SEQ ID NO :6) : 5'-CCA CCA TTG TCC AGA AGA CTC AGT CAA CAA-3' （F AM/TAMRA).
[0173] huBMPR2_2 fwd (沈Q ID NO: 7) : 5' -TGC CCT GGC TAC CAT GGA-3'
[0174] huBMPR2_2 rev (沈Q ID N0:8) :5'-CGC ACA TAG CCGTTCTTGATT-3'
[01 巧]huBMPR2_2 探针（SEQ ID NO :9) : 5'-TCA GCA CTG CGG CTG CTT COGS'（F AM/ TAMRA)
[0176]在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System中进行样品的多重反 应，利用 beta 2 小球蛋白内源对照（VIC/T AMRA) (Applied Biosystems)。 阳177] 碱巧磯酸酶测定
[0178] 将传代3次的人间充质干细胞（Lonza，Wa化ersville，MD)按照6X104细胞/35mm 孔的密度种于基础培养基（Stem Cell Technologies, Vancouver,Canada),并在 37°C 温 育2天。将细胞用PBS清洗，并用溶于新鲜基础培养基的l(K)ng/ml生长因子（FGF-2或 TGF目3, R&D Systems, Minneapolis, MN)活化1小时，用PBS清洗，然后在新鲜基础培养基或 成骨分化培养基（StemCell Technologies, Vancouver, Canada)中 37°C温育 7-14 天。测定 时，将细胞用PBS清洗两次，收集于100 y l/35mm孔裂解缓冲液，并在液氮中冻融两次。通 过将20 y 1裂解物与20 y 1 lmg/ml/7-硝基苯基磯酸盐温育3分钟并测量405皿产生的发 光来确定碱性磯酸酶活性。根据切如ant (Invitrogen, Carlsbad, CA) DNA定量确定的细胞 浓度将碱性磯酸酶活性归一化。
[0179]
[0180] 对于初步研究，如下将活化剂（例如生长因子）固定到微量滴定孔上。
[0181] 将生物素化的抗生长因子抗体巧00 ng) (R&D Systems, Minneapolis, MN)在包 被链霉亲和素的96孔板的200 y 1 PBS/孔中温育30分钟，用PBS清洗3次，然后与溶于 200 y IPBS的量不断增加的生长因子结合30分钟。用PBS清洗3次后，通过与溶于200 y 1 PBS (含0. 1 % BSA) 1 y g未标记的抗生长因子二抗温育30分钟来检测生长因子的存在。孔 用PBS清洗3次，与溶于200 y 1 PBS (含0. 1 % BSA)的1 y g偶联辣根过氧化物酶的二抗温 育30分钟，再用PBS清洗3次。然后将固定的抗体-生长因子-二抗与200 y 1增强的化 学发光底物温育1分钟。通过测量可见光波长的化学发光发射来定量固定的偶联辣根过氧 化物酶的二抗的量。 阳18引 活巧测定
[0183] 为了在干细胞活化步骤前确定栓系活化剂的生物活性，进行下列测定。对于包括 FGF-2 的研究，将 Swiss A化ino 3T3 细胞（ATCC, Manassas, VA)按照 4X 105/35mm 孔的密 度种于10%血清基础培养基，37C温育1天，用PBS清洗3次，然后在37C 0. 5%血清基础 培养基中同步化1天。将FGF2 (R&D Systems, Minneapolis, MN)和50倍过量的生物素化抗 FGF2抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN)在0. 5%血清基础培养基中复合15分钟。将同 步化细胞用PBS清洗3次，然后用FGF2/生物素化的抗FGF2抗体复合物在37C处理30分 钟。在测定的终点，将细胞用PBS清洗3次，收集到SDS样品缓冲液，并在9(TC加热10分 钟。通过SDS-PAGE分离所获裂解物，转移到PVDF膜，并用抗磯酸E服抗体（Cell Signaling Technology, Beverly, MA)的1:10000稀释物，继之W偶联辣根过氧化物酶的二抗（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)的1:10000稀释物顺序检测。通过暴露于增强的化 学发光底物1分钟，CCD照相机显像和利用ImageJ分析程序进行密度测量定量来确定辣根 过氧化物酶活性。
[0184] 对于TGF目3活性测J定，将MvlLu貂肺细胞（ATCC，Manassas，VA)按 照96孔板4X 1〇3细胞/孔的密度种于基础培养基，并在37 C温育1天。将 TGF目3 (R&D Systems, Minneapolis, MN)和50倍过量的生物素化抗TGF目3抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN)在0. 5%血清基础培养基中复合15分钟。用PBS清洗3次后，将 细胞用TGF目3/生物素化的抗TGF目3抗体复合物在37C处理3天。在测定时，向TGF目3 处理培养基中添加CellTiter-Glo ATP检测试剂（Promega，Madison, WI)，温育5分钟，通过 测量可见光波长的化学发光发射来定量细胞数目。
[0185] 实施例2 :结果
[0186] 原代人间充质干细胞能够沿着成骨细胞系分化。该通过在成骨混合物（包含，但 不限于，地塞米松，抗坏血酸和目-甘油磯酸盐）中培养细胞在体外得到证明。在该种培养 条件下细胞显示成骨细胞分化标记物（其最常见的是早期标记物碱性磯酸酶）的上调。
[0187] 图1显示从第10到12天，未处理的间充质干细胞（圆）中碱性磯酸酶活性的轻微 上调，与预期一致。但是，当间充质干细胞用TGF目3 ( H角形）或FGF-2(正方形）预处理 1小时，然后除去分化培养基中的试剂和培养基，碱性磯酸酶活性的水平显著增加2-3倍。
[0188] 该些数据表明在第0天用TGF目3或FGF-2处理间充质干细胞仅仅1小时就能够 影响成骨细胞分化，该样的话成骨细胞形成的标记物在处理后10+天被上调。
[0189] 间充质干细胞在体外和体内均对骨形态发生蛋白产生应答W诱导成骨细胞表型。 BMPs通过由3个亚单位炬MPR-IA，BMPR-IB和BMPR-II)组成的受体复合物起作用。当用 挑选的活化剂（PDGF-BB，TG讯eta3和FGF-2)处理MSCs 24小时时，BMPR-EB基因的相对拷 贝数相对于未处理的细胞显著增加。但是，图3显示在处理后仅仅1小时观察到类似的应 答。
[0190] 该些数据表明仅仅1小时的手术间隙足W用活化剂处理MSCs,该样的话BMP配体 的受体水平相对未处理的细胞将增加。间充质干细胞上BMP受体增加水平的存在增强了该 些细胞的体内BMP-2成骨应答，从而导致更有效的骨治愈。
[0191] 本文参考或提及的所有专利和出版物显示本发明相关领域技术人员的技术水平， 因此将各种该类参考专利或出版物特别引入按照相同程度进行参考，就像它是分别单独完 整引入作为参考或在本文完整阐述一样。 申请人:保留将来自任何引用的该类专利或出版物 的任意和全部材料和信息实际整合入本说明书的权利。
[0192] 本文描述的具体方法和组合物代表优选的实施方案，只是示例性的，而非旨在限 制本发明的范围。在考虑本说明书后本领域技术人员将清楚其他目的，方面和实施方案，该 也包括在权利要求范围限定的本发明精神之内。本领域技术人员显而易见的是，在不脱离 本发明范围和精神的情况下可W对本文公开的发明进行各种不同的取代和改变。本文说明 性描述的发明可W在没有任何元件或限制（其没有被本文具体公开是重要的）的条件下合 适的实施。本文说明性描述的方法和过程可W按照不同的步骤顺序实施，而且它们无需局 限于本文或权利要求所述的步骤顺序。当在本文和所附权利要求中使用时，单数形式"一个 (a)"、"一个（an)"和"the"包括复数含义，除非上下文明确另外规定。因此，例如，"一种抗 体"的含义包括多种（例如，抗体溶液或一系列抗体制品）该类抗体，等等。在任何情况下 该专利都不能被解释为限于本文具体公开的特定实施例或实施方案或方法。在任何情况下 该专利都不能被解释为受到专利与商标局（Patent and Trademark 0巧Ce)的任何审查员 或任何其他公务员或雇员的任何声明的限制，除非该类声明是具体和无条件的或在 申请人: 的回复文字中明确采用的保留意见。
[0193] 使用的术语和表述被用做说明书的术语而非限制，使用该类术语和表述没有意图 来排除显示和描述的特征的任何等同物或其部分，但是应承认各种改变也可能在要求的本 发明范围内。因此，应理解尽管本发明已经被优选的实施方案和可选的特征具体公开，但是 本领域技术人员可W使用本文公开概念的改变和变化，而且该类改变和变化被认为属于所 附权利要求和本发明声明所限定的本发明范围。
[0194] 本文已经大致和一般性的描述了发明。属于一般性内容内的更小的各个种类和亚 属群组也形成本发明的一部分。该包括从所述种类排除任何主题的限制（proviso)或负限 制的本发明种类描述，不管排除的材料是否在本文具体叙述。
[0195] 其他实施方案在下列权利要求范围内。此外，当按照Markush组描述本发明的特 征或方面时，本领域技术人员应意识到还按照Markush组成员的任何单独成员或亚组来描 述本发明。
【权利要求】
1. 一种用于活化干细胞的装置，包括固相支持物和至少一种促进干细胞分化为成骨细 胞或成骨前体细胞的活化剂，其中所述装置适于：（i)将干细胞与所述至少一种活化剂温 育，和（ii)在温育步骤（i)后将所述至少一种活化剂与干细胞分离。
2. 权利要求1的装置，其中至少一种活化剂选自转化生长因子beta(TGF-P)，成纤维 细胞生长因子（FGF)，血小板衍生生长因子（PDGF)，骨形态发生蛋白（BMP)，胰岛素生长因 子（IGF)，白介素-l(IL-l)，白介素-ll(IL-ll)，斯伐他汀，地塞米松，氧甾酮，音猬因 子，干扰素，肿瘤坏死因子，神经生长因子（NGF)，纤连蛋白，RGD肽，整合素，表皮生长 因子（EGF)，肝细胞生长因子（HGF)，角质形成细胞生长因子，成骨蛋白，及其组合。
3. 权利要求1或2的装置，其中至少一种活化剂选自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB，PD GF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11,斯伐他汀，地塞米松，氧甾 酮，音猬因子及其组合。
4. 权利要求1，2或3的装置，其中至少一种活化剂包括TGF- 0和FGFb。
5. 权利要求4的装置，其中至少一种活化剂还包括TOGF。
6. 权利要求1-5中任意一项的装置，其中至少一种活化剂位于溶液中。
7. 权利要求1-5中任意一项的装置，其中将至少一种活化剂连接到固相支持物。
8. 权利要求1-7中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括柱基质材料，滤器，培养 板，管或平皿，长颈瓶，微量滴定板，珠子，盘，或其组合。
9. 权利要求1-8中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括塑料，纤维素，纤维素衍 生物，磁性颗粒，硝酸纤维素，玻璃，玻璃纤维，胶乳，或其组合。
10. 权利要求1-9中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括亲和基质以去除至少 一种活化剂。
11. 权利要求1-10中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括，与至少一种活化剂 结合的，链霉亲和素，生物素，交联剂，抗体或肽。
12. 权利要求1-11中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括容器。
13. 权利要求1-12中任意一项的装置，其中所述固相支持物包括滤器。
14. 权利要求13的装置，其中所述滤器保留细胞和骨移植替代材料但允许至少一种活 化剂穿过。
15. 权利要求13的装置，其中所述滤器保留至少一种活化剂但允许干细胞穿过。
16. 权利要求1-15中任意一项的装置，其中所述固相支持物材料不结合干细胞或不会 与干细胞发生不利地相互作用。
17. 权利要求1-16中任一项的装置，其中所述干细胞是出生后干细胞或成人干细胞， 其中所述干细胞来自于骨髓，脂肪组织，肌肉组织，脐血，胚胎卵黄囊，胎盘，脐带，骨膜，胎 儿皮肤，青少年皮肤，或血液。
18. 权利要求1-17中任意一项的装置，其中所述干细胞包括间充质干细胞。
19. 权利要求1-18中任意一项的装置，其中所述干细胞包括自体骨髓抽吸物。
20. 权利要求1-19中任意一项的装置，还包括用于控制干细胞与至少一种活化剂温育 时间的计时器。
21. 权利要求20的装置，其中在温育步骤（i)后计时器触发至少一种活化剂与干细胞 的分离。
22. 权利要求20的装置，其中计时器控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为24小 时或更短。
23. 权利要求20的装置，其中计时器控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为5分 钟到1小时。
24. 权利要求20的装置，其中计时器控制干细胞与至少一种活化剂的温育时间为5分 钟到0. 5小时。
25. 权利要求1的装置，其中至少一种活化剂通过共价粘附，吸附，非共价相互作用和/ 或其组合而连接到固相支持物。
26. 权利要求1的装置，其中至少一种活化剂通过接头，抗体，肽，适体，烷撑链，生物 素-链霉亲和素或其组合而连接到固相支持物。
27. 用于骨形成的装置，包括用于处理干细胞源的第一部件；和用于以有效刺激干细 胞源中间充质干细胞分化为成骨细胞的方式将干细胞源暴露于活化剂的第二部件。
28. 权利要求27的装置，其中所述干细胞源是从患者抽取的骨髓抽吸物。
29. 权利要求27的装置，还包括至少一种活化剂。
30. 权利要求28的装置，还包括将骨移植替代物和从患者抽取的骨髓抽吸物混合以形 成混合物的部件。
31. 权利要求27的装置，其中骨髓抽吸物在暴露于至少一种活化剂之后与所述活化剂 分开。
【文档编号】C12N5/077GK104357381SQ201410589910
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2009年10月30日 优先权日:2008年10月31日
【发明者】梅里迪斯.汉斯, 道格.比克特, 埃里奥特.格鲁斯金, 斯蒂芬.豪恩斯比, 梅里萨.布朗 申请人:辛西斯有限责任公司