一种6-o-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备，所述修饰物由SOD分子上的羧基与O-HTCC分子的氨基通过酰胺键结合；一分子O-HTCC分子与1～10分子SOD结合。本发明还涉及该6-O-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法。本发明所述的O-HTCC-SOD修饰物与天然SOD相比，保留了SOD分解超氧阴离子的活性，整合了O-HTCC的良好特性，使其具有稳定性高、半衰期长、免原性低的特性；与TMC相比，O-HTCC修饰SOD的效率更高，因此具有更好的使用效果和应用范围。
【专利说明】-种6-0-季镇化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种6-0季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物及其制备，属于生物 医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 超氧化物歧化酶（SOD)是一类重要的超氧阴离子自由基清除剂，可用于防治过量 超氧阴离子自由基引起的疾病和机体损伤，如福射损伤、缺血再关注损伤、自身免疫性疾病 等。目前超氧化物歧化酶的主要来源为从动植物中提取，存在抗原性、体内半衰期短和稳 定性差等缺点，限制了其应用。对其分子进行化学修饰是克服超氧化物歧化酶上述缺点的 有效方法，常采用的修饰剂有聚己二醇（PEG)、右旋糖巧、低分子肝素、壳聚糖等，修饰后的 SOD免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加。
[0003] 壳聚糖是目前发现的自然界存在的唯一一种阳离子多糖，具有清除自由基，抗炎 等作用，季馈化能改善其水溶性并进一步提高其带正电荷的能力。Liu JF等（参见化urnal of 化Ug targeting, 2009. 17(3):216-224.)采用 1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺 盐酸盐巧DC ?肥1)缩合法使N，N，N- H甲基季馈化壳聚糖（TMC)的自由氨基与SOD分子的 駿基形成醜胺键得修饰产物，研究表明TMC修饰的SOD衍生物具有稳定性高、体内半衰期长 和显著的细胞祀向性等优点，是一种有研究和开发价值的SOD衍生物。
[0004] TMC制备过程中，壳聚糖的2-畑2被甲基化后首先生成2-NH(ag甚至2-N(CH3)2， 然后才能进一步形成2-N(CHs) 3+季馈基团，因此，水溶性良好的TMC中的自由氨基数量极少 (一般<10% )，导致其对SOD的效率较低、结合物活性保持率差，制约了季馈化壳聚糖-超 氧化物歧化酶修饰物的进一步研究和应用。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶 (O-HTCC-SOD)修饰物，并提供该修饰物的制备方法。
[000引术语说明
[0007] 自由氨基：伯胺基团（即一畑2)，亦称一级胺基。
[0008] 6-0-季馈化壳聚糖：壳聚糖的Ce-OH上接枝一个含有季馈盐的基团而得到的衍生 物。本申请中采用2, 3-环氧丙基H甲基氯化馈（GTMAC)接枝到壳聚糖Ce-OH上得到0-(轻 基）丙基-3-H甲基氯化馈壳聚糖（O-HTCC)衍生物，水溶性良好，自由氨基率在70% W上。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] 一种6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，由超氧化物歧化酶（SOD)分子 上的駿基与季馈化壳聚糖（O-HTCC)分子的氨基通过醜胺键结合，结构式如下：
[0011] (S孤）n-CO-NH-0-HTCC ;
[0012] 式中，n = 1?10 ;S0D的分子量为32000Da ;〇-HTCC的分子量为2000Da W上，自 由氨基摩尔含量为不小于20%。
[0013] 优选的，所述n = I?6,即一分子O-HTCC与I?6分子SOD共价结合形成修饰 物；O-HTCC的分子量为5000化?lOOOOODa，自由氨基摩尔含量为不小于50%。
[0014] 一种6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，包括如下步骤：
[0015] (1)将超氧化物歧化酶溶于IOmM pH 6. 0的PBS缓冲液，制得超氧化物歧化酶溶 液，加入碳二亚胺巧DC)和N-轻基玻巧醜亚胺（N服），使超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔 比为1 : (1?200)，超氧化物歧化酶与N-轻基玻巧醜亚胺的摩尔比为1;(1?100)，反应 20?40min，制得反应液A ;
[0016] (2)取6-0-季馈化壳聚糖（O-HTCC)溶于IOmM pH 6. 0的PBS缓冲液，制得季馈化 壳聚糖溶液，然后加入步骤（1)制得的反应液A，使超氧化物歧化酶与6-0-季馈化壳聚糖的 质量比为1 ; (0. 1?50)，反应5?化，经分离纯化，制得6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧 化酶修饰物。
[0017] 根据本发明优选的，所述步骤（1)中的超氧化物歧化酶溶液中超氧化物歧化酶的 浓度为0. 5?5mg/ml ;超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1 : (50?150)，超氧化物 歧化酶与N-轻基玻巧醜亚胺的摩尔比为1 ; (10?50)。
[001引根据本发明优选的，所述步骤（1)中，反应条件为室温条件下100?6(K)r/min揽 拌反应25?35min ;所述步骤（2)中，反应条件为室温条件下100?60化/min揽拌反应 5?化。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的6-0-季馈化壳聚糖可按照现有技术制备， 如参见"Journal of applied polymer science, 2007, 105(2) :552-561";也可W按照如下 方法制备：
[0020] @取33壳聚糖溶于1001111质量浓度为10%的醋酸水溶液中，401：揽拌30111111，充 分溶胀，加入苯甲酵15. 8g，继续揽拌反应比，制得乳白色反应液，于6(TC真空干燥12h，调 节抑至中性，过滤，收集沉淀，用甲醇洗涂，烘干，制得反应物A ;
[0021] ②将步骤①制得的反应物A研磨后，置于圆底烧瓶中，加入50ml异丙醇，揽拌 SOmin后，逐滴加入9g 2,3-环氧丙基H甲基氯化馈佑TMAC)，7(rC水浴回流揽拌16h，反应 液过滤，得到的固体用甲醇洗涂，真空干燥，制得反应物B ;
[0022] ③将步骤②制得的反应物B研磨后，置于圆底烧瓶中，加50ml 0. 25mol/L的盐酸 己醇溶液，室温下揽拌反应2化，蒸发去除大部分溶剂，再加入15ml水，溶解后，加入过量丙 丽，沉淀过夜，经离也，收集沉淀，干燥，制得O-HTCC粗品，然后溶于水中，采用滤膜截留分 子量为IOkD超滤仪超滤去除小分子杂质，超滤截留液经冷冻干燥，制得0-HTCC。
[002引根据本发明进一步优选的，所述步骤①中，抑调节剂为质量浓度为10 %的化OH溶 液，所述步骤③中，超滤仪为Millipore L油scale超滤仪。
[0024] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的6-0季馈化壳聚糖溶液中季馈化壳聚糖的 浓度为1?5mg/ml。
[00巧]根据本发明优选的，所述步骤（2)中的超氧化物歧化酶与6-0季馈化壳聚糖质量 比为 1 ; (0. 5 ?10)。
[0026] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的分离纯化为采用DEAE弱阴离子交换柱层析 纯化。
[0027] -种6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，步骤如下：
[0028] (I)将超氧化物歧化酶（SOD) 50mg溶于50ml浓度为lOmM、pH 6. 0的PBS缓冲液 中，制得超氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1. Omg/ml (0. 03125 y mol/ml);再 加入50mg EDC和IOmg N服，温室下震荡反应30min，制得反应液A;
[0029] (2)称取6-0-季馈化壳聚糖（O-HTCC) 50mg溶于25ml浓度为10mM、pH 6. 0的PBS 缓冲液中，制得6-0-季馈化壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2. Omg/ml，然后加入步骤（1)制 得的反应液A，震荡反应化，经2. 6 X 40cm的DEAE Se地arose Fast Flow树脂进行分离纯 化，用抑8. 0、浓度lOmmol/L?lOOmmol/L磯酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速1. 5ml/min, 检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
[0030] W上制备方法中没有特别说明的均按照现有技术。
[0031] 有益效果
[0032] 1、本发明所述的6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物（O-HTCC-SOD)与天 然SOD相比，保留了 SOD分解超氧阴离子的活性，整合了 O-HTCC的良好特性，使其具有稳定 性高、半衰期长、免原性低的特性，具有更好的使用效果和应用范围。与TMC相比，O-HTCC对 SOD的修饰率更高，修饰产物活性保持率更高。
[0033] 2、本发明所述的制备方法较传统修饰方法，可W提高O-HTCC对SOD的修饰率，制 得的产物活性保持率更高，且工艺简单，便于工业化生产应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1是实施例2制得的6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的SDS-PAGE 电泳鉴定结果；
[003引其中，泳道1、蛋白质Marker ;泳道2、天然SOD ;泳道3、O-HTCC ;泳道4、DEAE洗脱 峰1 ;5、DEAE洗脱峰2。
[0036] 图2是O-HTCC-SOD修饰物与天然SOD的园二色谱对比图；
[0037] 横坐标为波长，单位nm ;纵坐标为圆二色谱，单位mdeg。
【具体实施方式】
[0038] 为了更好地说明本发明的内容，下面将描述本发明的几个实施例，但该些实施例 绝不是对本发明的任何限制。
[00測原料来源
[0040] 壳聚糖，普通市售产品，粘均分子量IOk?IOOkDa ;
[0041] 超氧化物歧化酶，普通市售产品。
[0042] 实施例1
[0043] 6-0-季馈化壳聚糖（O-HTCC)的制备，步骤如下：
[0044] @取3肖壳聚糖溶于1001111质量浓度为10%的醋酸水溶液中，401：揽拌30111111，充 分溶胀，加入苯甲酵15. 8g，继续揽拌反应比，制得乳白色反应液，于6(TC真空干燥12h，用 质量浓度为10%的化OH溶液调节抑至中性，过滤，收集沉淀，用甲醇洗涂3次，烘干，制得 反应物A ;
[0045] ②将步骤①制得的反应物A研磨后，置于圆底烧瓶中，加入50ml异丙醇，揽拌 SOmin后，逐滴加入9g 2,3-环氧丙基H甲基氯化馈佑TMAC)，7(rC水浴回流揽拌16h，反应 液过滤，得到的固体用甲醇洗涂，真空干燥，制得反应物B ;
[0046] ③将步骤②制得的反应物B研磨后，置于圆底烧瓶中，加50ml 0. 25mol/L的盐酸 己醇溶液，室温下揽拌反应2化，蒸发去除大部分溶剂，再加入15ml水，溶解后，加入过量丙 丽，沉淀过夜，经离也，收集沉淀，干燥，制得O-HTCC粗品，然后溶于水中，采用滤膜截留分 子量为IOkD的Millipore L油scale超滤仪超滤去除小分子杂质，超滤截留液经冷冻干燥， 制得 O-HTCC。
[0047] 经检测，自由氨基含量为73. 4%
[004引 实施例2
[0049] 一种6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下：
[0050] (1)将超氧化物歧化酶（SOD)溶于50ml浓度10mM、pH 6. 0的PBS缓冲液中，制得超 氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1. Omg/ml (0. 03125 y mol/ml);再加入50mg EDC和IOmg N服，温室下震荡反应30min，制得反应液A ;
[0051] (2)称取实施例1制得的季馈化壳聚糖（O-HTCC) IOOmg溶于50ml浓度为lOmM、 P册.0的PBS缓冲液中，制得壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2. Omg/ml，然后加入步骤（1)制 得的反应液A，震荡反应化，经2. 6 X 40cm的DEAE Se地arose Fast Flow树脂进行分离纯 化，用抑8. 0、浓度lOmmol/L?lOOmmol/L磯酸盐缓冲液（pH 8. 0)进行梯度洗脱，流速 1. 5ml/min，检测波长254皿，收集各洗脱组分，制得6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修 饰物。
[0052] 米用SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图1所不;，结果表明绝大部分SOD均通 过-CO-NH-被O-HTCC修饰，SOD分子的修饰率约90%，结构式如下：
[0053] (S孤）n-CO-NH-0-HTCC ;
[0054] 式中，n = 1?10 ;S0D的分子量为32000Da ;〇-HTCC的分子量为2000Da W上。
[00对 实施例3
[0056] -种6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下：
[0057] (1)将超氧化物歧化酶（SOD)溶于50ml浓度10mM、pH 6. 0的PBS缓冲液中，串幌超 氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1. Omg/ml (0. 03125 y mol/ml);再加入30mg EDC和IOmg N服，温室下震荡反应30min，制得反应液A ;
[0058] (2)称取实施例1制得的季馈化壳聚糖（O-HTCC) 50mg溶于25ml浓度为lOmM、抑 6. 0的PBS缓冲液中，串幌壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2. Omg/ml，然后加入步骤（1)制得 的反应液A，震荡反应化，经2. 6 X 40cm的DEAE Se地arose Fast Flow树脂进行分离纯化， 用抑8. 0、浓度lOmmol/L?lOOmmol/L磯酸盐缓冲液（pH 8. 0)进行梯度洗脱，流速1. 5ml/ min,检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
[0059] 采用SDS-PAGE电泳鉴定，表明绝大部分SOD均通过醜胺键被O-HTCC修饰，SOD分 子的修饰率大于90%。
[0060] 实施例4
[0061] 一种6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，制备步骤如下：
[006引 （1)将超氧化物歧化酶（SOD)溶于50ml浓度10mM、pH 6. 0的PBS缓冲液中，串幌超 氧化物歧化酶溶液，超氧化物歧化酶的浓度为1. Omg/ml (0. 03125 y mol/ml);再加入IOmg EDC和IOmg N服，温室下震荡反应30min，制得反应液A ;
[0063] (2)称取实施例I制得的季馈化壳聚糖（O-HTCC) 30mg溶于15ml浓度为lOmM、抑 6. O的PBS缓冲液中，串幌壳聚糖溶液，O-HTCC的浓度为2. Omg/ml，然后加入步骤（1)制得 的反应液A，震荡反应化，经2. 6 X 40cm的DEAE Se地arose Fast Flow树脂进行分离纯化， 用P服.0、浓度lOmmol/L?lOOmmol/L磯酸盐缓冲液（pH 8. 0)进行梯度洗脱，流速1. 5ml/ min,检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-0-季馈化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
[0064] 采用SDS-PAGE电泳鉴定，表明绝大部分SOD均通过醜胺键被O-HTCC修饰，SOD分 子的修饰率大于70%。
[00财对比例
[0066] 采用现有的EDC缩合法制备N，N，N-H甲基季馈化壳聚糖（TMC)-超氧化物歧化酶 修饰物。
[0067] 称取自由氨基率为32. 2%的TMC 200mg、SOD 40mg，分别溶于抑7. 4的0. Imol/L 的化2册〇4-化&?〇4缓冲液IOml中，将TMC溶液缓慢加入到SOD溶液中，在25°C缓慢揽拌， 于30min分别加入邸C ?肥1 48mg，4°C暗处反应过夜，4°C透析，DEAE Se地arose FF纯化。
[0068] 电泳鉴定表明SOD分子的修饰率仅为30%。
[0069] 试验例
[0070] O-HTCC-SOD修饰物与天然SOD性能比较
[0071] 活性测定采用国际通用的"连苯H酷自氧化法，实验过程如下：
[0072] 向多个试管中加入抑8. 2、50mmol/L Tris-HCl缓冲液，并在25°C水浴20min，然后 分别向各试管中加入25C的50mmol/L的连苯H酷，在对照管加入等量lOmmol/L的肥1。混 匀后，迅速进行紫外分光光度检测，在反应前4min，每隔30s读一次Assenm数值，调整连苯H 酷加入量将其自氧化速度控制为0. 〇7A/min左右。
[0073] 样品酶活测定时，先在各盛有缓冲液的试管内加入预热至25C的样品溶液，然后 按上述方法操作。通过调整样品加入量将连苯H酷自氧化速度控制在30%?70%之间，将 最终测得的数据代入下列公式计算酶活性：
[0074]
【权利要求】
1. 一种6-0-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，由超氧化物歧化酶分子上的羧基 与季铵化壳聚糖分子的氨基通过酰胺键结合，结构式如下： (SOD)n-C〇-NH-〇-HTCC ； 式中，n = 1?10 ;S0D的分子量为32000Da ;〇-HTCC的分子量为2000Da以上，自由氨 基摩尔含量为不小于20%。
2. 如权利要求1所述的6-0-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物，其特征在于，所 述n = 1?6 ;〇-HTCC的分子量为5000Da?lOOOOODa，自由氨基摩尔含量为不小于50%。
3. -种6-0-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤： (1) 将超氧化物歧化酶溶于10mM pH 6. 0的PBS缓冲液，制得超氧化物歧化酶溶液， 加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，使超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为1 : (1? 200)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1 : (1?100)，反应20?40min，制 得反应液A ; (2) 取6-0-季铵化壳聚糖溶于10mM pH 6. 0的PBS缓冲液，制得季铵化壳聚糖溶液， 然后加入步骤（1)制得的反应液A，使超氧化物歧化酶与6-0-季铵化壳聚糖的质量比为1 : (0. 1?50)，反应5?7h，经分离纯化，制得6-0-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中的超氧化物歧化酶 溶液中超氧化物歧化酶的浓度为〇. 5?5mg/ml ;超氧化物歧化酶与碳二亚胺的摩尔比为 1 : (50?150)，超氧化物歧化酶与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1 : (10?50)。
5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)中，反应条件为室温条件 下100?600r/min搅拌反应25?35min ;所述步骤⑵中，反应条件为室温条件下100? 600r/min搅拌反应5?7h。
6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的6-0-季铵化壳聚糖 的制备方法如下： ① 取3g壳聚糖溶于100ml质量浓度为10%的醋酸水溶液中，40°C搅拌30min，充分溶 胀，加入苯甲醛15.8g，继续搅拌反应lh，制得乳白色反应液，于60°C真空干燥12h，调节pH 至中性，过滤，收集沉淀，用甲醇洗涤，烘干，制得反应物A ; ② 将步骤①制得的反应物A研磨后，置于圆底烧瓶中，加入50ml异丙醇，搅拌30min 后，逐滴加入9g 2, 3-环氧丙基三甲基氯化铵，70°C水浴回流搅拌16h，反应液过滤，得到的 固体用甲醇洗涤，真空干燥，制得反应物B ; ③ 将步骤②制得的反应物B研磨后，置于圆底烧瓶中，加50ml 0. 25mol/L的盐酸乙醇 溶液，室温下搅拌反应24h，蒸发去除大部分溶剂，再加入15ml水，溶解后，加入过量丙酮， 沉淀过夜，经离心，收集沉淀，干燥，制得0-HTCC粗品，然后溶于水中，采用滤膜截留分子量 为10kD超滤仪超滤去除小分子杂质，超滤截留液经冷冻干燥，制得0-HTCC。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤①中，pH调节剂为质量浓度为 10%的NaOH溶液；所述步骤③中，超滤仪为Millipore Labscale超滤仪。
8. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的6-0季铵化壳聚糖溶 液中季铵化壳聚糖的浓度为1?5mg/ml ;优选的，所述步骤（2)中的超氧化物歧化酶与6-0 季铵化壳聚糖质量比为1 : (〇. 5?10)。
9. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中的分离纯化为采用 DEAE弱阴离子交换柱层析纯化。
10. -种6-0-季铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物的制备方法，其特征在于，步骤如 下： (1) 将超氧化物歧化酶50mg溶于50ml浓度为10mM、pH 6. 0的PBS缓冲液中，制得超 氧化物歧化酶溶液；再加入50mg EDC和10mg NHS，温室下震荡反应30min，制得反应液A ; (2) 称取6-0-季铵化壳聚糖50mg溶于25ml浓度为10mM、pH 6. 0的PBS缓冲液中，制得 6-0-季铵化壳聚糖溶液，然后加入步骤（1)制得的反应液A，震荡反应6h，经2.6 X 40cm的 DEAE Sepharose Fast Flow 树脂进行分离纯化，用 pH 8.0、浓度 10mmol/L ?100mmol/L 憐 酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速1. 5ml/min，检测波长254nm，收集各洗脱组分，制得6-0-季 铵化壳聚糖-超氧化物歧化酶修饰物。
【文档编号】C12N9/96GK104357433SQ201410610157
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】刘纯慧, 许玲华, 王凤山, 宋春霞, 曹吉超 申请人:山东大学