生产酶产品的方法

生产酶产品的方法
【专利摘要】本发明涉及生产酶产品的方法,通过发酵曲霉属菌株而获得的具有多种酶活性的酶产品的生产方法。本发明的酶产品包含至少下列酶活性：i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性；ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性；iii.果胶酯酶活性；iv.果胶裂解酶活性；v.纤维素酶活性；vi.木聚糖酶活性和vii.阿拉伯聚糖酶活性。CBS12348820080930
【专利说明】生产酶产品的方法
[0001] 本申请是申请号为200980155410. 0、申请日为2009年12月21日、发明名称为"生 产酶产品的方法"的中国发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及通过用曲霉属深层发酵而生产具有多种酶活性的酶产品的方法。
[0003] 发明背景
[0004] 酶被广泛用于食品和饲料工业中，例如在水果和蔬菜加工工业中。
[0005] 近年来，利用酶加工水果（包括浆果）醪液（Mash)已经变成果汁（例如，柑橘，苹 果和梨）生产中的最新水平，因为最高的可能产量和通量已经成为了首要的。果胶（在所 有水果中发现的天然物质），作为细胞胶起作用而给予水果结构。在水果醪液中，果胶结合 水以增加粘性，并使得通过压榨机或倾析器（decanter)在液体/固体分离中释放果汁变得 困难。酶的使用允许生产者根据需求控制生产。
[0006] 在柑橘水果加工中，酶的应用降低了果汁的粘性，消除了果汁浓缩和储存过程中 胶凝化的风险，确保了高的混浊稳定性。在果肉提取过程中应用时，酶促进了果汁和固体的 释放，提高了产量，并改善了成本效率。稳定的混浊（或者，在柠檬汁的情况中，成功的澄 清）是终产品质量上乘的重要评测标准。在柑橘水果加工过程中利用酶时也可以回收柑橘 属精油。除了提供有价值的商品外，柑橘属精油的回收从可持续性的角度来看是重要的， 其确保了废水中杀菌油的低含量，用于改善的废水生物可降解能力，并减少了整体上的水 消耗。酶也被用于高澄清度的苹果和梨汁的生产，其依赖于淀粉和果胶内容物的完全分解。 这是通过在澄清和过滤之前向果汁中加入果胶酶和降解淀粉的酶实现的。通过在压榨和果 汁分离之前加入到水果醪液中，果胶酶引起醪液粘性的降低，导致增加的果汁产量和优化 的加工能力。更少的废果渣和水果压榨机更容易清洁是另外的有附加值的优点。另外，在 葡萄酒生产中，酶被用于将有价值的成分如芳香、颜色和单宁从葡萄转移到葡萄酒中。酶还 可帮助保持葡萄酒的质量，有时保存许多年。它们也减少发酵时间并促进澄清，过滤和稳定 化。
[0007] 如上面所提到的，在果汁生产过程中，酶制备物通常被用于水果的提取和液化以 及果汁澄清的步骤中。商业的酶制备物含有主要是果胶酶（例如，多聚半乳糖醛酸酶，果胶 酯酶，果胶裂解酶）以及少量其它水解酶（如阿拉伯聚糖酶（arabinanases)、半乳聚糖酶和 木聚糖酶）的混合物。各种果胶酶的底物是果胶，它们是由α-1，4_糖苷键D-半乳糖醛酸 聚合物组成的高分子量（20-100kDa)的多聚半乳糖醛酸。一些糖醛酸基团用甲醇酯化了。 多聚半乳糖醛酸主链被所谓的须状区（hairy region)中断了，所述须状区由鼠李糖-半乳 糖醛酸主链与富含阿拉伯糖的侧链组成。
[0008] 果胶降解酶（如多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，果胶裂解酶或果胶酸裂解酶） 是重要的，特别是在水果和蔬菜加工中（例如果汁加工或葡萄酒制造中），其中利用了它们 催化果胶聚合物的主链降解的能力。
[0009] 在自然中，果胶是作为高等植物细胞壁的组分存在的。它们在初生胞壁和胞间薄 层中被发现，在那里它们被包埋在纤维素原纤维中。果胶的组成和甲基化程度在植物种类 之间是可变的，并且还依赖于水果的年龄和成熟度。果胶最丰富的来源包括柠檬和桔子皮， 其可含有高达30%的此种多糖。果胶酶可以通过水解α-1，4-糖苷键（多聚半乳糖醛酸内 切酶和多聚半乳糖醛酸外切酶）或通过反式消除反应（果胶裂解酶）降解碳水化合物聚合 物。果胶酯酶可以将高度酯化的果胶去甲基化成为多聚半乳糖醛酸。果胶裂解酶是特异于 高度酯化的果胶的，多聚半乳糖醛酸酶水解低度酯化的果胶。因此，高度酯化的果胶可以由 果胶裂解酶或果胶酯化酶与多聚半乳糖醛酸酶的组合来降解。
[0010] 在水果和蔬菜加工的各种阶段中，果胶酶起了重要作用。最初，果胶酶被用于处理 软的水果，以确保压榨时果汁和色素的高产量，以及澄清粗压榨果汁。多聚半乳糖醛酸酶被 用作浸解（macerat ing)酶用于生产果肉蜜，所述果肉蜜是松散的细胞悬浮液，其是有限 的果胶降解的结果（特别是在胞间薄层中）。需要数种果胶酶以及纤维素分解酶的组合以 几乎完全地液化水果组织，从而促进提取。苹果汁的澄清可以例如通过果胶酯酶与多聚半 乳糖醛酸酶的组合活性或通过果胶裂解酶（对其而言高度酯化的苹果果胶是理想的底物） 而被改善。
[0011] 在商业制备物中存在的大多数果胶酶是真菌起源的。黑曲霉（Aspergillus niger)对于工业生产果胶降解酶是非常重要的生物体。在黑曲霉中，各种果胶酶不是组成 性地表达的。需要果胶或果胶分子的降解产物作为诱导物质。果胶酶生产的发酵条件常常 产生广泛的果胶酶。此外，黑曲霉产生所述各种果胶酶的许多同功酶。数个已公布的专利描 述了编码多聚半乳糖醛酸酶（EP 421 919, EP 0 388 593)，果胶裂解酶（EP 0 278 355, EP 0 353 188)和果胶酯酶（EP 0388 593)的基因已被分离，并且被用于构建超量生产的转化 体。这些转化体允许生产在例如浸渍应用中、和在对各种果胶酶在例如液化和澄清的过程 中的影响的研究中所需的特异性的酶。
[0012] 也曾描述了来自液化处理后所获得的苹果汁的细胞壁多糖的分离和表征，在所 述液化处理中，通过果胶溶解酶和纤维分解酶的联合作用而从苹果果肉释放果汁。这些 细胞壁多糖类似于苹果果胶的须状区（具有富含阿拉伯糖的侧链的鼠李糖-半乳糖醛酸 主链），并且被称为经修饰的须状区（MHR)。须状区已知不仅存在于苹果中，也存在于胡萝 卜、葡萄和草莓中，并且可能是果胶分子共有的部分。经修饰的须状区对于由存在于大多 数纯的和工业的果胶酶和纤维素酶制备物中的酶引起的降解有抵抗性。已发现从棘孢曲 霉（Aspergillus aculeatus)获得的商业粗制酶制备物能够使这些片段的鼠李半乳糖醒 酸聚糖主链解聚。通过利用高效凝胶渗透色谱（HPGPC)测量分子量分布中的迁移而使得 此活性可见。负责降解从苹果汁制备的经修饰的须状区的酶被称为鼠李糖半乳糖醛酸酶 (rhamnogalacturonase) (RGase)。该酶可分裂（苹果）果胶的鼠李糖半乳糖醒酸聚糖主链 中的糖苷键，从而除了其它还没有被完全鉴别出的反应产物外，还产生了由半乳糖醛酸、鼠 李糖和半乳糖构成的一系列寡聚物，其中以鼠李糖在非还原末端，因此将此新酶命名为鼠 李糖半乳糖醒酸酶（RG-ase)。
[0013] US 5,591，620描述了编码鼠李糖半乳糖醛酸酶（RG-ase)的曲霉基因的分离和过 量表达RG-ase的重组曲霉菌株的构建。这些菌株可被用于商业生产RG-ase。
[0014] EP1658359描述了包含由橄榄或橄榄组分组成的物质和含有至少一种果胶酯酶、 至少一种多聚半乳糖醛酸内切酶和至少一种多聚半乳糖醛酸外切酶的酶混合物的制备物。 在所述制备物中，果胶酯酶活性与多聚半乳糖醛酸内切酶活性的比例至少为0. 13,并且果 胶酯酶活性与多聚半乳糖醛酸外切酶活性的比例至少为〇. 3。
[0015] WO 2008/117301涉及通过发酵生产多酶体系的方法。W02008/117301也描述了在 优化条件下利用米曲霉（Aspergillus oryzae)MTCC 5154,用于通过深层发酵而生产多酶 体系。所描述的产品是不同的酶（例如α-淀粉酶，淀粉葡糖苷酶，羧甲基纤维素酶，果胶 酶，β半乳糖苷酶和木聚糖酶）的混合物。
[0016] 在"Aspergillus Enzymes Involved in Degradation of Plant Cell Wall Polysaccharies"，Microbiology and Molecular Biology Reviews, Dec. 2001, p. 497-522 de Vries等人描述了由曲霉产生的参与植物细胞壁多糖降解的不同类别的酶、编码这些酶 的基因、和这些基因的调控。此外还描述了从曲霉属菌株检测到的细胞壁降解活性。
[0017] W097/43423描述了从粗制的、混合的酶制备物果胶酶146纯化α葡糖醛酸酶，其 作为源自具有参考编号4Μ146的曲霉属菌株的果胶酶来源在市场上被出售。
[0018] 还可以得到含有许多不同的降解性酶的商业制备物。
[0019] 然而，由于在工业加工中，最高可能的产量和通量越来越重要，仍然需要更有效的 提供酶溶液的方法。 发明概要
[0020] 在一个方面，提供了生产酶产品的方法以及由所述方法获得的酶产品，所述方法 包括下述步骤：在包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中深层发酵曲霉属 菌株以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。
[0021] 在一个方面，提供了至少包含下列酶活性的酶产品：
[0022] 多聚半乳糖醛酸内切酶活性，
[0023] 多聚半乳糖醛酸外切酶活性，
[0024] 果胶酯酶活性，
[0025] 果胶裂解酶活性，
[0026] 纤维素酶活性，
[0027] 木聚糖酶活性和
[0028] 阿拉伯聚糖酶活性
[0029] 并且其中所述酶产品是由曲霉属菌株的深层发酵获得的表达产品。
[0030] 在一个方面，提供了生产酶产品的方法以及由所述方法获得的酶产品，所述方法 包括下列步骤：在发酵培养基中深层发酵塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis)菌株以获 得发酵培养液，并任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在一个方 面，所述发酵培养基包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料。
[0031] 在一个方面，提供了包含根据本发明的酶产品、酶载体和任选地稳定剂和/或防 腐剂的酶广品制备物。
[0032] 在一个方面，提供了可由根据本发明的方法获得的酶产品。
[0033] 在一个方面，提供了具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉，或其衍生物或后代。
[0034] 在一个方面，提供了具有保藏登记号CBS123488的分离的塔宾曲霉，或其衍生物 或后代。
[0035] 在一个方面，提供了与具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉菌株具有基本上相 同的特征的真菌培养物。
[0036] 在其它方面，提供了用于深层发酵曲霉属菌株的发酵培养基，所述培养基包含甜 菜果肉和麸。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图1显示了如下文中标题"测试"下"测试2"中所述而制成的AJDU标准曲线。
[0038] 图2如下文中标题"测试"下"测试9"中所述而制成的的葡萄糖标准曲线。
[0039] 图3如下文中标题"测试"下"测试11"中所述而制成的木聚糖标准曲线。
[0040] 图4显示了利用如实施例4中所述的表面发酵方法发酵产生的酶产品的蛋白质特 征谱。
[0041] 图5显示了利用如实施例4中所述的根据本发明的深层发酵方法的3种发酵产生 的酶产品的蛋白质特征谱。
[0042] 图6显示了利用如实施例4中所述的根据本发明的深层发酵方法和表面发酵方法 发酵产生的酶产品的蛋白质特征谱。
[0043] 图7显示了实施例4中制备的凝胶扫描。
[0044] 图8显示了在位点1的两个表面发酵处（样品1-2)和在位点1的2个深层发酵 处（样品3-4)以及在位点2的7个深层发酵处（样品5-11)获得的浓缩酶产品的酶活性。
[0045] 发明详述
[0046] 在一个方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在包含含有果胶 和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中深层发酵曲霉属菌株以获得发酵培养液，和任选 地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。另一方面，提供了生产酶产品的 方法，所述方法包括下列步骤：在包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中 深层发酵曲霉属菌株以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的 酶产品。在又一个方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在包含甜菜果 肉和麦麸的发酵培养基中深层发酵曲霉属菌株以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中 回收无细胞培养液形式的酶产品。
[0047] 在一个方面，提供了生产酶产品的方法和由所述方法获得的酶产品，所述方法包 括下列步骤：在发酵培养基中深层发酵塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，和任选地从所述 发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在另一方面，提供了生产酶产品的方法，所 述方法包括下列步骤：在发酵培养基中深层发酵塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，和从所 述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶产品。在又一个方面，提供了生产酶产品的方 法，所述方法包括下列步骤：在包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中深 层发酵塔宾曲霉菌株以获得发酵培养液，和从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的 酶产品。
[0048] 将使用的包含果胶和阿拉伯聚糖的植物材料可以是包含果胶和阿拉伯聚糖的任 何植物材料，例如甜菜果肉或谷麸或其组合。
[0049] 在另一方面，所述植物材料包含甜菜果肉。在另一方面，所述植物材料包含谷麸 (如麦麸）。在又一个方面，谷麸（例如麦麸）和甜菜果肉的混合物被用作所述植物材料。
[0050] 不愿被任何理论所限，相信包含果胶和阿拉伯聚糖（例如麦麸和/或甜菜果肉） 的植物材料对所产生的酶产品的组成有影响。还相信，所述植物材料（例如麦麸和/或甜菜 果肉中）的阿拉伯聚糖含量直接地或间接地涉及所获得的酶产品的相对较高的阿拉伯聚 糖酶的含量。此种高阿拉伯聚糖酶含量，以及其它的酶活性，被认为对于酶产品的应用（例 如在所述酶产品的水果相关的和/或葡萄酒的应用中）是重要的。
[0051] 在一个方面，所述植物材料包含甜菜果肉。在另一方面，发酵培养基包含1-30% w/w范围内的甜菜果肉，例如2-8% w/w范围内的甜菜果肉，或者例如3-7% w/w范围内的甜 菜果肉。在另一方面，所述甜菜果肉具有〇. 5-20% w/w的糖含量，或者例如2-8% w/w的糖 含量。在另一方面，所述甜菜果肉具有5-40% w/w的阿拉伯聚糖含量。已发现，特别有用的 甜菜果肉类型是未糖蜜化的甜菜果肉。
[0052] 在一个方面，所述植物材料包含谷麸。在另一方面，所述植物材料是谷麸和甜菜果 肉的混合物。在又一方面，所述谷麸是麦麸。在另外的方面，所述麦麸具有2-20% w/w的阿 拉伯聚糖含量。术语"发酵"在本申请的情境中指通过在发酵培养基/培养物中生长微生 物而生产物质（例如酶）。
[0053] 在一个方面，所述曲霉属菌株作为一种单一的曲霉属菌株培养物而被发酵。在另 一方面，所述曲霉培养物是塔宾曲霉菌株的一种单一培养物。在又一方面，所述曲霉属菌株 (例如塔宾曲霉菌株）未经遗传修饰（非GM0)。在又一个方面，所述曲霉菌株（例如塔宾 曲霉菌株）还未经自我克隆（self-cloned)。在一个方面，所述塔宾曲霉菌株具有的保藏 登记号为CBS123488。在又一方面，所述曲霉属菌株（例如塔宾曲霉菌株）已经遗传修饰 (GMO) 〇
[0054] 在一个方面，在发酵过程中pH的范围是2. 7-6. 5。在一个方面，在发酵过程中pH 的范围是3-4. 5。在另一方面，在发酵过程中pH的范围是3-4。在又一方面，在发酵过程中 pH的范围是3. 2-3. 7。在又一方面，在发酵过程中pH的范围是3. 3-3. 7。在发酵过程中， PH谱可以保持恒定或者可以在所述的范围内变化。在一个方面，在发酵过程中保持pH，使 得pH最多在±1的pH-范围内变化，例如在±0.8的pH范围内，例如在±0.6的pH范围 内，或者例如在±0.5的pH范围内，例如在±0.3的pH范围内，例如在±0.25的pH范围 内，例如在±0. 2的pH范围内，例如在±0. 15的pH范围内，例如在±0. 1的pH范围内， 例如在±0.05的pH范围内。在一个方面，起始pH是例如，7. 0,6. 5,6. 0,5. 5,或5.0,而最 终的pH是例如4. 5, 4. 0, 3. 5或3. 0。
[0055] 本领域已知，在发酵器/生物反应器中的不同位置处，pH可以变化。此外，这些pH 的变化可取决于培养基/培养液的粘性，其通常在发酵开始时比发酵将近结束时更粘。
[0056] 在一个方面，在发酵过程中，温度在25_40°C的范围内。在另一方面，在发酵过程 中，温度在28_34°C的范围内。在发酵过程中，温度谱可保持恒定或在所述区间内变化。
[0057] 在又一方面，所述发酵是作为需氧发酵进行的。
[0058] 在一个方面，所述发酵培养基还包含硫酸铵和/或硝酸钾。
[0059] 在一个方面，提供了至少包含下列酶活性的酶产品：
[0060] i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性
[0061] ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性
[0062] iii.果胶酯酶活性
[0063] iv.果胶裂解酶活性
[0064] v. 1，3-β -葡聚糖酶活性（或纤维素酶或昆布多糖酶或其任意组合）
[0065] vi.木聚糖酶活性
[0066] vii.阿拉伯聚糖酶活性和
[0067] viii.任选地阿拉伯呋喃糖苷酶活性
[0068] 并且其中所述酶产品是通过深层发酵曲霉属菌株而获得的表达产品。
[0069] 在根据本发明的一方面，所述酶产品是来自发酵培养液的无细胞培养液的形式。 在这方面的变体中，所述酶产品存在于发酵培养液中。
[0070] 在一个方面，提供了至少包含下列酶活性的酶产品：
[0071] i.多聚半乳糖醛酸内切酶活性
[0072] ii.多聚半乳糖醛酸外切酶活性 [0073] iii.果胶酯酶活性
[0074] iv.果胶裂解酶活性
[0075] V.纤维素酶活性
[0076] vi.木聚糖酶活性和
[0077] vii.阿拉伯聚糖酶活性和
[0078] viii.任选地阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0079] 并且其中所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株而获得的表达产品。在另一方面， 所述曲霉属菌株是单一培养物。
[0080] 在一个方面，所提供的酶产品还包含选自下列的一种或多种活性：鼠李糖半乳糖 醛酸酶活性，半纤维素酶活性，葡糖淀粉酶活性，全淀粉酶（holoamylase)活性和昆布多糖 酶活性。
[0081] 在另一方面，所述酶产品还包含鼠李糖半乳糖醛酸酶活性。在另一方面，所述酶产 品还包含半纤维素酶活性。在另一方面，所述酶产品还包含葡糖淀粉酶活性。在另一方 面，所述酶产品还包含全淀粉酶活性。在另一方面，所述酶产品还包含昆布多糖酶活性如， 1，3-β -葡聚糖酶。在另一方面，所述酶产品还包含淀粉酶活性。
[0082] 所述酶产品也可包含半纤维素裂解活性。
[0083] 在其它方面，所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株的一种单一培养物而获得的表 达产品。
[0084] 在另一方面，提供了至少包含下列酶的酶产品
[0085] i.归类在EC 3. 2. L 15中的多聚半乳糖醛酸内切酶
[0086] ii.归类在EC3. 2. L 67中的多聚半乳糖醛酸外切酶
[0087] iii.归类在EC3. I. I. 11中的果胶酯酶
[0088] iv.归类在EC4. 2. 2. 10中的果胶裂解酶
[0089] V.归类在EC3. 2. 1. 4中的纤维素酶
[0090] vi.归类在EC3. 2. 1. 8中的木聚糖酶和
[0091] vii.归类在EC3. 2. 1.99中的阿拉伯聚糖酶，和
[0092] viii.任选地归类在EC3. 2. 1. 55中的阿拉伯呋喃糖苷酶
[0093] 并且其中所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株而获得的表达产品。
[0094] 在一个方面，与使用包含谷类/麦麸和甜菜果肉丸粒的类似发酵培养基、通过相 同培养物的表面发酵而制备的酶产品中的多聚半乳糖醛酸外切酶活性相比，通过深层发 酵制备的酶产品具有更高的多聚半乳糖醛酸外切酶活性，例如通过深层发酵比表面发酵高 1. 2, 1. 3, 1. 4, 1. 5, 1. 6, 1. 7, 1. 8, 1. 9或2. 0倍（如测试5所测量的）。在另一方面，与使用 包含谷类/麦麸和甜菜果肉丸粒的类似发酵培养基、通过相同培养物的表面发酵而制备的 酶产品中的总酶活性相比（如测试1所测量的），通过深层发酵制备的酶产品具有更高的总 酶活性（如测试1所测量的），例如通过深层发酵比表面发酵高1. 2, 1. 3, 1. 4, 1. 5, 1. 6或 1.7 倍。
[0095] 在本申请的一些实施方案中，本方法和/或产品提供了包括但不限于下述的一项 或多项的优势：更高的产量，改善的过程控制，改善的PH控制（不依赖于缓冲剂和/或缓冲 能力），改善的通风，改善的无菌性，不需要的微生物/污染物的生长的减少，在培养基制备 过程中不需要的反应的减少（例如Maillard反应，即氨基酸和还原糖之间在加热时的化 学反应）。
[0096] 在本申请的一些实施方案中，本发明的其它优势是：酶活性存在于发酵培养液的 液体/水性/溶解的部分中，这与表面发酵相反，在表面发酵中必须用适当的缓冲剂提取固 体培养基以收获酶/酶活性。
[0097] 在一个方面，本申请中通过深层发酵所提供的酶产品具有一种或多种更高的酶活 性，例如选自下列的一种或多种活性：多聚半乳糖醛酸内切酶活性，多聚半乳糖醛酸外切酶 活性，果胶酯酶活性，果胶裂解酶活性，1，3-β -葡聚糖酶/纤维素酶/昆布多糖酶活性，木 聚糖酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，鼠李糖半乳糖醛酸酶活性，葡糖 淀粉酶活性，淀粉酶活性，全淀粉酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，根据测试1的QVC粘度测 定活性，根据测试2的苹果汁去果胶化单位，和/或根据测试3的果胶反式消去酶（Pectin transeliminase)活性。
[0098] 不愿被任何理论所限，相信选自多聚半乳糖醛酸内切酶活性，多聚半乳糖醛酸外 切酶活性，果胶酯酶活性，果胶裂解酶活性，1，3-β葡聚糖酶活性，纤维素酶活性，昆布多糖 酶活性，木聚糖酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性，鼠李糖半乳糖醛酸酶 活性，葡糖淀粉酶活性，淀粉酶活性，全淀粉酶活性，阿拉伯呋喃糖苷酶活性中的一种或多 种酶活性显示出与下列一项或多项的线性或近似线性的相关性：根据测试1测量的QVC粘 度测定活性，根据测试2的苹果汁去果胶化单位活性和/或根据测试3的果胶反式消去酶 活性/果胶裂解酶活性。在一个方面，如"测试3"中所述的果胶裂解酶活性/果胶反式消 去酶活性被用于关联或预测本酶产品或本酶制备物的酶活性。
[0099] 另一方面，所述酶产品是由深层发酵曲霉属菌株（例如曲霉属菌株的一种单一培 养物）而获得的表达产品。在一个方面，用于所述深层发酵的培养基包含甜菜果肉。在一 个方面，用于所述深层发酵的培养基包含谷麸，例如麦麸。在一个方面，用于深层发酵的培 养基包含1-30% (w/w)范围内的甜菜果肉。
[0100] 在本发明的一方面，所述酶产品包含 [0101] i. 一种或多种多聚半乳糖醛酸内切酶，
[0102] ii. 一种或多种多聚半乳糖醛酸外切酶，
[0103] iii. -种或多种果胶酯酶，
[0104] iv. -种或多种果胶裂解酶，
[0105] V. 一种或多种昆布多糖酶，
[0106] vi. -种或多种木聚糖酶，
[0107] vii. -种或多种阿拉伯聚糖酶和
[0108] viii.任选地一种或多种阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0109] 在本发明的一方面，所述酶产品包含 [0110] i. 一种或多种多聚半乳糖醛酸内切酶，
[0111] ii. 一种或多种多聚半乳糖醛酸外切酶，
[0112] iii. 一种或多种果胶酯酶，
[0113] iv. -种或多种果胶裂解酶，
[0114] V. -种或多种纤维素酶，
[0115] vi. -种或多种木聚糖酶，
[0116] vii. -种或多种阿拉伯聚糖酶和
[0117] viii.任选地一种或多种阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0118] 在另一方面，所述酶产品还包含鼠李糖半乳糖醛酸酶。
[0119] 在另一方面，所述酶产品还包含一种或多种半纤维素酶，例如归类在EC3. I. 1. 73 中的阿魏酸酯酶。
[0120] 在又一方面，所述酶产品包含归类在EC 3. 2. I. 1，EC 3. 2. I. 2，EC3. 2. I. 3，EC 3· 2. I. 20, EC 3· 2. I. 60, EC 3· 2. I. 68, EC 3· 2. I. 98 或 EC 3· 2. I. 133 中的一种或多种淀粉 酶。
[0121] 在又一方面，所述酶产品包含归类在EC3. 2. 1.3或EC3. 2. I. 20中的一种或多种葡 糖淀粉酶。
[0122] 在又一方面，所述酶产品包含归类在EC3. 2. 1. 133中的一种或多种全淀粉酶。
[0123] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品至少包含下列酶：
[0124] i. 一种或多种多聚半乳糖醛酸内切酶，
[0125] ii. 一种或多种多聚半乳糖醛酸外切酶，
[0126] iii. 一种或多种果胶酯酶，
[0127] iv. -种或多种果胶裂解酶，
[0128] V. -种或多种纤维素酶，
[0129] vi. -种或多种木聚糖酶，
[0130] vii. -种或多种阿拉伯聚糖酶，
[0131] viii. -种或多种鼠李糖半乳糖醛酸酶，
[0132] ix. -种或多种葡糖淀粉酶，
[0133] X. -种或多种淀粉酶，
[0134] xi. -种或多种全淀粉酶和
[0135] xii.任选地一种或多种阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0136] 在本发明的一方面，多聚半乳糖醛酸内切酶活性是如"测试6"中所述测定的。在 本发明的另一方面，多聚半乳糖醛酸外切酶活性是如"测试5"中所述测定的。在本发明的 另一方面，果胶酯酶活性是如"测试7"中所述测定的。在本发明的另一方面，果胶裂解酶活 性是如"测试3"中所述测定的。在本发明的另一方面，阿拉伯聚糖酶活性是如"测试8"中 所述测定的。在本发明的另一方面，纤维素酶活性是如"测试9"中所述测定的。在本发明 的另一方面，木聚糖酶活性是如"测试11"中所述测定的。
[0137] 如上所述，根据本发明的酶产品还可包含一种或多种其它活性。在本发明的一方 面，淀粉酶活性是如"测试12"中所述测定的。在本发明的一方面，葡糖淀粉酶活性是如"测 试14"中所述测定的。在本发明的一方面，全淀粉酶活性是如"测试13"中所述测定的。在 本发明的另一方面，昆布多糖酶活性是如"测试10"中所述测定的。
[0138] 在另一方面，提供了具有下列酶活性的酶产品，例如如在标题"测试"下描述的下 列测试中所测量的：多聚半乳糖醛酸内切酶活性，并且具有至少下列活性：多聚半乳糖醛 酸外切酶活性，果胶酯酶活性，果胶裂解酶活性，阿拉伯聚糖酶活性，纤维素酶活性，和木聚 糖酶活性，其中所述酶产品是通过深层发酵曲霉属菌株的一种单一培养物而获得的天然 表达广品。
[0139] 在本申请中与术语"酶产品"可互换使用的术语"酶复合物"在本申请的情境中指 包含数种酶的混合物的产品或复合物，所述数种酶具有不同的酶活性和/或被归类在不同 的酶委员会（Enzyme Commission)编号（EC编号）下。在另一方面，所述酶复合物也包含 副活性（side activity)。在一个方面，所述"酶复合物"或"酶产品"是通过深层发酵获得 的（任选地浓缩的）基本上无细胞的发酵培养液。在另一方面，所述"酶复合物"或"酶产 品"仍然存在于通过深层发酵获得的、包含细胞的发酵培养液中。
[0140] 在本申请的情境中，术语"副活性"指酶对于不是其主要底物的其它底物可能具有 的一种或多种另外的活性，或者其是指酶产品可能具有的其主要活性以外的其它活性。
[0141] 术语"不同的酶"或"具有不同酶活性的酶"指具有如由本领域技术人员所知的标 准方法所测定的不同底物特异性的酶，或者其中所述酶具有相同的酶底物特异性但是在典 型的酶参数（例如，如由常规方法所测量的最佳pH、最佳温度、Km或Ip (等电点））上不同。
[0142] 因此，在一个方面，两种或多种酶活性可以是具有一种或多种副活性的一种或多 种酶的结果。
[0143] 根据本发明的酶产品优选地由单一培养物通过多重表达而表达。
[0144] 在一个方面，所述酶产品因而可通过单一培养物的发酵而获得，其中所述单一培 养物指生长自一种生物体的培养物。根据本发明的培养物优选是基本上纯的，例如至少 90 %纯（按重量），优选至少95 %纯（按重量），更优选至少97 %纯（按重量），甚至更优选 至少99%纯（按重量）。将要理解，"基本上纯的培养物"可含有更小量的其它生物体，例如 相同菌株的其它克隆或其它菌株。
[0145] 果胶是非常复杂的，并且发现根据本发明的包含各种具有不同活性的酶的酶产品 非常适于果胶的降解。
[0146] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含足够的副活性以降解非果胶多糖化 合物，例如由在标题"测试"下描述的"测试1"或"测试2"所测量的。
[0147] 在本发明的另一方面，根据本发明的酶产品含有降解非常复杂的非果胶多糖化合 物所需的副活性，如由"测试1"所测定的。
[0148] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少10种不同的副活性。
[0149] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少15种不同的副活性。
[0150] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少20种不同的副活性。
[0151] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品包含至少60种不同的副活性。
[0152] 多聚半乳糖醛酸内切酶被归类在EC3. 2. 1. 15中，并且催化果胶酸和其它聚半乳 糖醛酸中（I-M)-Ci-D-半乳糖苷连接的随机水解。
[0153] 许多不同的酶属于此类别，包括D-半乳糖醛酸酶，内切-D-聚半乳糖醛酸酶，内 切-D-半乳糖醛酸酶，内切聚半乳糖醛酸裂解酶。
[0154] 多聚半乳糖醛酸内切酶（EC 3. 2. 1. 15)水解聚半乳糖醛酸链中的（内部）糖苷连 接，形成寡聚半乳糖醛酸片段。
[0155] "聚半乳糖醛酸酶活性"指水解聚半乳糖醛酸链中的糖苷连接的能力。
[0156] 多聚半乳糖醛酸内切酶（EC. 3. 2. 1. 15)活性指水解聚半乳糖醛酸链中的内部糖 苷连接的能力，这与多聚半乳糖醛酸外切酶（EC. 3. 2. 1. 67)活性相反，后者指通过水解（末 端）糖苷连接而从聚半乳糖醛酸链释放末端聚半乳糖醛酸的能力。
[0157] 多聚半乳糖醛酸外切酶活性可如下文所述被测定，其中1单位的多聚半乳糖醛 酸外切酶活性被定义为下述的酶量：其能够在30°C、在50mM乙酸钠缓冲液中、pH4. 2、以 0.25% (w/v)的底物浓度，从作为模式底物的聚半乳糖醛酸（Sigma)中释放1摩尔还原糖 末端/分钟。
[0158] 多聚半乳糖醛酸内切酶活性可以通过在含有0. 1% (w/v)聚半乳糖醛酸（pH4) (Sigma，P3850)的琼脂平板上点一滴培养基来定性地确定。在于30°C孵育至少30分钟后， 用4M HCl淹没平板。在混浊的背景中，多聚半乳糖醛酸内切酶活性作为白色的晕被显现出 来。备选地，通过用0.02% (w/v)钌红溶液孵育而将平板染色。在那种情况下，多聚半乳糖 醛酸内切酶活性被显示为红色背景中的白点。
[0159] 介由如以前所描述的（Parenicova 等人，在 Eur. J. biochem, 251，72-80, 1998 中， 标题是"pgaE encodes a fourth member of the endopolygalacturonase gene family from Aspergillus niger"）比色检测还原糖释放而定量测定多聚半乳糖醒酸外切酶的 催化活性。在30°C、在50mM的乙酸钠缓冲液中、pH4. 2、以0. 25% (w/v)的聚半乳糖醛酸 (Sigma)作为模式底物而进行水解反应。酶活性被表达为U/mg，1单位相应于所释放的1摩 尔还原末端/分钟。
[0160] 在本发明的一方面，所述产品的多聚半乳糖醛酸内切酶活性是通过如下文中标题 "测试"下所描述的"测试6"测量的。此方法测量所述活性对于聚半乳糖醛酸酶的物理影 响，即粘性的降低。此方法对于内切酶活性是特异性的，因为任何外切酶活性（糖的产生） 对于粘性将具有很小的影响或没有影响。
[0161] 在本发明的另一方面，所述产品的多聚半乳糖醛酸外切酶活性是通过如下文中标 题"测试"下所描述的"测试5"测量的。此方法测量还原基团以及因此测量外切酶活性。
[0162] 在一个方面，所述酶产品具有比多聚半乳糖醛酸外切酶活性更高的多聚半乳糖醛 酸内切酶活性。在本发明的另一方面，所述酶产品在多聚半乳糖醛酸外切酶活性和多聚半 乳糖醛酸内切酶活性之间具有的比例为1 :1至8 :1，例如2 :1至6 :1之间，例如3 :1至6 : 1之间。通过在"测试5"中测量多聚半乳糖醛酸外切酶活性和在"测试6"中测量多聚半乳 糖醛酸内切酶活性可确定所述比例。
[0163] 如在"测试6"中所述，一个单位的多聚半乳糖醛酸内切酶活性被定义为在测试条 件下（pH3. 5和30°C )将水解底物、降低溶液粘性、以改变1个无量纲单位的相对流动性/ 每分钟的酶量。
[0164] 如在"测试5"中所述的，1单位的多聚半乳糖醛酸外切酶活性被定义为在测试的 条件下（pH3. 5和50°C )产生1 μ mole D-半乳糖醛酸当量/分钟的酶量。
[0165] 在一个方面，多聚半乳糖醛酸外切酶和多聚半乳糖醛酸内切酶之间的比例为至少 约1 :1，至少2 :1或至少3 :1，如通过"测试5"的方法与"测试6"的方法相比较而由单位确 定所定义的。
[0166] 在另一方面，根据本发明的酶产品具有果胶酯酶活性。在本发明的一方面，所述 产品的果胶酯酶活性是通过由果胶酯酶催化的反应测量的，所述反应涉及果胶混合物（例 如，同聚半乳糖醒酸）中甲酯化的D-半乳糖苷糖醒酸（D-galactosiduronic acid)单位的 脱酯化，得到酸性的果胶和甲醇，然后，所述酸性果胶是果胶解聚酶的底物。
[0167] 果胶酯酶（果胶甲酯酶）被归类在EC3. I. I. 11中并催化反应：
[0168] 果胶+η H20〈 = >n甲醇+果胶酸酯
[0169] 果胶酯酶也被称为果胶去甲氧基酶，果胶甲氧基酶和果胶甲基酯酶。
[0170] 在本发明的一方面，所述产品的果胶酯酶活性是如下文中标题"测试"下描述的 "测试7"中所测量的。
[0171] 一个单位的果胶酯酶活性被定义为在"测试7"的条件下（pH4. 6和30°C )或其它 特定pH和温度水平下，催化1 μ mole的甲基酯键水解（释放1 μ mole果胶酸）/分钟的酶 量。
[0172] 在另一方面，根据本发明的酶产品具有果胶裂解酶活性（1 - 4)-6-0-甲 基-a -D-聚半乳糖醛酸裂解酶。
[0173] 果胶裂解酶也被称为果胶反式消去酶，内切-果胶裂解酶，果胶甲基反式消去酶， 果胶裂合酶（pectolyase)或聚甲基半乳糖醒酸反式消去酶。
[0174] 果胶裂解酶（果胶反式消去酶）被归类为EC4. 2. 2. 10。此酶催化（l-M)-a -D-聚 半乳糖醛酸甲酯的裂解，以得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-0-甲基-a-D-半乳 糖-4-enuronosyl基团的寡糖。
[0175] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的果胶裂解酶活性是由4, 5-不饱和寡 聚半乳糖醛酸酯的生成来测量的，所述4, 5-不饱和寡聚半乳糖醛酸酯是由果胶的半乳糖 醛酸残基之间的内部α-1，4键的随机裂解引起的。
[0176] 可通过酶促水解苹果果胶底物中半乳糖醛酸残基之间的内部α -1，4键来确定果 胶裂解酶的活性，例如下文中在标题"测试"下的"测试3"中所述的。反应的进展（特征是 4, 5-不饱和寡聚半乳糖醛酸酯的增加）继以利用分光光度计的吸光度的增加（由于不饱和 键的形成）。酶活性是由238nm处吸光度的增加/单位时间来计算的。
[0177] 可在pH3. 5和30°C下进行所述测试，或者可就酶的其它表征和说明在不同的pH和 温度值下进行所述测试。
[0178] 一个单位的果胶裂解酶活性被定义为在测试的条件下（pH3. 5和30°C)得到 Λ OD238nm. HiirT1增加的酶量（对于总测试体积校正的）。
[0179] 在一个方面，根据本发明的酶产品具有阿拉伯聚糖酶活性。术语"阿拉伯糖酶" 和术语"阿拉伯聚糖酶"在本申请中被可互换地使用，两者均描述了被归类在EC3. 2. 1.99 中的阿拉伯聚糖酶。系统命名是5-a -L-阿拉伯聚糖5-a -L-阿拉伯聚糖水解酶，但 是它有数个其它的名称，例如阿拉伯聚糖内切-l，5-a-L-阿拉伯糖苷酶，和内切-1， 5-a -L-阿拉伯聚糖酶，内切-α -1，5-阿拉伯聚糖酶，阿拉伯聚糖内切酶，1，5-a -L-阿拉 伯聚糖和l，5-a-L-阿拉伯聚糖水解酶。阿拉伯糖酶内切水解（1->5)_阿拉伯聚糖中的 (1->5) - α -阿拉伯呋喃糖苷连接。阿拉伯聚糖酶也作用于阿拉伯聚糖。
[0180] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的阿拉伯聚糖酶活性（或阿拉伯糖酶活 性）是由如下文中标题"测试"下描述的"测试8"所测定的。可以在ρΗ3.5和50°C下利用 甜菜阿拉伯聚糖作为底物进行该测试，并且可就酶的其它表征和说明在不同的PH和温度 值下进行所述测试。酶活性是由540nm处吸光度的增加/单位时间来计算的。
[0181] 一个单位的阿拉伯聚糖酶活性被定义为在测试条件下（PH3. 5和50°C)得到 Λ OD54tol. HiirT1增加的酶量（对于总的测试体积校正的）。
[0182] 在一个方面，根据本发明的酶产品具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性。术语"阿拉伯呋喃 糖苷酶"描述了被归类在EC 3. 2. 1. 55中的阿拉伯呋喃糖苷酶。其系统命名是a -N-阿拉 伯呋喃糖苷酶。其它名称是a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶和阿拉伯糖苷酶。
[0183] 阿拉伯呋喃糖苷酶作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷，含有（1，3)_和/或（1，5)_连 接的a -L-阿拉伯聚糖，阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。
[0184] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的阿拉伯呋喃糖苷酶活性是由如下文中 标题"测试"下描述的"测试16"所测定的。可以在pH5. 0和50°C下利用对硝基苯a -L-阿 拉伯呋喃糖苷进行该测试，并且可就酶的其它表征和说明在不同的PH和温度值下进行所 述测试。反应的产物，对硝基苯，是比色测定的（在调整pH后）。酶活性是由对硝基苯酚 的浓度和400nm处的吸光度之间的关系来计算的。
[0185] 一个单位的a-N-阿拉伯呋喃糖苷酶活性被定义为在测试条件下（pH5.0和 5(TC (或如所指定的））从对硝基苯a -L-阿拉伯呋喃糖苷产生1 μ mole对硝基苯/分钟 的酶量。
[0186] 在一个方面，根据本发明的酶产品具有纤维素裂解活性。纤维素酶的系统命 名是4-(1，3 ;1，4)-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶和纤维素裂解酶或纤维素酶，被归类 在EC3. 2. 1.4中。纤维素酶内切水解例如纤维素，地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖中的 (I-M)-β-D-糖苷连接，并且也将水解还含有1，3-连接的β-D-葡聚糖中的1，4-连接。 纤维素酶还有其它的名称，例如内切-l，4-i3-D-葡聚糖酶，β-1，4-葡聚糖酶，β-1，4-内 切葡聚糖水解酶，纤维素酶A，cellulosin AP，内切葡聚糖酶D，碱性纤维素酶，纤维素酶 A 3,纤维素糊精酶，9.5纤维素酶，微晶粉末纤维素酶，全细胞酶SS(panCellaSe SS)和 1，4-(1，3 ; 1，4) - β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。
[0187] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品的纤维素酶活性是由如下文中标题"测 试"下描述的"测试9"所测定的。可以在ρΗ3. 5或ρΗ5和50°C下，利用CMC作为底物进行该 测试，可就酶的其它表征和说明在不同的pH和温度值下进行所述测试。酶活性是由540nm 处的吸光度增加/单位时间来计算的。
[0188] 一个单位的纤维素酶活性被定义为在测试条件下（pH3. 5和50°C )得到Λ OD54tol. HiirT1增加的酶量（对于总的测试体积校正的）。
[0189] 木聚糖酶被归类在 EC3. 2. L 8, EC3. 2. L 32, EC3. 2. L 136 和 EC3. 2. L 156， EC3.2. L8，EC3.2. L 136和EC3.2. L 156中，活性可例如，如"测试11"中所述被测量。
[0190] 内切-1，4_β-木聚糖酶被归类在EC 3. 2. 1.8中，该酶引起木聚糖中的 1，4- β -D-木聚糖苷键的内切水解。
[0191] 在一个方面，根据本发明的酶产品具有如下文中标题"测试"下描述的"测试11" 所测量的内切-1，4-β -木聚糖酶活性。
[0192] 可在ρΗ3. 5或ρΗ5和50°C下利用木聚糖作为底物进行"测试11"，或者可就酶的其 它表征和说明在不同的pH和温度值下进行所述测试。酶活性是由540nm处由木聚糖引起 的吸光度增加/单位时间来计算的。
[0193] 在本申请中，一个单位的木聚糖酶活性被定义为在测试11的条件下（pH3. 5和 50°C )得到AOD54tlnm. rnirT1增加的酶量（对于总的测试体积校正的）。
[0194] 在一个方面，根据本发明的酶产品具有鼠李糖聚半乳糖醛酸酶活性，如，例如 Suykerbuyk 等人在"Cloning, sequence and expression of the gene coding for rhamnogalacturonase of Aspergillus aculeatus ；a novel pectinolytic enzyme^Appl. Microbiol. Biotechnol (1995)43:861-870 中所描述的而测量的。
[0195] 在本发明的一方面，所述酶产品还包含被归类在EC3. I. I. 73中的半纤维素酶（或 阿魏酸酯酶）。
[0196] 半纤维素裂解酶或半纤维素酶被归类在EC3. I. 1. 73中，并且被接受的命名是 阿魏酸酯酶。它们催化反应：阿魏酰基-多糖+H2O =阿魏酸+多糖，其中阿魏酸是4-羟 基-3-甲氧基肉桂酸。半纤维素裂解酶的系统命名是4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水 解酶。其还具有下列名称：阿魏酸酯酶，羟基肉桂酰酯酶，半纤维素酶辅助酶（accessary enzyme) ;FAE-III，肉桂酰酯水解酶，FAEA，cinnAE，FAE-I，和FAE-II。这些酶催化来自酯 化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰（阿魏酰基）基团的水解，所述酯化的糖通常是"天然" 底物中的阿拉伯糖。对硝基苯乙酸和阿魏酸甲酯是较差的底物。所有的微生物阿魏酸酯 酶都是被分泌到培养基中的。它们有时被称为半纤维素酶辅助酶类，因为它们辅助木聚糖 酶和果胶酶来分解植物细胞壁半纤维素。
[0197] 昆布多糖酶可以是被归类在E. C. 3. 2. 1.6中的内切-1，3(4)_β-葡聚糖酶或被 归类在E.C. 3. 2. 1.39中的葡聚糖内切-l，3-i3-D-葡糖苷酶。内切-1，3(4)-β-葡聚糖 酶被归类在E.C. 3. 2. 1.6中，其备选的名称是昆布多糖酶，内切-1，3-β-葡聚糖酶，内 切-1，4-β -葡聚糖酶。底物包括昆布多糖，地衣多糖和谷物D-葡聚糖，并且当葡萄糖残 基（其还原基团参与待水解的连接）本身在C-3被取代时，该酶催化β-D-葡聚糖中的 (1->3)_或（I-M)-连接的内切水解。葡聚糖内切-1，3-β-D-葡糖苷酶具有备选的名 称：（1->3) - β -葡聚糖内切水解酶，内切-1，3- β -葡聚糖酶和昆布多糖酶，其被归类在 Ε. C. 3. 2. L 39中，并且水解底物（例如昆布多糖，副淀粉和茯苓聚糖）中（1->3) - β -葡聚 糖中的（l->3)-i3_D-葡糖苷连接。
[0198] 淀粉酶将淀粉分解为糖。所有的淀粉酶均为糖苷水解酶并作用于α -1，4-糖苷键 上。
[0199] α-淀粉酶（EC3.2. I. I) (CAS#9014-71_5)(备选名称：l，4-a-D_ 葡聚糖葡聚糖 水解酶；糖原酶）：所述a-淀粉酶作用在沿淀粉链的随机位置处并分解长链碳水化合物， 最终由直链淀粉产生麦芽三糖和麦芽糖，或从支链淀粉产生麦芽糖，葡萄糖和有限糊精。 β -淀粉酶（EC 3. 2. I. 2)(备选名称：1，4-a -D-葡聚糖麦芽糖水解酶；糖原酶；糖原淀粉 酶）是淀粉酶的另一种形式，其从非还原末端起作用，β_淀粉酶催化第二α-1，4_糖苷键 的水解，并一次切割掉两个葡萄糖单位（麦芽糖）。
[0200] 葡糖淀粉酶（EC3. 2. 1. 3)(备选名称：葡聚糖1，4- α -葡糖苷酶；淀粉葡糖苷酶； 外切-1，4- α -葡糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶酶体-α -葡糖苷酶；1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解 酶）：除了切割直链淀粉和支链淀粉非还原末端处最后的α (1，4糖苷连接）而产生葡萄糖 夕卜，葡糖淀粉酶将切割α (1-6)糖苷连接。
[0201] 全淀粉酶活性是酸性麦芽糖生成活性。
[0202] "深层发酵"在本申请的情境中指本领域内的技术人员公知的发酵类型，其中微生 物在液体培养基中深层发酵，优选使其经受搅拌，例如连续和剧烈的搅拌。所述发酵可在 开放的罐或封闭的罐中进行，并且可以是批次型、给料批次型或连续型。在批次发酵中，生 物体在已知量的培养基中生长确定的时期，然后可在进一步加工之前将细胞群从液体中分 离；而在连续培养中，培养基可以根据产物形成的速度和新鲜培养基的流入而被取出。在给 料批次型发酵中，将至少一种限制生长的化合物（例如营养底物）在发酵过程中补给到发 酵培养液中。
[0203] 具有相似活性的产物可以通过曲霉属的表面发酵而获得，然而，表面发酵的操作 在实际中是困难的，并且酶产品有待从表面被纯化或提取。此外，为了避免其它微生物的感 染，通过本领域技术人员公知的方法（例如热处理或通过酸性PH处理）来灭菌用于深层发 酵的液体培养基比灭菌用于表面发酵的固体培养基更简单。为了使培养基保持最佳的PH 值和/或恒定的pH值，通过加入pH调节剂而在深层发酵过程中控制和调节pH值也是更方 便的。由于这些和其它的原因，深层发酵因此在工业规模中是比表面发酵优选得多的方法。
[0204] 在一个方面，所述菌株来自黑曲霉组。在另一方面，所述菌株是塔宾曲霉。塔宾曲 霉是黑曲霉组的成员。
[0205] 在又一个方面，提供了具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉或其衍生物或后 代。
[0206] 在又一个方面，用于发酵的菌株与具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉菌株具 有基本上相同的特征。
[0207] 在另一方面，所述菌株是具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉。
[0208] 在本发明的情境中，短语"基本上相同的特征"指该菌株具有与保藏在 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Uppsalalaan 8, NL-3584CT 乌特勒支，荷兰 / P. 0. Box 85167, NL-3508 AD乌特勒支，荷兰的，具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉的 一个或多个（优选全部）特征。所述具有保藏登记号CBS123488的塔宾曲霉被给予了下列 登记号：CBS123488塔宾曲霉4M 146,并且保藏日期是2008年9月30日。
[0209] 将理解的是，根据本发明而使用的真菌菌株可以是上述经保藏的菌株的培养物， 但也可以是具有与上述经分离和保藏的菌株基本上相同的特性的菌株的培养物。在优选的 实施方案中，所述菌株是经保藏的菌株或其后代。
[0210] 在本发明的一方面，曲霉属菌株的单一真菌培养物选自：黑曲霉（Aspergillus niger)402(例如 CBS120.49),黑曲霉 hennebergii(Aspergillus niger hennebergii) (例如 CBS117. 80),炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius)(例如 CBS 112.80， CBS420. 64)，黑曲霉 nanus (Aspergillus niger nanus)(例如 CBS136. 52, CBS117. 48)，臭 曲霉（Aspergillus foetidus)(例如 CBS121. 78, CBS 618. 78)，塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis)(例如 CBS11529)，中间黑曲霉（Aspergillus niger intermedius)(例如 CBS559. 65)和日本曲霉（Aspergillus japonicus)(例如 CBS114. 51，CBS621. 78)，棘孢 曲霉（Aspergillus aculeatus)(例如 CBSlOL 43, CBS115. 80, CBS172. 66, CBS119. 49)， 浅蓝灰曲霉（Aspergillus caesiellus)，亮白曲霉（Aspergillus candidus)，肉色曲 霉（Aspergillus carneus)，棒曲霉（Aspergillus clavatus)，弯头曲霉（Aspergillus deflectus)，黄曲霉（Aspergillus flavus)，烟曲霉（Aspergillus fumigatus)，灰绿曲 霉（Aspergillus glaucus)，构巢曲霉（Aspergillus nidulans)，黑曲霉（Aspergillus niger)，赫曲霉（Aspergillus ochraceus)，米曲霉（Aspergillus oryzae)，寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus)，青霉状曲霉(Aspergillus penicilloides)，局限曲霉 (Aspergillus restrictus)，酱油曲霉（Aspergillus sojae)，萨氏曲霉（Aspergillus sydowi),酱油曲霉（Aspergillus tamari), Aspergillus terreusm,焦曲霉（Aspergillus ustus)，或者杂色曲霉（Aspergillus versicolor)。
[0211] 在本发明的一方面，所述曲霉属菌株是未经遗传修饰的。
[0212] 在本发明的一方面，提供了包含根据本发明的酶产品、酶载体和任选地稳定剂和/ 或防腐剂的酶产品制备物。
[0213] 在本发明的又一方面，所述酶载体选自甘油或水。
[0214] 在又一方面，所述制备物包含稳定剂。在一个方面，所述稳定剂选自无机盐，多兀 醇，糖及其组合。在一个方面，所述稳定剂是无机盐，例如氯化钾。在另一方面，所述多元醇 是甘油或山梨醇。在又一方面，所述糖是小分子碳水化合物，特别是数种甜味糖中的任何 糖，例如葡萄糖，果糖和蔗糖。
[0215] 在又一个方面，所述制备物包含防腐剂。在一个方面，所述防腐剂是对羟基苯甲酸 甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，苯甲酸酯，山梨酸酯或其它食品许可的防腐剂，或其混合物。
[0216] 根据本发明的酶产品具有数个优势，例如在果汁的生产中。在一个方面，由于更容 易的液体/固体分离和更高的果汁产量，提供了增加的产量。在一个方面，不论使用什么设 备（卧式压榨机，带式压榨机或倾淅器），由于醪液和次级醪液的粘性降低，而提供了更高 的容量。在一个方面，提供了更少的果渣，因为更高的果汁产量对剩余果渣的量有直接的影 响。在一个方面，提供了压榨机的更容易的清洁。在一个方面，提供了果汁中更少的果胶。 在一个方面，提供了快速、有效的醪液粘性的降低。在一个方面，提供了所有系统中良好的 固体/液体分离和高的果汁产量。在一个方面，提供了果汁和浓缩物中高度有效的颜色提 取和稳定的颜色。
[0217] 在本发明的一方面，根据本发明的酶产品制备物中的果胶裂解酶活性在 50-10. 000U/g的范围内，优选在75-7000U/g的范围内，并且更优选在100-5000U/g的范围 内，例如，如下文所述的"测试3 "中所测量的。
[0218] 另一方面，根据本发明的酶产品制备物中的果胶酯酶活性在10-10000U/g的范围 内，优选在100_7000U/g的范围内，并且更优选在500-3000U/g的范围内，例如，如下文所述 的"测试7"中所测量的。
[0219] 在又一个方面，根据本发明的酶产品制备物中的阿拉伯聚糖酶活性在10_8000U/g 的范围内，优选在50-4000U/g的范围内，更优选在100-2500U/g的范围内，例如，如下文所 述的"测试8"中所测量的。
[0220] 在又一个方面，根据本发明的酶产品制备物中的纤维素酶活性在10_5000U/g的 范围内，优选在50-4000U/g的范围内，并且更优选在100-2000U/g的范围内，例如，如下文 所述的"测试9"中所测量的。
[0221] 在又一个方面，根据本发明的酶产品制备物中的内切-1，4-木聚糖酶活性在 10-10. 000U/g的范围内，优选在50-10. 000U/g的范围内，并且更优选在100-7000U/g的范 围内，例如，如在"测试11"的条件下（PH3. 5和50°C )所测量的。
[0222] 在一个方面，所述酶产品被用于生产果汁浓缩物和葡萄酒。
[0223] 根据本发明的酶产品可被用于作为果汁中天然存在的酶的补充，并且可加速和提 高苹果、梨、葡萄和柑橘水果的加工。
[0224] 在本发明的一方面，所述酶产品可被用在例如柑橘水果加工中，其中酶的应用降 低了果汁的粘性，消除了果汁浓缩和存储过程中胶凝化的风险，并且确保了高的混浊稳定 性。在果肉萃取过程中应用时，根据本发明的酶产品促进了果汁和固体的释放，增加了产 量，并改善了成本效率。稳定的混浊（或者，在柠檬汁的情况中，成功的澄清）是终产品质 量上乘的重要评测标准。
[0225] 在柑橘水果加工过程中利用酶时也可以回收柑橘属精油。除了提供有价值的商品 夕卜，柑橘属精油的回收从可持续性的角度来看是重要的，其确保了废水中杀菌油的低含量， 用于改善的废水生物可降解能力，并减少了整体上的水消耗。在本发明的一个方面，所述 酶产品被用于柠檬汁的澄清。在本发明的一个方面，所述酶产品在柑橘属水果加工中被用 于果肉/核清洗、柑橘属果汁的粘性降低和/或皮提取。
[0226] 高澄清度苹果和梨汁的生产取决于淀粉和果胶内容物的完全分解。这可通过在澄 清和过滤之前，向果汁中加入酶产品而实现。在压榨和果汁分离之前被加入到水果醪液中， 所述酶产品可引起醪液粘性的降低，导致增加的果汁产量和优化的加工能力。更少的果渣 和更容易清洁水果压榨机可以是其它有附加值的优点。在本发明的一方面，所述酶产品被 用于苹果和梨醪液的浸渍。在本发明的一方面，所述酶产品被用于在最初的压榨后提取苹 果果渣。在本发明的一方面，所述酶产品被用于苹果和梨汁中淀粉的降解。在本发明的一 方面，所述酶产品被用于果汁（特别是苹果汁）中果胶的降解。在本发明的一个方面，所述 酶产品被用于果汁（特别是梨汁）中果胶和阿拉伯聚糖的降解。
[0227] 葡萄酒制造者需要年复一年地生产高质量的葡萄酒，无论天气的年度变化如何。 根据本发明的酶产品可辅助有价值的成分（例如芳香、颜色和单宁）从葡萄转移到葡萄酒 中，并且可帮助保持葡萄酒的质量，有时保存许多年。所述酶产品也可减少发酵时间并促进 澄清，过滤和稳定化。
[0228] 本发明也针对源自上述方法的任何产品。此类产品包括源自植物材料的饮料，例 如果汁、咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、苹果酒和营养制备物以及用于食品的成分，例如，用于婴儿 食品、和新的浸渍和/或液化产品。
[0229] 在一个方面，提供了酶产品或酶产品制备物用于降解植物材料的用途，例如其中 所述植物材料是植物细胞，例如其中所述植物材料是植物细胞壁或其部分；例如用于释放 化合物，例如其中所述化合物是生物学活性的化合物或其前体，例如其中所述化合物是药 学活性的化合物。在一个方面，所述植物材料是经遗传修饰的。在另一方面，提供了所述酶 产品用于降解废物的用途。在又一个方面，提供了所述酶产品在果汁和/或葡萄酒制造的 过程中、在水果的提取和/或液化和/或果汁澄清的步骤中的用途。
[0230] 所述酶产品和/或酶产品制备物的其它应用包括下述应用：其中需要从植物材料 (例如水果）中提取颜色/色素，例如浆果（例如，黑醋栗、红醋栗、圆醋栗、酸果蔓、蓝莓、 黑莓、覆盆子、杂交草莓（boysenberry)、桑椹、草莓等）的红颜色，或其它水果（例如，番石 榴、果榄属（Iucuma)、石榴、猕猴桃、葡萄、南瓜、葫芦、黄瓜、甜瓜、橙子、柠檬、酸橙、葡萄柚、 香蕉、桑橙、菠萝、无花果、苹果、温柏、梨、蔷薇果、桃子、搜桃、麥椰子、芒果、油桃、李子、杏 等）。所述酶产品和/或酶产品制备物的其它应用包括从葡萄提取颜色用于果汁或葡萄酒 的生产，例如红葡萄酒和玫瑰葡萄酒的生产。在来自植物材料的颜色/色素提取物中，通 常希望提取尽可能多的颜色/色素。
[0231] 最终的制备物中，根据本发明的酶产品的浓度依赖于所设想的用途。
[0232] 在使用的制备物中，所述酶产品通常的使用剂量是4-300ppm。对于许多用途而言， 通过稀释或浓缩调节所述酶产品，使其达到约300_600U/g的活性，如由"测试3"作为果胶 裂解酶活性而测量的。在将酶产品调节到约300-600U/g的果胶裂解酶活性（如由"测试3" 所测量的）后，然后确定剩余的酶活性。然而，任何酶的活性/克当然取决于由发酵获得的 酶产品或最终制备物的稀释度或浓度。
[0233] 如果所述酶产品的酶活性在100_800U/g(果胶裂解酶单位）的范围内，那么最终 应用中的活性可被计算为：
[0234] 最小值：4ppm(g/吨）的100U/g的产品在最终的应用中产生的酶浓度：0. 4U/kg
[0235] 最大值：300ppm的800U/g的产品在最终的应用中产生的酶浓度：240U/kg
[0236] 具体应用中的相关剂量取决于温度、pH和保持时间。
[0237] 在本发明的一方面，应用产品中的浓度每公斤产品是0.001U/Kg-10.000U/kg，其 中所述应用产品例如是果汁，如苹果、梨、葡萄或柑橘水果。
[0238] 在本发明的一方面，应用产品中的浓度每公斤产品是0. 005U/kg_5. 000U/kg，其中 所述应用产品例如是果汁，如苹果、梨、葡萄或柑橘水果。在本发明的一方面，应用产品中的 浓度每公斤产品是〇. 〇5U/kg_2000U/kg。
[0239] 在本发明的一方面，应用产品中的浓度每公斤产品是0. lU/kg_500U/kg，其中所述 应用产品例如是果汁，如苹果、梨、葡萄或柑橘水果。在本发明的一方面，提供了含有根据本 发明的酶产品制备物的果汁，例如苹果、梨、葡萄或柑橘果汁。
[0240] 在本发明的一方面，提供了用于生产根据本发明的酶产品的方法。
[0241] 在一个方面，提供了生产酶产品的方法，所述方法包括下列步骤：在培养基中深 层发酵塔宾曲霉以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式 的酶产品。在另一方面，提供了包括下列步骤的方法：在培养基中深层发酵塔宾曲霉的一种 单一培养物以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细胞培养液形式的酶 产品。
[0242] 在一个方面，提供了酶产品的生产方法，其中所述方法包括下列步骤：在包含甜菜 果肉的培养基中深层发酵曲霉以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回收无细 胞培养液形式的酶产品。在另一方面，提供了包括下述步骤的方法：在包含甜菜果肉的培养 基中深层发酵曲霉的一种单一培养物以获得发酵培养液，和任选地从所述发酵培养液中回 收无细胞培养液形式的酶产品。
[0243] 在另一方面，所述发酵包括下列步骤：
[0244] a.在接种培养基中生长所述曲霉菌株（例如曲霉培养物）以获得接种物，和
[0245] b.将所述接种物加入到包含含有果胶和阿拉伯聚糖的植物材料的发酵培养基中。
[0246] 在一个方面，所述接种培养基包含甜菜果肉和/或谷麸例如麦麸。在一个方面，所 述接种培养基包含甜菜果肉和谷麸例如麦麸。
[0247] 在本发明的一方面，提供了通过深层发酵生产酶产品的方法，其包括下列步骤：
[0248] a.在通风的种子底物培养基中（任选地包含谷麸和/或甜菜果肉）生长曲霉的一 种单一培养物以获得接种物，所述底物培养基具有的PH在2-8的范围内，
[0249] b.将所述接种物加入到包含谷麸和甜菜果肉的发酵培养基中，并在空气中孵育所 述经接种的发酵培养基以获得发酵培养液，和
[0250] c.从所述发酵培养液中回收酶产品。
[0251] 在本发明的另一方面，提供了生产酶产品的方法，其包括下列步骤：
[0252] a.在任选地包含谷麸和/或甜菜果肉的通风种培养基中使曲霉的一种单一培养 物生长10-60小时以获得接种物，所述培养基具有的pH在2-8的范围内，
[0253] b.以10-20% (v/v)范围内的浓度将所述接种物加入到包含谷麸和甜菜果肉的发 酵培养基中，并在空气中孵育所述发酵培养基20-140小时以获得发酵培养液，和
[0254] c.从所述发酵培养液中回收酶产品。
[0255] 在第一个步骤（a)中，在含有之前经灭菌的原材料和水的培养基中培育或生长生 产菌株。用于发酵过程的培养基可由许多不同的原材料制成。在本发明的一方面，用于生 长所述真菌培养物以获得接种物的培养基包含甜菜果肉和任选地谷麸。在一个方面，通过 酸性pH处理而使所述培养基被灭菌，例如通过2-7范围内的pH、2. 25-6范围内的pH、2. 5-5 范围内的pH、3-4范围内的pH、或约3. 5的pH的处理。在另一方面，通过酸性pH处理而使 所述培养基被灭菌，例如通过pH值为至少2、至少2. 5或至少3的pH处理。
[0256] 在本发明的另一方面，在步骤（b)中用于所述深层发酵的发酵培养基包含谷麸。 在本发明的另一方面，用于所述深层发酵的培养基包含谷麸和甜菜果肉二者。
[0257] 本发明可用于工业规模中的任何深层发酵，例如用于任何具有至少5L的培养基 的发酵。在另一方面，所述发酵可在50L、500L、5000L、50000L或150m 3的培养基中进行。
[0258] 在一个方面，本发明涉及通过根据本发明的方法可获得的酶产品。
[0259] 在本发明的一方面，在发酵过程中加入泡沫抑制剂。作为抗泡沫剂的例子可提及 的有基于聚丙二醇的混合物，例如Erol DF 6000K(CAS009082-00-2)或例如，SIN260。
[0260] 在本发明的一方面，步骤（a)和/或步骤（b)中的pH在2-8的范围内。在本发明 的一方面，步骤（a)和/或步骤（b)中的pH在2. 5-6的范围内。在本发明的一方面，步骤 (a)和/或步骤（b)中的pH在3-4. 5的范围内，例如在3-4的范围内，例如在3. 2-3. 7的 范围内，例如在3. 3-3. 7的范围内。在本发明的一方面，步骤（a)和/或步骤（b)的pH在 3. 3-3. 7的范围内。
[0261] 在本发明的一方面，步骤（a)和/或步骤（b)中的温度在25_40°C的范围内。在本 发明的一方面，步骤（a)和/或步骤（b)中的温度在28-34°C范围内。
[0262] 在本发明的一方面，所述深层发酵是作为需氧发酵进行的。
[0263] 在本发明的一方面，在步骤（a)中在包含谷麸和甜菜果肉的通风种培养基（所述 培养基具有2-8范围内的pH)中生长曲霉培养物10至60小时。在另一方面，生长时期是 15-50小时，例如20-40小时。
[0264] 在本发明的一方面，步骤（b)中的pH被调节为pH2-8,例如2. 5-6,例如pH3_4。在 步骤（b)中，在20-45°C的温度范围内孵育所述培养物。在本发明的一方面，在步骤（b)中， 在25-35°C的温度范围内孵育所述培养物。在本发明的另一方面，在步骤（b)中，在28-34°C 的温度范围内孵育所述培养物。在一个方面，在通风过程中，在步骤（b)中孵育所述培养物 40-140小时。在另一方面，在步骤（b)中孵育所述培养物60-120个小时，例如在通风过程 中孵育70-110个小时。
[0265] 在发酵过程中温度谱在所述间隔内可保持恒定或变化。
[0266] 在本发明的一方面，步骤（a)中生长培养物的培养基和步骤（b)中的发酵培养基 均包含谷麸和甜菜果肉。
[0267] 在另一方面，所述培养基包含硝酸钾。在另一方面，所述培养基包含硫酸铵。在另 一方面，所述培养基包含硫酸铵和硝酸钾二者。在另一方面，所述培养基包含谷麸、甜菜果 肉、硫酸铵和水中的硝酸钾。
[0268] 在本发明的一方面，谷麸是以麦麸丸粒的形式。麦麸丸粒可由麦麸制成，所述麦麸 是生产面粉和粗磨粉的副产品，其主要由外壳和比例可变的胚乳组成，通过加入合适的粘 合剂（例如，1-3% (w/w)的糖蜜、脂肪或胶状粘土），然后在制粒机或挤压机中、在高压下 挤压所述组合物以形成圆柱形状的丸粒。丸粒通常具有与原始植物残留物相同的特征，特 别是在产品的油和水含量方面。取决于其来源，在压榨丸粒（expeller pellet)和提取粉 状丸粒（extraction meal pellet)之间进行区分。
[0269] 麸是谷粒的硬的外层，且包含组合的糊粉和谷皮。其与胚芽一起是整个谷粒的完 整部分，并且可作为精制谷物生产中研磨的副产品而被生产。麸尤其富含饮食纤维并且可 含有显著量的淀粉、蛋白质、维生素和膳食矿物质。麸的相对高的油含量使其经受酸败作 用，这是它为什么经常在储存或进一步加工之前从谷粒中被分离的原因之一。麸本身可被 热处理以增加其寿命。
[0270] 当麸从谷粒中被除去时，它们失去其一部分的营养价值。麸存在于任何谷粒中并 且可从任何谷粒中被研磨出来，所述谷粒包括稻、玉米、小麦、玉蜀黍、燕麦、大麦和粟。
[0271] 稻麸是稻研磨过程（棕色稻到白色稻的转换）中的副产品。稻组成了禾本科 (Poaceae)(或禾本科（Gramineae))的稻属，普通的稻被归类为水稻（Oryza sativa)。
[0272] 在本申请的情境中，术语"麦麸"涉及包含麦粒的硬外层的产品，并且包含组合的 糊粉和谷皮。在一个方面，麦麸具有2-20% w/w含量的阿拉伯聚糖。在一个方面，麦麸具有 5-15% w/w的阿拉伯聚糖含量。在一个方面，麦麸包含至少2% w/w的阿拉伯聚糖，例如至 少3% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少4% w/w的阿拉伯聚糖，或例如至少5% w/w的阿拉伯聚 糖。
[0273] 在另一方面，所述麦麸在发酵培养基中存在于3-7% w/w的范围内。另一方面，所 述麦麸在发酵培养基中存在于3. 5-6% w/w的范围内。在另一方面，麦麸在发酵培养基中存 在于4-5% w/w的范围内。
[0274] 在一个方面，麦麸中的面粉浓度是低的。
[0275] 类似地，相信甜菜果肉丸粒优选地应该是未经糖蜜处理过的。商业上可得的产品 (例如，"pulpetter"）被相信是合适的。也相信，可被丸粒吸收的水的量可以是质量的指 示，例如在水中吸收约4x其重量的能力（好的质量）与例如约2x(低质量）相比。
[0276] 由于原材料质量可能的变化（批次与批次，季节与季节，供应者与供应者等），建 议在较小的规模上就其用于制备酶产品的可适用性测试这些原材料。
[0277] 在本发明的一方面，甜菜果肉被用于a)的基底培养基和b)的发酵培养基中。甜 菜（Beta vulgaris L.)是藜（Chenopodiaceae)科的成员，其是根中含有高浓度鹿糖的植 物。商业上其为了糖而被生长。甜菜直接涉及甜菜根，牛皮菜和饲料甜菜，都是传自海甜菜 的培育。
[0278] 在本发明的一方面，甜菜果肉是以甜菜丸粒或干燥的甜菜果肉或粒化的甜菜果肉 的形式。
[0279] 甜菜果肉是从切片的甜菜中提取了糖后余留下来的植物材料。收获后，甜菜被拖 运到工厂，在那里它们被倾倒在通常是混凝土 "平板"的接收区上，在那里它们被移动成为 大的堆。甜菜从所述堆中被移动到中央通道或沟槽中，在那里其被洗涤而朝向加工厂。在 加工厂处接收后，甜菜根被洗涤，被机械地切成称作甜菜丝的细条，并被递送至称作浸提器 (diffuser)的机器以提取糖内容物成为水溶液。浸提器是许多米的长管，其中甜菜切片在 一个方向移动，而热水在相反的方向移动。移动可以是通过旋转的螺旋或者整个部件旋转， 而且水和甜菜丝移动通过内部的腔。有不同的浸提器的设计，例如水平的旋转，倾斜的螺 旋，或垂直的螺旋"塔"。较少见的设计利用甜菜丝的移动带，伴随着水被泵到所述带的顶上 并且倾泻而过。通常，甜菜丝和水的流速的比率是1比2。通常，甜菜丝花费约90分钟以通 过浸提器，而水仅用45分钟。这些都是逆流交换方法，与如若甜菜丝仅留在热水箱中相比， 所述方法利用更少的水从甜菜丝中提取更多的糖。离开浸提器的液体被称为原果汁。取决 于氧化作用的量，原果汁的颜色由黑变化为暗红，而氧化作用的量本身取决于浸提器的设 计。所使用的甜菜丝或果肉在有约95%的水分但蔗糖含量低时离开浸提器。利用螺旋压榨 器，湿果肉然后被压榨到湿度降至75%。这回收了从果肉压出的液体中的其它蔗糖，并且减 少了干燥果肉所需的能量。经压榨的果肉可被干燥和出售，例如作为动物饲料。此植物材 料然后可被制成丸粒以提高其营养价值和处理特性。它是高纤维的且独特性在于其纤维是 极易消化的。
[0280] 在本发明的另一方面，甜菜果肉是从Danisco Sugar A/S获得的甜菜丸粒的形式。 在本发明的另一方面，甜菜果肉是从Nordic Sugar获得的Fibrex?，甜菜丸粒的形式。
[0281] 甜菜果肉可以是经糖蜜化的，或未糖蜜化的，优选未糖蜜化的如Fibrex?。糖 蜜或糖浆是将甘蔗或甜菜加工成糖时的粘稠糖浆副产品。糖蜜的质量取决于甘蔗或甜菜的 成熟度，提取的糖的量，和提取方法。
[0282] 在本发明的一方面，用于深层发酵的底物包含的甜菜果肉在1-30% w/w的范围 内。在另一方面，用于深层发酵的底物包含的甜菜果肉在1-20 %，2-20 %，1-15 %，1-10 %， 3-15%的范围内。在另一方面，甜菜果肉在2-8% w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另 一方面，甜在3-7% w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另一方面，甜菜果肉在4-7% w/ W的范围内存在于发酵培养基中。在另一方面，甜菜果肉在3. 5-6% w/w的范围内存在于发 酵培养基中。在另一方面，甜菜果肉在4-6% w/w的范围内存在于发酵培养基中。在另一 方面，甜菜果肉在4-5% w/w的范围内存在于发酵培养基中。在一个方面，甜菜果肉以至少 2% w/w、例如至少3% w/w或例如至少4% w/w的量存在于发酵培养基中。
[0283] 在本发明的一方面，所使用的甜菜果肉中的糖含量大约在0. 5-20% (w/w)的范围 内。在另一方面，所述甜菜果肉具有1-10% w/V的糖含量。在另一方面，甜菜果肉在干燥的 基础上具有2-8% w/w的糖含量。在一个方面，所使用的甜菜果肉中的糖含量为至少0. 5% w/w，例如至少2% w/w，例如至少4% w/w，例如至少6% w/w，或例如至少8% w/w的量。
[0284] 在本发明的其它方面，所使用的甜菜果肉中的果胶含量在干燥的基础上在大约 8-35 % w/w的范围内，在大约12-28 % (w/w)的范围内，在干燥基础上在大约15-22 % w/w 的范围内。在一个方面，所使用的甜菜果肉中的果胶含量为至少9% w/w，例如至少11% w/ w，例如至少13% w/w，或例如至少15% w/w的量。
[0285] 在本发明的一方面，甜菜果肉在干燥的基础上具有1. 5-40% w/w的阿拉伯聚糖含 量。在本发明的一方面，甜菜果肉在干燥的基础上具有5-40% w/w的阿拉伯聚糖含量。在 本发明的一方面，甜菜果肉在干燥的基础上具有10-30% w/w或5-30% w/w的阿拉伯聚糖 含量。这些范围可取决于所使用的甜菜果肉的特定类型而变化。在一个方面，甜菜果肉包 含至少1. 5% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少2% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少3% w/w的阿 拉伯聚糖，例如至少4% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少5% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少6% w/w的阿拉伯聚糖，例如至少7 % w/w的阿拉伯聚糖，例如至少8 % w/w的阿拉伯聚糖，例如 至少9% w/w的阿拉伯聚糖，或例如至少10% w/w的阿拉伯聚糖。
[0286] 在一个方面，待用于发酵培养基中的、包含果胶和阿拉伯聚糖的植物材料是谷麸 (例如麦麸）和甜菜果肉的混合物，所述谷麸（例如麦麸）和甜菜果肉的比例为大约20: 80 至 80 :20,30 :70 至 70 :30,40 :60 至 60 :40,或 45 :55 至 55 :45(w:w)。在另一方面，谷麸 (例如麦麸）和甜菜果肉的混合物的比例为大约50 :50 ;大约45 :55 ;大约55 :45 ;大约40 : 60 ;大约60 :40 ;大约30 :70 ;大约70 :30 ;大约20 :80 ;大约80 :20(w:w)。在一个方面，所 述混合物含有比谷麸（例如麦麸）更多的甜菜果肉，例如比例为大约51 :49至60 :40或大 约51 :49至55 :40(w/w)。在一个方面，混合物含有比谷麸（例如麦麸）更多的甜菜果肉， 例如比例为大约51 :49,大约52 :48至大约53 :47,或大约54 :46(w:w)。
[0287] 在其它方面，甜菜果肉和麦麸各自在发酵培养基中存在的范围是3-7% w/w。在另 一方面，甜菜果肉和麦麸各自在发酵培养基中存在的范围是3. 5-6% w/w。在另一方面，甜 菜果肉和麦麸各自在发酵培养基中存在的范围是4-6% w/w。在另一方面，甜菜果肉和麦麸 各自在发酵培养基中存在的范围是4-5% w/w，例如各自以大约4% w/w，大约4. 2% w/w，大 约 4. 3% w/w，大约 4. 4% w/w，大约 4. 5% w/w，大约 4. 6% w/w，大约 4. 7% w/w，大约 4. 8% w/w，大约4. 9% w/w，或大约5. 0% w/w的量存在。
[0288] 在本申请的情境中，术语"培养液"和"培养基"指含有各种用于生长（发酵）微 生物培养物的营养物的液体培养基。
[0289] 在本发明的一方面，所使用的发酵培养基包含谷麸例如麦麸和甜菜果肉。在一些 实施方案中，已发现在发酵培养基中使用谷麸（如麦麸）和甜菜果肉产生具有高的总酶活 性和许多不同的酶活性（在不同的酶以及许多不同的副活性方面）的酶产品。在一些实施 方案中，也已发现，在发酵培养基中使用谷麸（如麦麸）和甜菜果肉产生具有酶活性（例如 阿拉伯呋喃糖苷酶和阿拉伯聚糖酶）的酶产品。
[0290] 在本发明的其它方面，步骤（b)中所使用的发酵培养基具有下列组成：谷麸，甜 菜果肉，硫酸铵和硝酸钾。可通过加入硫酸来调节培养基的pH。
[0291] 可使用不同的方法来决定发酵何时完成。发酵后可测量培养基的粘性。这对于本 领域内的技术人员而言是通常的实践，测量可通过使用Vibro Viscometer SV-10型号的粘 度计（A&D公司）而进行。发酵开始时的粘性通常>150mPa. s例如>200mPa. s，并且当粘性 <150mPa. s (例如在IOOmPa. s以下，在75mPa. s以下或在50mPa. s以下）时可停止发酵。
[0292] 在本发明的一方面，所使用的发酵培养基具有如下组成：
[0293]

【权利要求】
I. 酶产品，其包含至少下列酶活性：
1. 多聚半乳糖醛酸内切酶活性 ii. 多聚半乳糖醛酸外切酶活性 iii. 果胶酯酶活性 iv. 果胶裂解酶活性 v. 纤维素酶活性 vi. 木聚糖酶活性和 vii. 阿拉伯聚糖酶活性。
2. 根据权利要求1的酶产品，其具有比多聚半乳糖醛酸外切酶活性更高的多聚半乳糖 醛酸内切酶活性。
3. 根据权利要求1的酶产品，其中所述多聚半乳糖醛酸内切酶归类在EC 3. 2. 1. 15 中，其中所述多聚半乳糖醛酸外切酶归类在EC3. 2. 1.67中，其中所述果胶酯酶归类在 EC3. 1. 1. 11中，其中所述果胶裂解酶归类在EC4. 2. 2. 10中，其中所述纤维素酶归类在 EC3. 2. 1. 4中，其中所述木聚糖酶归类在EC3. 2. 1. 8中，并且其中所述阿拉伯聚糖酶归类在 EC3. 2. 1. 99 中。
4. 根据权利要求1-3中任一项的的酶产品，还包含阿拉伯呋喃糖苷酶活性，和/或鼠李 糖半乳糖醛酸酶活性，和/或葡糖淀粉酶活性。
5. 根据权利要求1-4中任一项的酶产品，其是来自发酵培养液的无细胞培养液的形 式。
6. 根据权利要求5的酶产品，其中所述发酵培养液是由深层发酵曲霉属菌株获得的。
7. 包含根据权利要求1-6中任一项的酶产品的酶产品制备物。
8. 根据权利要求7的酶产品制备物，其包含所述酶产品、酶载体以及任选地包含稳定 剂和/或防腐剂。
9. 根据权利要求7-8任一项的酶产品制备物，其包含活性在50-10000U/g范围内的果 胶裂解酶，活性在l〇-l〇〇〇〇U/g范围内的果胶酯酶，活性在10-8000U/g范围内的阿拉伯聚 糖酶，活性在10_5000U/g范围内的纤维素酶，和活性在10-10. 000U/g范围内的内切-1， 4_木聚糖酶。
10. 根据权利要求1-6任一项的酶产品用于果汁浓缩物或葡萄酒的用途。 II. 包含权利要求1-6任一项的酶产品的果汁浓缩物或葡萄酒。
【文档编号】C12N9/88GK104480093SQ201410662606
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2009年12月21日 优先权日:2008年12月19日
【发明者】M·Z·格罗恩菲尔德 申请人:杜邦营养生物科学有限公司