一种提高冬虫夏草多糖产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高冬虫夏草多糖产量的方法，属于生物工程领域。本发明利用的是一株从西藏冬虫夏草子实体中分离获得的中国被毛孢（CJMCC No.9046），利用糖蜜（含糖量50%）、高F值寡肽、山药提取物作为培养基，通过流加山药提取物和间歇搅拌等微生物技术手段，将菌体逐级扩大培养，过滤烘干后得到菌丝体粉，经检测冬虫夏草多糖含量可达13-14%，远高于野生冬虫夏草。本发明培养基营养成分经济合理，培养方法对设备无特殊要求，且减少了动力消耗降低了生产成本，能够很好的提高冬虫夏草多糖的产量，为该菌株进一步开发利用奠定了基础。CGMCC No.904620140529
【专利说明】一种提高冬虫夏草多糖产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种提高冬虫夏草多糖产量的方法。
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草又名中华虫草，是冬虫夏草菌寄生于高山草甸中的蝠蛾幼虫，使幼虫身 躯僵化，即冬虫夏草菌的子实体与僵虫菌核构成的复合体，属于可食用的真菌。冬虫夏草是 我国一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多重功效。由于 具有独特的药用价值，加上野生资源不断减少、市场价格飙升，冬虫夏草受到国内外各界人 士的关注也成为近年科学研宄的热点。
[0003] 冬虫夏草中含量最高的活性物质是冬虫夏草多糖，因其可以抗氧化、抗肿瘤和增 强免疫力等功效而受广大人群青睐。冬虫夏草多糖是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、 岩藻糖等组成的多聚糖。冬虫夏草多糖有固本培元、扶正祛邪的作用，能调节免疫、抗肿瘤、 护肾、延缓衰老、抗疲劳、调节脂代谢与糖代谢、抗肝纤维化和抗辐射等多种功能，是值得挖 掘的一大生物宝库。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的目的是提供一种提高冬虫夏草多糖产量的方法。具体说是利用一株从西 藏冬虫夏草子实体中分离的中国被毛孢（Hisutella sinensis)，利用特制培养基通过特殊 的培养条件，发酵培养获得菌丝体。经检测发现冬虫夏草多糖含量高达13-14%，远高于野 生冬虫夏草。
[0005] 为了达成上述目的，本发明可通过如下技术措施实现：
[0006] -种提高冬虫夏草多糖产量的方法，采用中国被毛孢菌种M-010,已于2014年5月 29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，经鉴定该菌株为中 国被毛孢（Hisutella sinensis)，保藏编号：CGMCC No. 9046,保藏地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，分类命名：冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis。
[0007] 包括如下步骤：
[0008] (1)菌种斜面培养
[0009] 培养基：马铃薯培养基；
[0010] 挑取斜面培养的菌丝体一环，接种于新鲜斜面培养基，置于15-25?恒温培养箱静 置培养5-15天；
[0011] ⑵菌种种子培养
[0012] 种子培养基：糖蜜2-6%、高F值寡肽0. 2-1. 0%、山药提取物0. 5-1. 0%，其余为 水，pH自然。
[0013] 挑取一环新鲜斜面生长的菌丝体，于液体种子培养基中，培养温度为15-25°C，培 养转速为100_200rpm，培养周期5-10天；以5-15% (V/V)的接种量接种于二级种子罐，培 养温度为15_25°C，培养转速为100-200rpm，通气量为1:0. 1-0. 5,培养周期4-7天；
[0014] (3)菌种发酵培养
[0015] 发酵培养基：糖蜜4-10%、高F值寡肽0.5-1. 5%，其余为水，pH自然；
[0016] 补料培养基：山药提取物1-3%。
[0017] 按5-20% (V/V)接种量接种步骤（2)的种子罐菌液至发酵培养基中，培养转速为 100-300rpm，通气量为1:0. 2-0. 7,于15-25°C条件下培养2天后，间歇搅拌（静止与搅拌交 替进行），分3-10次流加共计0. 1-0. 3% (V/V)的补料培养基，培养周期为7-15天；
[0018] (4)抽滤将步骤（3)发酵培养所得发酵液经板框过滤弃去滤液，获得湿菌丝体；
[0019] (5)烘干将步骤（4)获得的湿菌丝体通过50-70°C烘干粉碎后得菌丝体粉。
[0020] 本发明的目的还可通过如下技术措施实现：
[0021] 步骤（3)所述间歇搅拌指每隔2_6h搅拌2_6h，如此循环；
[0022] 所述冬虫夏草菌粉中多糖的提取方法为：取冬虫夏草菌粉，加入菌粉10倍数量体 积的蒸馏水，沸水浴下反复浸提并合并滤液，浓缩至原体积的1/5,加入95 %乙醇并低温沉 淀过夜，离心取沉淀，然后用乙醇和丙酮分别洗涤，干燥后得粗多糖。
[0023] 所述冬虫夏草多糖含量采用苯酚硫酸法测定。
[0024] 本发明的有益效果：
[0025] (1)本发明特制的液体培养基，营养成分经济合理，培养方法简单，对设备无特殊 要求，一般的发酵设备均可满足生产，为该菌株进一步开发利用奠定了基础。
[0026] (2)通过间歇搅拌工艺，降低了动力消耗，从而降低了生产成本。
[0027] (3)通过本发明培养方法获得的冬虫夏草菌粉，虫草多糖产量可达13-14%，较野 生冬虫夏草中多糖含量提高62. 5-75%。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0029] 下述实施例培养基成分的百分比均为质量百分比，以下不再说明。
[0030] 实施例1中国被毛孢的液体培养
[0031] 1.培养基
[0032] 斜面培养基：马铃薯培养基；
[0033] 种子培养基：糖蜜2.0%、高F值寡肽0.2%、山药提取物0.5%，其余为水，pH自 鋏.
[0034] 发酵培养基：糖蜜4.0%、高F值寡肽0.5%，其余为水，pH自然；
[0035] 补料培养基：山药提取物1. 2%，其余为水。
[0036] 2.培养方法
[0037] 挑取一环新鲜斜面生长的菌丝体，于液体种子培养基中震荡培养，转速lOOrpm，培 养温度为15-25°C，培养5天，菌丝体干重达到发酵液的0. 3 %。
[0038] 以二级种子液体积5 %的接种量接种上述一级种子于二级种子罐，培养温度为 15-25°C，转速lOOrpm，通气量为1 :0. 1，培养周期4天，菌丝体干重达到发酵液的0.8%。
[0039] 以发酵培养基体积5 %的接种量将二级种子接种于发酵培养基，培养温度为 15-25°C，转速lOOrpm，通气量：1:0. 2,罐压力维持在：0. 05Mpa，培养2天后，以2小时静 止、2小时搅拌，依次循环的间歇搅拌方式，分别在发酵的第3、4、5天，每次流加发酵液体积 0. 4%体积的补料培养基，流加速度100mL/h，培养周期为7天，此时发酵液还原糖含量消耗 至0. 1 %，发酵结束后菌丝体干重得率达到2. 0 %。
[0040] 实施例2中国被毛孢的液体培养
[0041] 1.培养基
[0042] 斜面培养基：马铃薯培养基；
[0043] 种子培养基：糖蜜6.0%、高F值寡肽1.0%、山药提取物1%，其余为水，pH自然；
[0044] 发酵培养基：糖蜜10 %、高F值寡肽1. 5 %，其余为水，pH自然；
[0045] 补料培养基：山药提取物3. 0%，其余为水。
[0046] 2.培养方法
[0047] 挑取一环新鲜斜面生长的菌丝体，于液体种子培养基中震荡培养，转速200rpm，培 养温度为15_25°C，培养10天，菌丝体干重达到发酵液的0. 25%。
[0048] 以二级种子液体积15 %的接种量接种上述一级种子于二级种子罐，培养温度为 15-25°C，转速200rpm，通气量为1:0. 5,培养周期7天，菌丝体干重达到发酵液的0. 7%。
[0049] 以发酵培养基体积20 %的接种量将二级种子接种于发酵培养基，培养温度为 15-25°C，转速300rpm，通气量：1:0. 7,罐压力维持在：0. 05Mpa，培养2天后，间歇搅拌（4小 时静止，4小时搅拌，依次循环），分别在发酵的第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天，每次流加 发酵液体积〇. 3 %体积的补料培养基，流加速度80mL/h，培养周期为15天，此时发酵液还原 糖含量消耗至〇. 18%，发酵结束后菌丝体干重得率达到1. 8%。
[0050] 实施例3中国被毛孢的液体培养
[0051] 1.培养基
[0052] 斜面培养基：马铃薯培养基；
[0053] 种子培养基：糖蜜4.0%、高F值寡肽0.6%、山药提取物0.7%，其余为水，pH自 鋏.
[0054] 发酵培养基：糖蜜7 %、高F值寡肽I. 0 %，其余为水，pH自然；
[0055] 补料培养基：山药提取物2. 1 %，其余为水。
[0056] 2.培养方法
[0057] 挑取一环新鲜斜面生长的菌丝体，于液体种子培养基中震荡培养，培养温度为 20°C，培养7天，菌丝体干重达到发酵液的0. 4%。
[0058] 以二级种子液体积10 %的接种量接种上述一级种子于二级种子罐，培养温度为 15-25°C，转速150rpm，通气量为1 :0. 3,培养周期5天，菌丝体干重达到发酵液的0. 8%。
[0059] 以发酵培养基体积15 %的接种量将二级种子接种于发酵培养基，培养温度为 15-25°C，转速200rpm，通气量：1:0. 5,罐压力维持在：0. 05Mpa，培养2天后，以6小时静止、 6小时搅拌，依次循环的间歇搅拌方式，分别在发酵的第4、5、6、7、8、9、10天，每次流加发酵 液体积0. 3%体积的补料培养基，流加速度120mL/h，培养周期为11天，此时发酵液还原糖 含量消耗至〇. 15%，发酵结束后菌丝体干重得率达到1.9%。
[0060] 实施例4中国被毛孢的液体培养
[0061] 1.培养基
[0062] 斜面培养基：马铃薯培养基；
[0063] 种子培养基：糖蜜3.0%、高F值寡肽0.4%、山药提取物0.6%，其余为水，pH自 鋏.
[0064] 发酵培养基：糖蜜5%、高F值寡肽0. 8%，其余为水，pH自然；
[0065] 补料培养基：山药提取物1. 6%，其余为水。
[0066] 2.培养方法
[0067] 挑取一环新鲜斜面生长的菌丝体，于液体种子培养基中震荡培养，培养温度为 15-25°C，培养6天，菌丝体干重达到发酵液的0. 45 %。
[0068] 以二级种子液体积8 %的接种量接种上述一级种子于二级种子罐，培养温度为 15-25°C，转速130rpm，通气量为1 :0. 2,培养周期5天，菌丝体干重达到发酵液的0. 9%。
[0069] 以发酵培养基体积10 %的接种量将二级种子接种于发酵培养基，培养温度为 15-25°C，转速150rpm，通气量：1:0. 4,罐压力维持在：0. 05Mpa，培养2天后，以6小时静止、 6小时搅拌，依次循环的间歇搅拌方式，分别在发酵的第4、5、6、7天，每次流加发酵液体积 0. 4%体积的补料培养基，流加速度150mL/h，培养周期为9天，此时发酵液还原糖含量消耗 至0. 14%，发酵结束后菌丝体干重得率达到2.0%。
[0070] 实施例5中国被毛孢的液体培养
[0071] 1.培养基
[0072] 斜面培养基：马铃薯培养基；
[0073] 种子培养基：糖蜜5.0%、高F值寡肽0.8%、山药提取物0.8%，其余为水，pH自 鋏.
[0074] 发酵培养基：糖蜜9%、高F值寡肽1.2%，其余为水，pH自然；
[0075] 补料培养基：山药提取物2. 7%，其余为水。
[0076] 2.培养方法
[0077] 挑取一环新鲜斜面生长的菌丝体，于液体种子培养基中震荡培养，培养温度为 15-25°C，培养6天，菌丝体干重达到发酵液的0. 42 %。
[0078] 以二级种子液体积12 %的接种量接种上述一级种子于二级种子罐，培养温度为 15-25°C，转速180rpm，通气量为1 :0. 4,培养周期6天，菌丝体干重达到发酵液的0. 85%。
[0079] 以发酵培养基体积18 %的接种量将二级种子接种于发酵培养基，培养温度为 15-25°C，转速260rpm，通气量：1:0. 6,罐压力维持在：0. 05Mpa，培养2天后，以6小时静止、 6小时搅拌，依次循环的间歇搅拌方式，分别在发酵的第3、4、5、6、7、8、9、10、11天，每次流 加发酵液体积〇. 3 %体积的补料培养基，流加速度100mL/h，培养周期为12天，此时发酵液 还原糖含量消耗至〇. 13%，发酵结束后菌丝体干重得率达到2. 1%。
[0080] 实施例6冬虫夏草多糖含量的测定
[0081] 分别对发酵菌丝体粉和野生冬虫夏草的虫草多糖的含量进行检测。
[0082] 取IOg上述实施例待测样，加 10倍体积的蒸馏水，沸水浴下浸提3h，反复浸提3次 并将滤液合并，浓缩至原体积的1/5,加入95 %乙醇至4倍体积并低温沉淀过夜，离心取沉 淀，然后用乙醇和丙酮各洗涤2次，干燥，得粗多糖。
[0083] 精确称取干燥至恒重的虫草多糖各50mg，置于IOOmL容量瓶中，加蒸馏水定容至 刻度，摇勾。取样品液I. OmL，蒸馏水补充至2. OmL，加入50g/L的苯酷I. OmL，浓硫酸5. OmL， 迅速振荡摇匀，于室温下显色20min，测定OD488，平行测定3次.并根据标准曲线的回归方 程，计算出液体培养的菌丝体粉的冬虫夏草多糖含量为13. 6%，野生冬虫夏草中冬虫夏草 多糖的含量为7. 8%，菌丝体粉比野生冬虫夏草中冬虫夏草多糖含量提高了 74. 4%。
[0084] 实施例7其他营养成分的测定
[0085] 分别对发酵菌丝体粉和野生冬虫夏草的其他营养成分的含量进行检测。
[0086] L虫草酸测定
[0087] 采用液相色谱法进行虫草酸的测定，色谱柱为Inertsil 0DS-3 (4. 6mmX 250mm， 5μπι)，柱温30°C。检测器为示差折光检测器。流动相为乙腈：水= 80:20,梯度洗脱，流速 0. 8mL/min〇
[0088] 测定液体培养的菌丝体粉的虫草酸的含量为8. 2%，野生冬虫夏草中虫草酸的含 量为7. 5 %，菌丝体粉比野生冬虫夏草中虫草酸含量提高了 9. 3 %。
[0089] 2.虫草素测定
[0090] 采用液相色谱法进行虫草素的测定，色谱柱为Inertsil ODS-3 (4. 6mmX 250mm， 5μπι)，柱温30°C。检测器为二极管阵列紫外检测器，检测波长260nm。流动相乙腈：水= 80:20，流速 0. 8mT,/min。
[0091] 液体培养的菌丝体粉中虫草素的含量为0. 60%，野生冬虫夏草中虫草素的含量为 0. 48 %，菌丝体粉比野生冬虫夏草中虫草素含量提高了 25. 0 %。
[0092] 此外，对该菌丝体粉的其他各项营养成分与野生冬虫夏草进行了比对，总结如下 表。
[0093]
【权利要求】
1. 一种提高冬虫夏草多糖产量的方法，其特征在于，采用中国被毛孢菌种M-010,已于 2014年5月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9046,按如下步骤进行： (1) 固体斜面培养斜面培养基选用马铃薯培养基；接种中国被毛孢菌种M-010于马 铃薯培养基斜面，在15_25°C条件下培养5-15天； (2) 种子培养接种步骤（1)菌丝至一级摇瓶种子培养基中，以100-200rpm转速培 养5-10天，然后按5-15% (V/V)的接种量接种摇瓶种子液至二级种子罐培养，通气量： 1:0. 1-0. 5,培养4-7天；所述种子培养温度为15-25°C ; 种子培养基：糖蜜2-6%、高F值寡肽0. 2-1. 0%、山药提取物0. 5-1. 0%，其余为水，pH自 鋏. (3) 发酵培养按5-20% (V/V)接种量接种步骤（2)的种子罐菌液至发酵培养基中，培 养转速为100-300rpm，通气量为1:0. 2-0. 7,于15-25°C条件下培养2天后，采用在间歇搅拌 下分3-10次流加共计0. 1-0. 3% (V/V)的补料培养基，培养周期为7-15天； 发酵培养基：糖蜜4-10%、高F值寡肽0. 5-1. 5%，其余为水，pH自然； 补料培养基：山药提取物1-3% ; (4) 抽滤将步骤（3)发酵培养所得发酵液经板框过滤弃去滤液，获得湿菌丝体； (5) 烘干将步骤（4)获得的湿菌丝体通过50-70°C烘干粉碎后得菌丝体粉。
2. 根据权利要求1所述一种提高冬虫夏草多糖产量的方法，其特征在于，步骤（3)所述 间歇搅拌指每隔2-6h搅拌2-6h，如此循环。
3. 根据权利要求1所述一种提高冬虫夏草多糖产量的方法，其特征在于，所述冬虫夏 草菌粉中多糖的提取方法为：取冬虫夏草菌粉，加入菌粉10倍数量体积的蒸馏水，沸水浴 下反复浸提并合并滤液，浓缩至原体积的1/5,加入95%乙醇并低温沉淀过夜，离心取沉淀， 然后用乙醇和丙酮分别洗涤，干燥后得粗多糖。
【文档编号】C12P19/04GK104480158SQ201410664857
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】高艳华, 任明, 袁博 申请人:济南国力生物科技有限公司