一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌dna的方法
【专利摘要】本发明提供一种从发病的水稻和玉米等禾本科的叶片病斑上直接提取病原真菌和细菌DNA的方法。采用本发明的方法可以从感染稻瘟病的水稻叶片、穂颈及玉米叶片病斑上直接提取病原菌的DNA，提取方法简单、快速、成本低，提取的DNA适用于病原微生物的分子检测与诊断、病原菌的无毒基因检测以及群体遗传多样性等基于PCR技术的分析。
【专利说明】一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物分子检测领域，特别的，属于一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法。
【背景技术】
[0002]作物病原微生物DNA的提取是开展相关病原分子检测与分析的基础。传统病原真菌DNA的提取常采用的方法是CTAB提取法和细胞壁裂解法等。CTAB法需要前期液氮的研磨，或者使用酶进行细胞破壁，然后要使用氯仿等有毒试剂抽提以去除蛋白，进行DNA沉淀和洗脱等多个步骤，虽然能获得质量高的DNA，但整个过程耗时长，效率低。而且，DNA分离的前期需要完成病原微生物的分离与培养，实验周期长。采用试剂盒提取的方法，虽然比传统的方法简便了许多，但又存在成本高的问题，不利于大量样品的分析与检测。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，建立在真菌rDNA的ITS区段PCR扩增序列比较分析的真菌病害诊断鉴定技术、建立在细菌16S rDNA区段PCR扩增序列比较分析的细菌病害诊断鉴定技术已成熟；诸多的无毒基因不断从病原菌中被成功分离克隆以及大量可用的分子标记信息，为采用建立在PCR基础上的病原微生物快速诊断、病原菌群体的遗传多样性分析以及病原菌无毒基因的快速检测与监测等奠定了坚实的基础。建立一种快速分离病原微生物的DNA技术，特别是能直接从发病组织直接分离病原菌的DNA技术，用于建立在PCR技术上的分子诊断与检测，将极大地提高工作效率。
【发明内容】
[0003]采用一步法，直接从水稻稻瘟病叶瘟和穂颈瘟病斑上直接提取病原菌的DNA的方法，该方法提取的DNA可用于稻瘟病菌群体无毒基因的分子检测与监测，将极大地提高工作效率，省去水稻稻瘟病病原菌的分离、保存、培养等前期数天的准备过程，而且DNA的提取仅需一步即可完成，提取的DNA可直接用作PCR的扩增的模板进行有效扩增，与已有的DNA提取方法相比，可大大缩短DNA提取的时间，减少工作的繁琐性，实现基于PCR技术的田间稻瘟病菌种群无毒基因构成的快速检测与监测。
[0004]同时，应用本方法，成功从玉米灰斑病病斑上成功分离玉米灰斑病病原真菌的DNA,从水稻细菌性条斑病病斑上成功分离到病原细菌的DNA，表明该方法不仅能在用于感染稻瘟病的水稻组织病原菌的DNA提取，同时可应用于禾本科其它作物的真菌或细菌病害感病组织的病原菌DNA的提取，为开展其它病害病原菌的分子遗传多样性及新病害的快速分子诊断提供一种DNA提取的重要方法和途径。
[0005]一方面，本发明提供一种从禾本科作物感病组织直接提取DNA的方法，该方法包括:1)、提前分别配制以下四种试剂，灭菌后备用“1)、100mM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3)、1M KCl 和(4)、10% Tween 20 ；
[0006]2)、采集待检测的感染病害的禾本科作物的叶片或其它组织作为样品，从发病的禾本科的叶片病斑上切取约2mmX 2mm大小的叶片或从水稻穂颈上取l_2mm长的发病穂颈分别放置于PCR-96孔板中；
[0007]3)、根据样品的数量，将步骤(I)中的 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA (ρΗ8.0)和IM KCl各取适量等体积混合后，然后再根据3种混合液的总体积按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均匀后，在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液；
[0008]4)、将上述处理好的样品放入PCR仪，95°C加热处理lOmin，或将样品放入湿热灭菌锅，在105°C下处理lOmin，取出样品放置于-20°C备用。
[0009]在一些优选的方式中，PCR-96孔板可以被任何容器所代替，只要这种容器可以被加热进行步骤4的处理就可以了。
[0010]在一些优选的方式中，单个病斑的大小可是任意合适的面积，例如2mmX2mm ；ImmX2mm ；0.5mmX2mm或者多个相同面积的病斑。除了叶片或穂颈上的病斑外，其他组织的病斑也可以采用本发明的方法进行。
[0011]在另外一方面，本发明提供一种从感病禾本科作物组织上直接提取病原菌DNA的方法，该方法由以下步骤组成:
[0012]1)、配制以下四种试剂，灭菌后备用:(l)、100mM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2)、1mMEDTA (pH 8.0)、(3)、1M KCl 和(4)、10% Tween 20 ；
[0013]2)、采集待检测的感染病害的组织，从发病的禾本科作物叶片上切取2_X2_大小的发病叶片分别放置于PCR-96孔板中；
[0014]3)、根据样品的数量，将步骤(I)中的 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA(ρΗ8.0)和IM KCl各取适量等体积混合后，然后再根据3种混合液的总体积按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均匀后，在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液；
[0015]4)、将上述处理好的样品放入PCR仪，95°C加热处理lOmin，或将样品放入湿热灭菌锅，在105°C下处理lOmin，取出样品放置于-20°C备用。
[0016]在一些优选的方式中，其中禾本科植物病害为水稻的稻瘟病，玉米灰斑病或者水稻细菌性条斑病。
[0017]优选的，其中禾本科植物组织样品为水稻叶片或穂颈上的稻瘟病病斑；玉米的叶片上玉米灰斑病病斑或者水稻叶片上水稻细菌性条斑病病斑。
[0018]在一些优选的方式中，禾本科的单个病斑的大小可是任意合适的面积，一般为单个病斑的大小，例如2mmX 2mm、ImmX 2mm、0.5mmX 2mm等。实际上，本发明所采用的组织样本不是整个病斑的大小，而是一个病斑的很小一部分作为提取DNA的样本，例如整个病斑的1/5，1/10，1/2，或其他面积。除了水稻叶片或穂颈上的稻瘟病病斑外，其他组织的稻瘟病单个病斑也可以米用本发明的方法进行。例如，稻瘟病的感病病斑长度有大有小，田间一般超过5mm(穂颈)，长的可超过1mm(或20平方毫米)(叶片上)，而本发明仅仅是取单个病斑的很小的一部分就能实现DNA的直接提取和快速检测。实际上，本发明中的2X2mm或者是穂颈的1-2_其实只是病斑的很少部分，大约只有整个单个病斑的五分之一或更小。这有利于稻瘟病菌无毒基因的检测，如果需要分离稻瘟病菌时，可从剩余的病斑中完成病原菌的分离；而且对于取样的大小没有太多的要求，在如此小面积的部分单个病斑上可以实现稻瘟病菌基因DNA的提取和检测，实现了痕量样品检测的目的。
[0019]有益效果
[0020]通过本技术发明，(I).可省去传统常规方法中病原菌的分离、培养及病菌收集的过程，简化了程序；(2).实现一步法直接从禾本科作物感病组织中上直接分离病原菌的DNA，省去了常规中多次抽提的繁琐步骤；(3).获得的DNA可直接用于病原菌群体遗传多样性、病原菌无毒基因检测及新病害的快速分子诊断分析。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为从水稻感病叶片和穂颈上提取稻瘟病菌DNA的PCR扩增结果。其中，M,分子量标记，DL2000 ;图1a指从感病叶片提取DNA后扩增真菌rDNA的ITS区段的通用引物对(ITS1/ITS4)扩增的结果，预期片段大小544bp，其中带1_15为感病叶片提取的DNA扩增结果，带16为健康叶片作空白对照；图1b指从感病叶片提取DNA后用AvrPizt-1Fw/AvrP i z t-1 Rv引物对扩增的结果，预期片段大小1186bp，其中带1-15为感病叶片提取的DNA扩增结果，带16为健康叶片作空白对照；图1c指从感病穂颈提取DNA后用ITS1/ITS4引物对扩增的结果，其中带1-15为感病穂颈提取的DNA扩增结果，带16为健康穂颈作空白对照；图1d指从感病穂颈提取DNA后用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物对扩增的结果，预期片段大小1186bp，其中带1-15为感病穂颈提取的DNA扩增结果，带16为健康穂颈作空白对照。
[0022]图2为从玉米感病叶片上提取玉米灰斑病菌DNA的PCR扩增结果。其中，M，分子量标记，DL2000 ;带1-2指从感病叶片提取DNA后扩增真菌rDNA的ITS区段的通用引物对(ITS1/ITS4)扩增的结果，获得了与预期片段一样，大小约500bp.
[0023]图3.为从水稻感病的叶片上提取水稻细菌性条斑病菌DNA的PCR扩增结果。其中，M，分子量标记，DL2000 ;带1-2指从感病叶片提取DNA后扩增细菌16SrDNA的通用引物27F/1942R扩增的结果，获得了与预期片段大小一样的片段，约1.5kb.
【具体实施方式】
[0024]就是以举例的方式说明本发明是如何进行的，这些举例仅仅是为了说明本发明是如何实现的，或者最佳实施方式，这些实施例子并不能对本发明做任何限制，本发明的范围为权利要求所限定。
[0025]实施例子1:水稻叶片和穂颈稻瘟病菌的DNA的提取和验证。
[0026]具体实施的方法:
[0027]I)试剂:提前配制以下试剂，灭菌后备用:(I)UOOmM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3、)IM KCl、(4) ,10% Tween 20。
[0028]2)样品准备:随机分别选取从田间采集后室温保存于实验室的典型发病的15个叶片和穂颈，从发病的水稻叶片病斑上切取约2mmX2mm大小的发病叶片、从发病的穂颈上取l_2mm长的发病穂颈，分别放置于PCR-96孔板中，每孔放置一个样品，叶片和穂颈设置一个健康的水稻材料作为对照。
[0029]3)提取液配制及应用:将 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA (pH 8.0)和 IM KCl各取1.2mL等体积混合，然后加入3.6 μ L 10%的Tween 20，混合均匀后在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液，并盖上盖子。如果有样品漂浮，可用一次性吸头或灭菌的牙签将其压入液体中，即可进入下一步程序。
[0030]4) DNA制备:(I)如果样品仅有96个以内，将上述处理好的样品放入PCR仪，95°C加热处理lOmin，之后储存于-20摄氏度备用；(2)如果样品比较多，可将样品放入湿热灭菌锅，在105°C下处理1min后，取出样品放置于-20°C备用。
[0031]5)PCR反应:样品的PCR检测用2对PCR引物进行，一对是扩增病原真菌rDNA的ITS序列的通用引物，扩增片段大小为544bps，正向引物和反向引物序列分别为，ITSl:TCCGTA GGT GAA CCT GCG G，ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ;另外一对是用于检测稻瘟病菌无毒基因AvrPizt的引物，扩增大小为1186bps，正向引物和反向引物序列分别为，AvrPizt-1Fw:MG CGT CAC MA ATA TCA TCA AGT,AvrPizt-1Rv:CGG CTA CCA TCG AGA AMGTo PCR反应体系20 μ L，包含:2 X Taq MasterMix 10 μ L，正向引物及反向引物各I μ L，制备好的DNA模板I μ L，无菌双蒸水6 μ L。PCR扩增条件为:95°C预变性3min，然后进入35个循环的扩增反应，即95°C变性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循环结束后再延伸7min，然后将PCR产物放置于4°C ；PCR反应在ClOOO上进行(B1Rad)。
[0032]6)PCR产物检测:PCR产物每样品取5 μ L在1.2%琼脂糖凝胶上电泳染色检测。
[0033]实验结果:
[0034]如图1所示，利用感病叶片上的病斑提取的DNA进行扩增，成功用ITS1/ITS4引物对扩增出预期片段大小544bp的带；同样，利用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物对，成功扩增出预期片段大小1186bp的目标带；与从感病叶片提取的DNA相似，分别利用2对引物从穂颈提取的稻瘟病菌DNA中成功扩增出544bp和1186bp的目标片段。
[0035]从图1可以看出，M，分子量标记，DL2000 ;图1a指从感病叶片提取DNA后用ITSl/ITS4引物对扩增的结果，预期片段大小544bp，其中带1-15为感病叶片提取的DNA扩增结果，带16为健康叶片作空白对照，没有任何条带的扩增；图1b指从感病叶片提取DNA后用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物对扩增的结果，预期片段大小1186bp，其中带1_15为感病叶片提取的DNA扩增结果，带16为健康叶片作空白对照，没有任何条带的扩增；图1c指从感病穂颈提取DNA后用ITS1/ITS4引物对扩增的结果，其中带1_15为感病穂颈提取的DNA扩增结果，带16为健康穂颈作空白对照，没有任何条带的扩增；图1d指从感病穂颈提取DNA后用AvrPizt-lFw/AvrPizt-lRv引物对扩增的结果，预期片段大小1186bp，其中带1_15为感病穂颈提取的DNA扩增结果，带16为健康穂颈作空白对照，没有任何条带的扩增。
[0036]实施例子2:玉米叶片上玉米灰斑病菌的DNA的提取和验证。
[0037]具体实施的方法:
[0038]I)试剂:提前配制以下试剂，灭菌后备用:(I)UOOmM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3、)IM KCl、(4) ,10% Tween 20。
[0039]2)样品准备:随机分别选取从田间采集后室温保存于实验室的典型发病的2个叶片，从发病的玉米灰斑病病斑上切取约2mmX 2mm大小的发病叶片，分别放置于PCR-96孔板中，每孔放置一个样品。
[0040]3)提取液配制及应用:根据提取样品的数量，将10mM TrisHCl (pH8.7)、1mMEDTA (pH 8.0)和IM KCl各取500 μ L等体积混合，然后加入1.5 μ L 10%的Tween 20，混合均匀后在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液，并盖上盖子。如果有样品漂浮，可用一次性吸头或灭菌的牙签将其压入液体中。
[0041]4) DNA制备:(I)将上述处理好的样品放入PCR仪，95°C加热处理1min,之后储存于-20摄氏度备用。
[0042]5)PCR反应:样品检测用扩增病原真菌rDNA的ITS序列的I对通用引物进行，扩增片段大小约500bps，正向引物和反向引物序列分别为，ITSl:TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC JCR反应体系 20 μ L，包含:2XTaq MasterMix 10 μ L，正向引物及反向引物各I μ L，制备好的DNA模板I μ L，无菌双蒸水6 μ L。PCR扩增条件为:95°C预变性3min,然后进入35个循环的扩增反应，即95°C变性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循环结束后再延伸7min，然后将PCR产物放置于4°C ；PCR反应在ClOOO上进行(B1Rad)。
[0043]6)PCR产物检测:PCR产物每样品取5 μ L在1.2%琼脂糖凝胶上电泳染色检测。
[0044]实验结果:
[0045]如图2所示，利用感病叶片上的病斑提取的DNA进行扩增，成功用扩增真菌rDNA的ITS区段的I对引物(ITS1/ITS4)扩增出预期片段大小约500bp的玉米灰斑病菌的DNA带；
[0046]实施例子3:水稻叶片上水稻细菌性条斑病菌DNA的提取和验证。
[0047]具体实施的方法:
[0048]I)试剂:提前配制以下试剂，灭菌后备用:(I)UOOmM TrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3、)IM KCl、(4) ,10% Tween 20。
[0049]2)样品准备:随机分别选取从田间采集后室温保存于实验室的典型发病的2个叶片，从发病的水稻细菌性条斑病病斑上切取约2mmX2mm大小的发病叶片，分别放置于PCR-96孔板中，每孔放置一个样品。
[0050]3)根据提取样品的数量，将 10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA (pH 8.0)和 IM KCl各取500 μ L等体积混合，然后加入1.5 μ L 10 %的Tween 20，混合均匀后在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液，并盖上盖子。如果有样品漂浮，可用一次性吸头或灭菌的牙签将其压入液体中，即可进入下一步程序。
[0051]4) DNA制备:⑴将上述处理好的样品放入PCR仪，95°C加热处理lOmin，之后储存于-20摄氏度备用。
[0052]5) PCR反应:样品检测用扩增病原细菌16S rDNA的I对通用引物进行，扩增大小约
1.5kb，正向引物和反向引物分别及序列为，27F:AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG、1942R:ACGGCT ACC TTG TTA CGA CTT。PCR 反应体系 20 μ L，包含:2 X Taq MasterMix 10yL，正向引物及反向引物各I μ L，制备好的DNA模板I μ L，无菌双蒸水6 μ L。PCR扩增条件为:95°C预变性3min，然后进入35个循环的扩增反应，即95°C变性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循环结束后再延伸7min，然后将PCR产物放置于4°C ；PCR反应在ClOOO上进行(B1Rad)。
[0053]6)PCR产物检测:PCR产物每样品取5 μ L在1.2%琼脂糖凝胶上电泳染色检测。
[0054]实验结果:
[0055]如图3所示，利用感病叶片上的水稻细菌性条斑病的病斑提取的DNA进行扩增，成功用扩增细菌16S rDNA的I对通用引物(27F/1942R)扩增出预期片段大小约1.5kb的水稻细菌性表斑病菌的带。
[0056]我们通过比较实验，采用传统的提取方法，虽然也可以获得上述的结果，但是传统的方法费时、效率低、而且成本高，不利于大批量样品的操作。
[0057]通过以上的实验结果看出，利用本技术发明的方法，可成功从禾本科作物水稻和玉米感病组织中直接提取病原真菌和细菌的DNA用于分子检测分析，提取的DNA能有效扩增出超过1.5kb的DNA片段，可满足一般检测实验的需要。
[0058]通过本技术发明，实现了(I)DNA提取的简易化:可从禾本科作物水稻和玉米上利用极少量的感病组织直接一步提取病菌DNA，无需传统的多步处理，更加简易化；(2)DNA提取的高效化:由于仅一步处理即可完成DNA的提取，每人每天可完成500份以上病害标样的病原菌DNA提取，为病害的快速监测、检测与诊断提供了保障，而采用传统的方法，每人每天只能完成20-50份病害标样的病原菌DNA提取；(3)试剂成本低，集约化:采用本方法所使用的4种试剂均为实验室的常规试剂，价格便宜，购买方便，比商业购买的试剂盒要便宜80%以上的价格；(4)设备要求简单化:无特殊的仪器设备需求，常规实验室的PCR仪或高压灭菌锅即可满足实验。采用本方法可快速获得大量检测样品的DNA，为快速开展病原菌群体遗传多样性、病原菌无毒基因检测及新病害的快速分子诊断分析提供了重要技术支撑。
【权利要求】
1.一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法，该方法包括: (1)、提前分别配制以下四种试剂，灭菌后备用:(I)10mM TrisHCl (pH8.7)、(2) 1mMEDTA(pH 8.0)、(3) IM KCl 和(4) 10% Tween 20 ； (2)、采集待检测的禾本科作物感染病害的叶片或其它组织作为样品，从发病的禾本科作物的叶片病斑上切取约2mmX2mm大小的叶片放置于PCR-96孔板中； (3)、根据样品的数量，将步骤(I)中的10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA(pH8.0)和IM KCl各取适量等体积混合后，然后再根据3种混合液的总体积按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均勾后，在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液； (4)、将步骤(3)处理好的样品放入PCR仪，95°C加热处理lOmin，取出样品放置于_20°C备用，或将样品放入湿热灭菌锅，在105°C下处理lOmin，取出样品放置于-20°C备用。
2.根据权利要求1的方法，其中，PCR-96孔板可以被塑料试管或玻璃试管所代替。
3.一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法，该方法由以下步骤组成: 1)、提前分别配制以下四种试剂，灭菌后备用“1)、10mMTrisHCl (ρΗ8.7)、(2) UOmMEDTA (pH 8.0)、(3)、1M KCl 和(4)、10% Tween 20 ； 2)、采集待检测的禾本科作物感染病害的叶片或其它组织作为样品，从发病的禾本科作物的叶片病斑上切取约2mmX2mm大小的叶片放置于PCR-96孔板中； 3)、根据样品的数量，将步骤(I)中的10mM TrisHCl (pH8.7) UOmM EDTA(pH 8.0)和IM KCl各取适量等体积混合后，然后再根据3种混合液的总体积按1000:1的量加入10%的Tween 20 ;最后混合均勾后，在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100 μ L提取液； 4)、将上述处理好的样品放入PCR仪，95°C加热处理lOmin，取出样品放置于-20 V备用，或将样品放入湿热灭菌锅，在105°C下处理lOmin，取出样品放置于-20°C备用。
4.根据权利要求1或3所述的方法，当所述的禾本科作物为真菌或细菌引起的病害的时候，检测的方法如下，真菌病害:将提取感染病害的样品的DNA用检测真菌rDNA的ITS区段的I对通用引物进行PCR检测，扩增片段大小约500bps，正向引物和反向引物名称和序列分别为，ITSl:TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，ITS4:TCC TCC GCT TAT TGATAT GC;当禾本科为水稻叶片的稻瘟病菌DNA检测时，用检测稻瘟病菌无毒基因AvrPizt的特异引物进行，扩增片段大小为1186bps,正向引物和反向引物名称及序列分别为，AvrPizt-1Fw:AAGCGT CAC AAA ATA TCA TCA AGT, AvrPizt-1Rv: CGG CTA CCA TCGAGA AAA GT ;当禾本科为水稻叶片的细菌病害:将提取感染病害的样品的DNA用检测细菌16S rDNA的I对通用引物进行PCR扩增，扩增片段大小约1.5kb，正向引物和反向引物分别及序列为，27F: AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG、1942R:ACG GCT ACCTTG TTA CGA CTT ;PCR 反应体系 20 μ L，包含:2 X Taq MasterMix 10 μ L，正向引物及反向引物各I μ L (引物浓度10 μ Μ)，制备好的DNA模板I μ L，无菌双蒸水6 μ L ；PCR扩增条件为:95°C预变性3min，然后进入35个循环的扩增反应，即95°C变性30min，55°C退火30min，72°C延伸1.5min，循环结束后再延伸7min，然后将PCR产物放置于4°C。
5.根据权利要求1-4之一所述的方法，其中禾本科植物病害为水稻的稻瘟病，玉米的叶片上的玉米灰斑病或者水稻叶片上的水稻细菌性条斑病。
6.根据权利要求1-4之一所述的方法，其中禾本科作物组织样品为水稻叶片和穂颈上的稻瘟病病斑；玉米的叶片上玉米灰斑病病斑或者水稻叶片上水稻细菌性条斑病斑。
7.根据权利要求6所述的方法，当禾本科作物组织样品为水稻穂颈上的稻瘟病病斑时，从水稻穂颈上取l_2mm长的发病穂颈放置于所述的PCR-96孔板中。
【文档编号】C12N15/10GK104498474SQ201410674584
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月23日 优先权日:2014年11月23日
【发明者】董丽英, 杨勤忠, 刘树芳, 徐鹏, 李静 申请人:云南省农业科学院农业环境资源研究所