一种植物渗透胁迫诱导型启动子及其应用的制作方法

一种植物渗透胁迫诱导型启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种启动子，其序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。此启动子可应用在培育转基因植物上，首先利用此启动子和目的基因构建重组表达载体，然后利用此重组表达载体侵染转化体，再利用此转化体转化目的植物，经检测获得含有所述启动子和目的基因的转基因植物。本发明的启动子具有渗透胁迫诱导特性，因此可以用来连接抗逆相关目的基因，在植物受到渗透胁迫时启动抗逆相关目的基因的表达，提升植物应对逆境胁迫的能力，为植物抗逆基因工程提供了强有力的工具。
【专利说明】一种植物渗透胁迫诱导型启动子及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体是一种来源于小麦的渗透胁迫诱导型启动子及 其应用。

【背景技术】
[0002] 基因转录是遗传信息传递过程中第一个具有高度选择的环节，基因转录的调控是 研究这一高度选择性的本质和基础。基因转录的调控元件主要有顺式作用元件和反式作用 因子。真核基因的顺式作用元件按照功能可以分为启动子、增强子以及负调控元件沉默子。 启动子通过对外部环境、刺激物等诱导做出应答，参与组织特异性的选择、控制基因的时空 表达、保持基因的基础水平表达等，维持细胞的生长、分化、发育、运动、新陈代谢等生命活 动，因此，启动子在细胞生命活动中具有极其重要的意义。
[0003] 植物启动子按其转录方式可分为组成型、组织特异型和诱导型启动子。目前，在 植物基因工程中使用最广泛的组成型启动子是烟草花叶病毒（CaMV) 35S启动子、根癌农杆 菌Ti质粒的胭脂碱合成酶基因启动子（Nos)和章鱼碱合成酶基因启动子（Ocs)。此外，水 稻Actl启动子和玉米泛素蛋白启动子序列结构研究得比较深入，在单子叶植物转基因中 应用较多。组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异性持续、高效的表达造成能 量和物质浪费，而在需要该基因大量表达的特定组织部位则因表达量过低又达不到预期效 果。因此，克隆和应用受环境诱导的组织特异表达的启动子是植物基因工程研究的重点和 难点。与组成型启动子相比，诱导型启动子仅在特定外界环境因素刺激下，才启动外源基因 的表达，从而避免或减轻由组成型启动子启动外源基因超表达给植物的新陈代谢和生长发 育带来的负面作用。
[0004] 环境胁迫，如干旱和高盐，是影响植物生长和物种分布、限制作物产量提高的重要 因素之一。利用生物工程培育抗干旱和盐害植物，不仅需要抗逆基因，而且更需要逆境胁迫 诱导型启动子。逆境胁迫诱导型启动子使抗逆基因在特定时间和空间表达，不仅能够提高 植物的抗逆性，同时可避免抗逆基因组成型表达给植物带来的负面影响。干旱和盐害均对 植物造成渗透胁迫，导致植物生长发育受阻，引起多种生理生化过程发生变化。渗透胁迫诱 导型启动子启动抗逆基因的表达，可以提高和改善植物在渗透胁迫下的新陈代谢和生长发 育，从而提高植物的抗逆性。


【发明内容】

[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种植物渗透胁迫诱导型启动子，解决目前抗 逆分子育种过程中，因使用组成性启动子使得外源基因持续大量表达，从而破坏植物的代 谢平衡、阻碍植物正常生长发育的问题。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0007] -种启动子，其序列为如下1)、2)或3):
[0008] 1)序列表中SEQ ID NO :1所示的序列；
[0009] 2)由1)限定的DNA序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所衍生的，且 具有启动子功能的DNA序列；
[0010] 3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA序列。
[0011] 扩增上述启动子的引物对，一条引物如序列表中的SEQ ID NO :2所示，另一条引物 如序列表中的SEQ ID NO :3所示。
[0012] 含有上述启动子的重组表达载体、重组转化体、转基因细胞系或表达盒。
[0013] 作为本发明的一种优选技术方案，构建含所述重组表达载体使用的初始载体为 pAHC15、pAHC18、pAHC25、pCAMBIA0390、pCAMBIA2201、pCAMBIA3301、pBI 121 或其它衍生植 物表达载体。
[0014] 作为本发明的一种优选技术方案，所述表达盒由序列表中SEQ ID NO :1所示的启 动子、目的基因序列和一个终止子序列构成。进一步的，所述目的基因序列为与植物抗逆相 关的基因序列；所述终止子序列采用NOS终止序列或35S终止序列。
[0015] 上述启动子在培育转基因植物中的应用。
[0016] 上述启动子在培育转基因植物中的应用方式为：利用所述启动子培育在渗透胁迫 条件下表达抗逆相关目的基因的转基因植物。进一步的，首先利用所述启动子和目的基因 构建重组表达载体，然后利用此重组表达载体侵染转化体，再利用此转化体转化目的植物， 经检测获得含有所述启动子和目的基因的转基因植物。
[0017] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明的启动子来源于小麦 (Triticum aestivum)Dehydrin(TaDehl)基因，其具有渗透胁迫诱导特性，因此可以 用来连接抗逆相关目的基因，在植物受到渗透胁迫时启动抗逆相关目的基因的表达， 提升植物应对逆境胁迫的能力。通过农杆菌把含有本发明启动子的重组表达载体 pCAMBIA1381Z-TaDehlpr〇-GUS转化拟南芥，阳性转基因拟南芥植株在渗透胁迫下⑶S基因 表达明显提高，证明本发明的TaDehlpro启动子可实现目的基因在转基因植株中的渗透诱 导表达，从而为植物抗逆基因工程提供了强有力的工具。

【专利附图】

【附图说明】
[0018] 图1为实施例1中石麦15TaDehl基因渗透胁迫处理后表达量变化图，A为叶片，B 为根；描述石麦15小麦幼苗经16% PEG8000处理后根和叶片中TaDehl基因表达模式，分 别于0、1、3、6、9、12、24、48小时取材；采用实时荧光定量PCR的方法，小麦Actin基因作为 内参。
[0019] 图2显示实施例3中pDehlpro :⑶S重组表达载体图谱。
[0020] 图3显示实施例3中，转化pDehlpro :GUS的转基因拟南芥的⑶S染色结果； A, 1/2MS 培养基；B, 300mmol/L Mannitol ;C, 16% PEG8000。

【具体实施方式】
[0021] 以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种试剂及各项设备均为常规市 售产品，均能够通过市场购买直接获得。
[0022] 实施例1石麦15渗透胁迫诱导表达基因 TaDehl的表达分析
[0023] I. 1材料处理
[0024] 精选石麦15种子在光照培养箱中用自来水培养至二叶一心期，培养温度 22± I °C，每天光照14h。选取生长发育一致幼苗20?25株置培养皿中，20 %聚乙二醇 (PEG8000)处理，取样期间保持全天光照，分别于0，1，3，6，9，12，24，48h取叶片和根系，液 氮速冻后于_70°C冰箱保存；试验设置3个重复。
[0025] 1.2小麦总RNA提取
[0026] 采用RNAiso Plus(TaKaRa)提取石麦15根和叶片总RNA，用无 RNase的DNase I (TaKaRa)去除总RNA中残留的DNA。
[0027] I. 3cDNA第一链的合成
[0028] 米用 PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)进行第一链 cDNA 合成。
[0029] 1. 4定量PCR反应
[0030] 1)以一链 cDNA 为模板，采用 SYBRi5 Premix Ex Taq? II(TaKaRa)进行实时荧光 定量PCR反应。反应引物：
[0031] DehlF :5，-CACCAGGAATCACTAGACGCAC-3，（SEQ ID NO :4);
[0032] DehlR :5，-CAAATGAGCTGAAATCACGAAAG-3，（SEQ ID NO :5);
[0033] ActinF :5，-TGCTATCCTTCGTTTGGACCTT-3' (SEQ ID NO :6);
[0034] ActinR ：5' -AGCGGTTGTTGTGAGGGAGT-Si (SEQ ID NO :7);
[0035] 2) PCR 反应按照 TaKaRa SYBRii Premix Ex Taq? II 试剂盒说明进行。PCR 扩增 程序为：951：2111丨11;951：3〇8,591：3〇8,721：3〇8,4〇个循环。以小麦0-3(^丨11基因作为内 参，反应在ABI Prism7500荧光定量PCR仪上运行，3次重复。采用2 - Λ Λ Ct法进行定 量分析。
[0036] 参看附图1，定量PCR结果表明，渗透胁迫下，TaDehl基因在小麦幼苗根和叶片中 的表达模式不同，叶中表达量大大高于根中。渗透胁迫后，叶片中TaDehl基因表达量显著 升高，在24h时表达量达到峰值，提高200倍以上；而在根中TaDehl基因表达量虽有所提 高，但明显低于叶片中，在48h表达量达到峰值，提高约60倍。这说明，TaDehl基因为渗透 胁迫诱导表达基因，其启动子可能为渗透胁迫诱导型启动子。
[0037] 实施例2石麦15渗透胁迫诱导表达基因 TaDehl启动子的克隆
[0038] 2. 1石麦15BAC混合池质粒提取
[0039] 按照分子克隆指南配制BAC混合池质粒提取试剂，质粒提取按以下步骤进行。
[0040] I) 50ml离心管收集菌液2次，IOOOOrpm 4°C离心5min，去上清；
[0041] 2)加入预冷的溶液I 6ml振荡混匀；
[0042] 3)加入溶液II 6ml，上下颠倒混勻，室温放置5min ;
[0043] 4)加入预冷溶液III 6ml，上下颠倒混匀，冰上放置IOmin ;
[0044] 5) 12, OOOrpm 4?离心 IOmin ;
[0045] 6)取上清，加入0· 8倍体积异丙醇，室温放置20min ;
[0046] 7) 12, OOOrpm 4°C离心 IOmin ;
[0047] 8)去上清，加入75%乙醇洗涤沉淀；
[0048] 9) 12, OOOrpm 4?离心 IOmin ;
[0049] 10)去上清，空气干燥，加 ddH20溶解；
[0050] 11)加入 RNaseA 37?放置 30min ;
[0051] 12)0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测质量及浓度。
[0052] 2. 2石麦15BAC文库筛选
[0053] 石麦15基因组BAC文库由石家庄市农林科学研究院和山东省农业科学院合作构 建完成。该文库由1000000个以上克隆组成，保存在1020个混合池中，克隆插入片段平均 大小为85kb，空载率为2. 5%。
[0054] 石麦15文库筛选PCR引物根据小麦TaDehl基因序列设计，嵌套引物序 列：上链 5'-GGTCGTGTTCCAAGAAACC-3'（SEQ ID NO :8);和 5'-GTTCCAAGAAACCAAAA TGG-3'（SEQ ID N0:9);，下链 5'-ACATGCGTCTAGTGATTCCTG-3'（SEQ ID N0:10); 和 5'-AGCAAAGTAAATTAAGCGCC-3'（SEQ ID NO :11)。PCR 扩增程序：94 °C 3min ； 94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 45s，30 个循环；72 °C 5min。TaqPolymerase 为 2XTaq PCR StarMix(GenStar)。使用嵌套引物筛选石麦15BAC文库，获得阳性混合池3个（pool269、 pool338和pool501)。PCR产物克隆测序结果表明，3个混合池中TaDehl基因序列一致。通 过对混合池 P〇〇1269进一步筛选，分离出含有TaDehl基因的BAC单克隆。
[0055] 2. 3启动子序列克隆
[0056] BAC单克隆送Invitrogen公司，根据BAC单克隆质粒上已知TaDehl基因序列设 计引物，采用primer walking测序获得DNA序列3846bp。注释结果表明，该序列含有完整 TaDehl基因编码区和2313bp 5' -侧翼序列。根据TaDehl基因5' -侧翼序列设计特异引物， 上链引入BamHI酶切位点，下链引入Hi dll I酶切位点，引物序列为：上链5' -CGGGATCCGTG CGTGTCGGAAGAACTC-3，（SEQ ID NO : 2)，下链 5，-CCAAGCTTTGGAACACGACCTGGAATC-3' (SEQ ID NO :3)。PCR 扩增程序：98°C Imin ;98°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min，30 个循环；72°C 5min。 Taq 酶为PrimeSTAR? HS DNA Polymerase(TaKaRa)
[0057] 2. 4PCR扩增产物的检测与回收
[0058] PCR扩增产物经I %的琼脂糖凝胶电泳分离，得到1条与设计扩增长度相一致的约 I. 6kb的电泳条带。采用GenStar琼脂糖凝胶回收试剂盒回收扩增条带。
[0059] 2. 5PCR产物的克隆与测序
[0060] 2. 5. IPCR产物的克隆
[0061] PCR产物为平末端产物，与载体连接前需要加 A15PCR产物加 A采用DNA A-Tailing Kit (TaKaRa)。克隆米用 pMD18_T simple vector (TaKaRa)。
[0062] 2· 5· 2连接产物的转化
[0063] 连接产物转化采用热激法，步骤如下：
[0064] I) DH5 α感受态细胞冰浴解冻，加入5 μ 1连接产物，混匀，冰浴30min ;
[0065] 2) 42°C水浴热激90s，迅速置于冰上3min ;
[0066] 3)向转化液加入SOC培养基1ml，37°C 200rpm复苏45min。
[0067] 4)将适量复苏后的转化液涂于LB选择培养基上，于37°C倒置培养16_18h。
[0068] 2. 5. 3重组质粒的鉴定
[0069] 首先通过菌液PCR方法筛选含有插入片段的阳性克隆；采用质粒小量提取试剂盒 (GenStar)提取质粒，使用BamHI和HidIII对含有插入片段的克隆进行酶切鉴定。酶切鉴 定符合预期的阳性克隆送Invitrogen公司测序。测序结果表明，插入片段1638bp(SEQ ID NO : I)，与BAC单克隆测序结果一致。
[0070] 实施例3渗透胁迫诱导表达基因 TaDehl启动子表达载体（pTaDehlpro :⑶S)的构 建
[0071] 分别用BamHI和HidIII酶切pCAMBIA1831Z载体和含有TaDehl启动子的pMD18-T simple vector,分别回收pCAMBIA1831Z载体大片段和TaDehlpro的酶切片段，T4DNA连接 酶（NEB)连接后转化DH5a感受态细胞，通过BamHI和HidIII酶切和测序对构建的启动子 表达载体进行验证；pDehlpro :⑶S表达载体图谱见图2。
[0072] 3. lpCAMBIA1831Z 载体和含有 TaDehlpro 的 pMD18-T simple vector 的 BamHI 和 HidIII酶切
[0073] 质粒提取采用GenStar质粒小量提取试剂盒。质粒37°C水浴酶切消化3hr，琼脂 糖凝胶电泳回收含有TaDehlpro的酶切产物及pCAMBIA1391Z载体大片段，估测浓度。
[0074] 3. 2酶切产物的连接
[0075] 使用T4DNA连接酶（NEB)连接pCAMBIA1831Z载体大片段及TaDehlpro的酶切片 段，连接体系中二者比例为1 :8(摩尔比），16°C水浴连接过夜。
[0076] 3. 3连接产物的转化
[0077] 连接产物转化使用热激法转化DH5 α感受态细胞，涂布在含有卡那霉素（50 μ g/ ml)的LB平板，37°C过夜培养。
[0078] 3. 4重组子鉴定
[0079] 挑取单克隆37°C摇菌过夜，提取质粒，BamHI和HidIII酶切验证，最后测序检出正 确的重组子（pTaDehlpro :⑶S)。
[0080] 4农杆菌感受态的制备与转化
[0081] 4. 1农杆菌感受态的制备
[0082] 从新鲜YEB(5g/L Tryptone ;lg/L Yeast extract ;5g/L Sucrose ;0· 5g/L MgSO4 ; 琼脂15g/L ;50mg/L利福平）平板上挑取农杆菌GV3101的单菌落，接种于5ml液体YEB培 养基（含50mg/L利福平）中，28°C 250rpm振摇培养过夜；取Iml菌液接种于50ml液体 YEB培养基（含50mg/L利福平）中扩大培养，28°C 250rpm振摇培养至0D600为0· 6-0. 8 ; 冰浴3011^11，41：5000印111离心101^11收集菌体，重悬浮于101111预冷的10%甘油中；再次 4°C 5000rpm离心IOmin收集菌体，重悬于Iml预冷的10%甘油中，按100 μ 1/管分装；液 氮速冻后，放于-70°C冰箱保存。
[0083] 4. 2农杆菌转化
[0084] 1) 100 μ I GV3101感受态细胞冰浴解冻，加入2 μ 1重组质粒，混匀，冰浴45min ;
[0085] 2)液氮速冻 Imin ;
[0086] 3)37。(：水浴311^11;
[0087] 4)加入Iml YEB液体培养基，28°C 200rpm恢复培养3h。
[0088] 5)取20 μ 1农杆菌转化液涂布于YEB固体平板（含50mg/L利福平，50mg/L卡那 霉素）上，28°C培养2-3d。挑取单菌落，28°C摇菌。PCR鉴定阳性转化子。
[0089] 5拟南芥转化
[0090] 5. 1拟南芥培养
[0091] 称取一定数量的拟南芥种子（Columbia-0)，加入适量水，避光4°C春化2-3天。蛭 石与营养土按体积比1 :1比例混合，分装到花盆中，土层表面撒上薄薄的一层蛭石以抑制 真菌的生长，加水使土充分润湿。用100 μ 1移液器播种，每盆大约12-18粒。保鲜膜密封 花盆，培养室中培养（22°C，16h光照；16°C，8h黑暗），托盘中的水量以保持湿润为准。待幼 苗出土两片子叶充分展开后，揭去保鲜膜。约3周后拟南芥抽出初生苔，剪去初生苔以便使 其抽出更多的次生苔，以便增加花的数量。待次生苔上长出一定数量的花蕾（尚未绽开） 后用于拟南芥的转化。转化前1天将拟南芥苗浇透。
[0092] 5. 2转化用农杆菌菌液的制备
[0093] 取PCR检测正确的农杆菌菌液5 μ 1接种于5ml YEB (50mg/L，50mg/L利福平）液 体培养基中，28°C，250rpm培养30h。菌液按I :400转接到300mlYEB液体培养基中，28°C， 250rpm培养14h至0D6001. 5-2. 0。7000rpm，4°C离心15min收集菌液，重悬菌体于2倍体积 的转化渗透液中（1/2MS+1. 5% Sucrose，6-BA :0· 01mg/L，VBl :10mg/L，VB6 :lmg/L，Silwet L-77 ：0. 02% ) 〇
[0094] 5. 3渗透转化
[0095] 将拟南芥倒置，使花蕾朝下并浸入渗透液中，保持5min(长势强5min，长势弱 3min)。转化后的植株平放，盖好保鲜膜。低光强度下生长24-48h后置于正常光照条件下 生长，直到开花结荚收集种子。
[0096] 5. 4抗性鉴定
[0097] 称取25-30mg拟南芥种子于I. 5ml离心管中，10%次氯酸钠消毒lOmin，灭菌 水冲洗去除次氯酸钠，加水混匀将种子均匀撒在1/2MS(潮霉素20mg/L)固体平板上 (1/2MS+0.8%琼脂）。避光4°C春化2-3天。
[0098] 5. 4转基因植株的PCR检测
[0099] 具有潮霉素抗性的幼苗在抗性平板上正常生长呈绿色，根发育正常；非抗性幼苗 虽也呈绿色，但植株较小且无根。平板上的绿苗长至4个叶片时移至土中，盖上保鲜膜保水 3d后揭去。幼苗长至8-10个叶片且较健壮时，剪取叶片提取基因组DNA，进行PCR检测。采 用同样方法筛选，直至获得T 3种子。
[0100] 5. 5⑶S组织化学染色
[0101] 1)材料处理
[0102] 转基因拟南芥苗于抗性平板生长7天后，取生长一致幼苗，分别于1/2MS培养基、 10% Mannito(l/2MS培养基配制）、16% PEG8000(1/2MS培养基配制）在培养室中处理 12h(22°C，16h 光照；16°C，8h 黑暗）。
[0103] 2)染色
[0104] 用不含X-Gluc的⑶S染色液洗涤转基因拟南芥植株后，转移到1.5ml离心 管中，加入适量⑶S染色液浸没全部植株，37 °C保温8h，然后去除染色液，用95%乙醇 37°C脱色2-3h，组织染色完毕后保存于75%乙醇中，4°C储存。样品用变倍体视显微镜 (Nikon SMZ1000)观察，并用数码相机（Nikon DXM1200F)拍照（图3)。⑶S染色液的配 方为：100mM 磷酸钠缓冲液 pH7.0, IOmM Na2EDTA，0.1 % (V/V)Triton X-100,0.5mg/ml X-Gluc (5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）（用DMF配制），ImM铁氰化钾，ImM亚铁氰化钾。
[0105] 染色结果显示，1/2MS培养基、10% Mannitol和16% PEG8000处理的拟南芥幼苗 在子叶和茎中均能观察到显示⑶S活性的蓝色。与在1/2MS培养基生长的拟南芥幼苗相比， 10% Mannitol和16% PEG8000处理均导致拟南芥幼苗子叶和茎的蓝色显著加深（图3)。 转基因拟南芥渗透胁迫处理表明，TaDehlpro存在组成型表达，但渗透胁迫处理能够显著提 高其表达量，因此，TaDehlpro为渗透胁迫诱导型启动子，这与利用石麦15进行的定量PCR 分析结果一致。
[0106] 上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一 限制条件。
【权利要求】
1. 一种启动子，其序列为如下1)、2)或3): 1) 序列表中SEQ ID NO :1所不的序列； 2) 由1)限定的DNA序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所衍生的，且具有 启动子功能的DNA序列； 3) 在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA序列。
2. 扩增权利要求1所述启动子的引物对，一条引物如序列表中的SEQ ID NO :2所示， 另一条引物如序列表中的SEQ ID NO :3所不。
3. 含有权利要求1所述启动子的重组表达载体、重组转化体、转基因细胞系或表达盒。
4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，构建含该重组表达载体使用的 初始载体为 pAHC15、pAHC18、pAHC25、pCAMBIA0390、pCAMBIA2201、pCAMBIA3301、pBI 121 或 其它衍生植物表达载体。
5. 根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，该表达盒由序列表中SEQ ID NO :1所 示的启动子、目的基因序列和一个终止子序列构成。
6. 根据权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述目的基因序列为与植物抗逆相关 的基因序列；所述终止子序列采用N0S终止序列或35S终止序列。
7. 权利要求1所述启动子在培育转基因植物中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：利用所述启动子培育在渗透胁迫条件下 表达抗逆相关目的基因的转基因植物。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：首先利用所述启动子和目的基因构建重 组表达载体，然后利用此重组表达载体侵染转化体，再利用此转化体转化目的植物，经检测 获得含有所述启动子和目的基因的转基因植物。
【文档编号】C12N15/82GK104388433SQ201410733957
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】李孟军, 郭进考, 李亚青, 史占良, 高欣娜, 张楠 申请人:石家庄市农林科学研究院