氢离子转运无机焦磷酸酶基因表达差异在番茄耐盐性上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种氢离子转运无机焦磷酸酶基因表达差异在番茄耐盐性上的应用，它是以5-6叶番茄苗为材料，取番茄植株第一片成熟叶。离体叶片用蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗1次，叶片用剪刀剪成长方形，然后用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干水分。选择化学纯的5%NaCl，处理时间为6min。本发明提取盐胁迫后2min的离体叶片RNA，通过实时定量PCR，耐盐性强的番茄基因型H+-PPase基因表达量增强，耐盐性弱的表达量变化很小。通过H+-PPase基因表达差异，比较番茄耐盐大小。本方法在基因水平上揭示番茄耐盐潜力，对于培育抗逆性提高的番茄及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义。
【专利说明】氢离子转运无机焦磷酸酶基因表达差异在番茄耐盐性上的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及氢离子转运无机焦磷酸酶(H+-PPase)基
因表达差异在番茄耐盐性上的应用。更具体地说是一种利用H+-PPase基因表达差异检测番茄耐盐性的检测方法。
【背景技术】
[0002]随着人类社会的发展，人们对土地不断开发利用，致使土壤次生盐溃化程度日益加重。作为主要的蔬菜作物之一，番茄的耐盐性研究引起人们高度重视，相关研究已逐渐展开和深化。但因涉及到的参数和指标包括形态、生物量和生理生化等多个方面，加上鉴定时期也各不相同，故目前尚未形成统一的方法和标准用于番茄耐盐性鉴定。番茄耐盐性鉴定方面的研究主要两种，一种是形态鉴定，地上部鲜重、根鲜重、地上部干重、根干重、壮苗指数、根/冠比作为幼苗期耐盐鉴定指标；其次是生理生化指标，主要有脯氨酸、可溶性糖、丙二醛、相对叶绿素含量(SPAD)、SOD活性、POD活性等。番茄耐盐性的遗传规律还不是很清楚，控制耐盐基因的遗传定位也有待于深入研究，特别是还没有找到能对番茄耐盐性进行可靠、高效的鉴定方法。半定量RT-PCR技术是研究植物的基因表达水平变化的一项重要技术，根据PCR扩增产物的量可以确定目标基因的表达水平。RT-PCR为反转录RCR(reversetranscript1n PCR)和实时PCR (real time PCR)共同的缩写。反转录PCR是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
[0003]H+-PPase是定位于植物液泡膜上的一种H+转运蛋白，它水解ppi为pi的同时能将H+从细胞质跨过液泡膜泵入植物液泡中，从而起到酸化液泡、维持跨液泡膜H+梯度的作用。近几年，此酶在植物抵御盐胁迫和调节植物生长方面的功能中逐步被认识，并广泛应用。
[0004]本研究以番茄为材料，通过Real-time PCR技术对番茄盐胁迫时H+-PPase基因的表达差异性分析，鉴定番茄耐盐性。其目在于针对目前还没有找到能对番茄耐盐性进行可靠、高效的鉴定方法，从基因水平上区分耐盐性不同的番茄基因型，为培育抗逆性提高的番茄及其他植物新品种提供行之有效的检测方法。
【发明内容】
[0005]本发明目的是利用盐胁迫时离体叶片中H+-PPase (氢离子转运无机焦磷酸酶)基因的表达差异来检测番茄的耐盐性。
[0006]为实现上述目的，本发明通过以下方法予以实现:
一种用于番茄耐盐性测定的特异性引物，它具有SEQ ID NO: 1-2所示的核苷酸序列: it-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca。
[0007]本发明进一步公开了采用特异性引物进行番茄耐盐性测定的方法，其特征在于按如下的步骤进行:
(1)以5-6叶番茄苗为材料，取番茄植株第一片成熟叶，离体叶片用蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗I次，叶片用剪刀剪成I X 2cm大小的长方形，然后用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干水分；
(2)选择化学纯的NaCl，5-8%(w/w)，处理时间为2_6min，提取叶片总RNA ;优选NaCl，5% (w/w),处理时间为2min。
[0008](3)将得到的cDNA溶液用于下一步PCR扩增；
(4) Real-time PCR
引物设计:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反应体系:
模板:3ul 引物(0.4ηΜ):2ul All-1n-one:10ul MOX:0.4ul 水:2.6ul
其中所述的取番茄植株第一片成熟叶指的是从上往下数的第一片成熟叶。
[0009]本发明更进一步公开了番茄耐盐性的测定方法在不同基因型番茄苗耐盐性方面的应用。实验结果表明:植物在受到各种逆境危害时，膜的功能首先受到影响，通过膜上H+-PPase基因表达能快速准确地比较不同基因型的耐盐性。采用本发明的方法可以解决鉴定番茄耐盐性受环境和植株大小等多方面影响的问题。可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提闻优良耐盐基因型的筛选效率，加速耐盐植物育种的步伐。
[0010]耐盐能力不同的番茄基因型，盐胁迫下离体叶片中H+-PPase基因表达有很大的差异，耐盐性强的番茄基因型H+-PPase基因表达量增强，耐盐性弱的表达量变化很小。通过H+-PPase基因表达差异，比较番茄耐盐大小。
[0011]本发明更加详细的制备方法描述如下:
以5-6叶番茄苗为材料，取番茄植株第一片成熟叶(从上往下数)。离体叶片用蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗I次，叶片用剪刀剪成I X 2cm大小的长方形，然后用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干水分。选择化学纯的NaCl，溶液浓度一般以5%为宜。处理时间为6min。叶片胁迫时间过长RNA降解严重，提取困难。本发明是通过RT-PCR技术比较盐胁迫下离体叶片中H+-PPase基因在不同基因型中的表达差异。耐盐性强的番茄基因型H+-PPase基因表达量增强，耐盐性弱的表达量变化很小。通过H+-PPase基因表达差异，比较番茄耐盐大小。
[0012]本发明公开的番茄叶片耐盐性的检测方法与现有技术相比所具有的积极效果在于:
Cl)发明提取盐胁迫时番茄叶片的RNA，通过RT-PCR技术，可以检测很低拷贝数的RNA，非常灵敏。
[0013](2)杜绝了通过番茄形态、生物量和生理生化等受环境和植株大小等多方面的影响。可以有效地压缩田间试验的规模，节约时间和人力，大幅度提高优良耐盐基因型的筛选效率，加速耐盐植物育种的步伐。
[0014](3)利用本方法检测番茄耐盐性，只需要提供一片成熟叶即可，不需要整个植株，大大减少了工作量，方便快捷。
[0015]【专利附图】
【附图说明】:
图1盐胁迫下H+-PPase基因表达差异；其中1-4为LA2711，l:0min，2:2 min, 3:4min, 4:6min。5-8 为 JF544, 5:Omin, 6:2 min, 7:4 min, 8:6min。
[0016]M:marker 自上而下为:100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
[0017]
【具体实施方式】
下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用到的耐盐番茄LA2711和不耐盐的天津地方品种津粉544番茄苗均由市售。
[0018]实施例1
1、耐盐番茄LA2711和不耐盐的天津地方品种津粉544 5_6叶番茄苗为材料，取番茄植株第一片成熟叶(从上往下数)。离体叶片用蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗I次，叶片用剪刀剪成lX2cm大小的长方形，然后用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干水分。离体叶片在5% (w/w)氯化钠溶液中经过0，2，4，6min胁迫后，提取叶片总RNA，进行I %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0019]2、利用北京全式金生物技术有限公司的Transcript First-Strand cDNASynthesis SuperMix进行反转录,得到的cDNA溶液用于下一步PCR扩增。
[0020]3、Real-time PCR 引物设计:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反应体系:
模板:3ul 引物(0.4ηΜ):2ul All-1n-one:10ul MOX:0.4ul 水:2.6ul。
[0021 ] 反应结束后，对PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。以耐盐番茄LA2711和不耐盐的天津地方品种津粉544的离体叶片为材料，在5%氯化钠溶液中胁迫不同时间，H+-PPase基因在LA2711对照叶片中没有表达，盐胁迫2min后表达急剧增强，4min后降低；而在JF544的叶片中H+-PPase基因表达不明显。因此离体叶片在5%氯化钠溶液中胁迫2min，H+-PPase基因表达差异可以区分不同基因型番茄耐盐性。
[0022]实施例2
采用特异性引物进行番茄耐盐性测定的方法，其特征在于按如下的步骤进行:
(I)以5-6叶番茄苗为材料，取番茄植株第一片成熟叶，指的是从上往下数的第一片成熟叶。离体叶片用蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗I次，叶片用剪刀剪成I X 2cm大小的长方形，然后用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干水分；(2)选择化学纯的NaCl，5%(w/w)，处理时间为2min，提取叶片总RNA ;
(3)将得到的cDNA溶液用于下一步PCR扩增；
(4)Real-time PCR引物设计:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct getReverse: cac gcacggtggt cttctcttcaReal-time PCR 反应体系:
模板:3ul引物(0.4ηΜ):2ulAll-1n-one:10ulMOX:0.4ul水:2.6ul。
【权利要求】
1.一种用于测定番茄耐盐性的特异性引物，它具有SEQ ID NO: 1-2所示的核苷酸序列:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物进行番茄耐盐性测定的方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)以5-6叶番茄苗为材料，取番茄植株第一片成熟叶，离体叶片用蒸馏水冲洗3次，去离子水冲洗I次，叶片用剪刀剪成I X 2cm大小的长方形，然后用去离子水冲洗3次，吸水纸吸干水分； (2)选择化学纯的NaCl，5-8%(w/w)，处理时间为2_6min，提取叶片总RNA ; (3)将得到的cDNA溶液用于下一步PCR扩增；
(4)Real-time PCR
引物设计:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反应体系: 模板:3ul 引物(0.4nM):2ul All-1n-one:1ul MOX:0.4ul 水:2.6ul。
3.权利要求1所述番茄耐盐性的测定方法，其中所述的取番茄植株第一片成熟叶指的是从上往下数的第一片成熟叶。
4.权利要求1所述番茄叶片耐盐性的测定方法，其中所述的NaCl，5%(w/w)，处理时间为 2min。
5.权利要求1所述番茄叶片耐盐性的测定方法可在不同基因型番茄苗耐盐性方面应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104450906SQ201410734091
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月8日 优先权日:2014年12月8日
【发明者】郏艳红, 王姝, 宋建, 吉利柱 申请人:天津市农业生物技术研究中心