一种检测鼠痘病毒的荧光定量pcr方法及其专用引物对、探针和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测鼠痘病毒的荧光定量PCR方法及其专用引物对、探针和试剂盒。所述引物对的碱基序列为：上游引物：5’-ACAAGGGGTTGGGTGTAAGA-3’；下游引物：5’-GCGTGCTAGTGGTTGCATTA-3’；所述探针的碱基序列为：5’-R-ACCAAACTGGGTAGACGATGT-Q-3’；其中，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。本发明的荧光定量PCR引物对和探针具有极强的特异性，仅能扩增出鼠痘病毒中ERPV_027基因的特异性片段；并且对鼠痘病毒的检测限为21.7×10-8ng/μl，大大提高了检测灵敏性。
【专利说明】-种检测鼠痘病毒的荧光定量PCR方法及其专用引物对、 探针和试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物病毒检验检疫【技术领域】，具体涉及一种检测鼠痘病毒的荧光定量 PCR方法及其专用引物对、探针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鼠痘（mouse pox)是由鼠痘病毒（mouse poxvirus, MPV)引起的实验小鼠的一种 烈性传染病。本病多呈爆发性流行，致死率较高，常造成全群淘汰，危害极大。临床表现以 四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征，故又称脱脚病（Ectromelia，Ect)。
[0003] 鼠痘病毒在分类上属于痘病毒科，脊索动物痘病毒亚科，正痘病毒属。核酸型为双 股DNA，病毒粒子呈卵圆形或砖型，直径170-250nm。其基因组序列与天花病毒有很大的相 似性，因此中华人民共和国《药典》规定对鼠源性生物制品必须检测鼠痘病毒，《实验动物微 生物学等级及监测》国家标准规定实验小鼠必须排除鼠痘病毒。
[0004] 鼠痘病毒的感染一般分为急性感染、慢性感染、潜伏感染。其中，急性感染、慢性感 染均较易发现，而潜伏感染鼠痘的小鼠外表健康，没有任何临床症状，病毒基因存在于一定 的组织或细胞中，并不产生感染性病毒，按目前常规血清学抗体检测方法一般不易检出，当 在某些条件下病毒被激活后而出现急性发作。因此潜伏性感染的小鼠群难以及时发现，危 害性大。所以，加强检测力度，改进检测方法应引起普遍重视。
[0005] 目前鼠痘病毒的血清学检测方法主要为酶联免疫吸附试验，可以检出过去感染过 鼠痘或近期感染而幸存的动物。但该方法对能产生抗DNA抗体的小鼠血清会出现假阳性， 且不能鉴别痘苗病毒免疫抗体和MPV感染所产生的抗体。
[0006] 随着分子生物学技术的快速发展，近年来聚合酶链反应（PCR)技术越来越多地用 于实验动物疾病检测。1998年国内首次报道用聚合酶链反应（PCR)技术检测鼠痘病毒， 该检测方法是利用正痘病毒能产生血凝素的特点，根据正痘病毒属基因保守区设计一对引 物：
[0007] EAC1 :5' -ATG ACA CGA TTG CCA ATAC-3,；
[0008] EAC2 :5' -CTA GACTTT GTT TTC TG-3'。
[0009] 从鼠痘病毒培养物和人工感染小鼠的血清中提取DNA为模板，利用上述引物进行 PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测。此方法反应灵敏，可检出0. Ipg鼠痘病毒基因。
[0010] 文献（付瑞，岳秉飞，贺争鸣.鼠痘病毒PCR检测方法的建立及在鼠源性生物制品 检定中的应用.实验动物科学.2012. 29(3) : 12-14.)根据鼠痘病毒保守序列crmD设计一 对引物，建立了鼠痘病毒PCR检测方法。
[0011] 但目前针对鼠痘病毒设计的PCR引物的特异性和灵敏性仍旧有待提高，且目前尚 未见鼠痘病毒突光定量PCR检测方法的相关报道。
【发明内容】
[0012] 本发明提供了一种用于检测鼠痘病毒的荧光定量PCR引物对和探针，利用该引物 对和探针进行荧光定量PCR，能特异、灵敏地检测出鼠痘病毒。
[0013] 用于检测鼠痕病毒的突光定量PCR引物对和探针，所述引物对的喊基序列为：
[0014] 上游引物：5' -ACAAGGGGITGGGTGTAAGA-3' ；
[0015] 下游引物：5' -GCGTGCTAGTGGTTGCATTA-3' ；
[0016] 所述探针的碱基序列为：5' -R-ACCAAACTGGGTAGACGATGT-Q-3' ；
[0017] 其中，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
[0018] 从 NCBI 的 FTP 下载两株 Ectromelia virus (Ectromelia virus culture-collection ATCC:VR_1431 和 Ectromelia virus strain Moscow)全基因组的基 因序列，从Ectromelia virus culture-collection ATCC:VR_1431(JQ410350. I)的全基因 组中选取了 183个基因与Nt库对比，从中选取了种内特异和种间的差异性最好的ERPV_027 作为候选基因，针对ERPV_027基因的480?800位序列段设计了上述的荧光定量PCR引物 对和探针。
[0019] 本发明中，所述荧光报告基团可选用FAM、J0E或HEX，优选为FAM ;所述荧光淬灭基 团可选用TAMRA、Eclipse或BHQl，优选为TAMRA。
[0020] 本发明还提供了一种检测鼠痘病毒的方法，包括以下步骤：
[0021 ] (1)提取待测样品的DNA ;
[0022] (2)以所述DNA为模板，利用所述荧光定量PCR引物对和探针，进行实时荧光定量 PCR ；
[0023] (3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离、染色，根据显色结果对待测样品进 行鉴定。
[0024] 若待检样品中鼠痘病毒含量很低，容易导致无法检测到相应的病原菌。为避免出 现"假阴性"结果，作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应体系中模板DNA的浓度不低于 21. 7X KT8ng/yl。21. 7X KT8ng/yl即是本发明荧光定量PCR引物对和探针对鼠痘病毒 的检测限。
[0025] 作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应体系为：2XTaqMan Fast Advanced Master Mix(成分参见 TaqMan Fast Advanced Master Mix 试剂盒说明书，购自 Life Technologies 公司）12. 5iil，10iiM 的上下游引物各 0? 5iil，5iiM 的探针 I. 0iil，10ng/ U 1的模板DNAL 0 u 1,补水至25 u 1。
[0026] 作为优选，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：Real-time PCR最佳反应条件 为：50°C培育2min (此温度是UNG酶最佳反应温度，UNG酶包含在2 X TaqMan Fast Advanced Master Mix)，95°C预变性 IOmin ;95°C变性 15s，55°C退火 20s，72°C延伸 20s，预扩增 10 个 循环；95°C变性15s，60°C退火延伸lmin，共40个循环。
[0027] 本发明的反应体系中含有UNG酶可以防止非特异性PCR扩增和污染，增加 PCR结 果的准确性；通过预扩增可以很好的将模板浓度低的样本进行适当放大，增高检出率，降低 检测极限；运用探针进行荧光定量检测，特异性强，操作简单，节省时间，可以达到快速检测 的目的。
[0028] 本发明还提供了所述荧光定量PCR引物对和探针在制备鼠痘病毒鉴定试剂盒中 的应用。
[0029] 本发明还提供了用于检测鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，含有本发明所述用于 检测鼠痘病毒的荧光定量PCR引物对和探针。
[0030] 作为优选，所述荧光定量PCR试剂盒中还含有阳性对照DNA ;所述阳性对照DNA的 碱基序列如SEQ ID No. 1所示。
[0031] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0032] 本发明的荧光定量PCR引物对和探针具有极强的特异性，仅能扩增出鼠痘病毒中 ERPV_027基因的特异性片段；并且对鼠痘病毒的检测限为21. 7Xl(T8ng/ia，大大提高了 检测灵敏性。
【专利附图】
【附图说明】
[0033] 图1为利用3组引物对（ECT-027、ECT-150、ECT-177)分别对标准株ECT-BJ进行 普通PCR扩增时的电泳结果图；
[0034] 其中，M 为 IOObp DNA ladder Marker，下同；
[0035] 图2为利用ECT-33221引物对对标准株ECT-BJ进行普通PCR扩增时的电泳结果 图；
[0036] 图3为利用4组引物对分别对标准株ECT-GZ样本进行普通PCR的扩增结果；
[0037] 其中，1?4泳道依次为引物ECT-027、ECT-150、ECT-177、ECT-33221对标准株 ECT-GZ的扩增结果；
[0038] 图4为利用ECT-027、ECT-150、ECT-177引物对分别对各鼠痘病毒DNA样本进行普 通PCR扩增时的电泳结果图；
[0039] 其中，1?5泳道依次为引物ECT-027对ECT-BJ、001、HZ、MB35、1436R的扩增结果； 6?10泳道依次为引物ECT-150对ECT-BJ、001、HZ、MB35、1436R的扩增结果；11?15泳 道依次为引物ECT-177对ECT-BJ、001、HZ、MB35、1436R的扩增结果；
[0040] 图5为利用ECT-33221引物对分别对各鼠痘病毒DNA样本进行普通PCR扩增时的 电泳结果图；
[0041] 其中，1?5泳道依次为引物ECT-33221对ECT-BJ、001、HZ、MB35、1436R的扩增结 果；
[0042] 图6为利用4组引物对分别对空白对照进行普通PCR的扩增结果；
[0043] 其中，1?4泳道依次为引物ECT-027、ECT-150、ECT-177、ECT-33221对空白对照 的扩增结果；
[0044] 图7为优化反应体系后ECT-027引物对对各鼠痘病毒DNA样本的扩增结果；
[0045] 其中，1?8泳道依次为引物ECT-027对阴性对照（NTC)、ECT-GZ-2、ECT-BG、001、 MB35、1436R、HZ、ECT-GZ-I 的扩增结果；
[0046] 图8A为ECT-027引物对Taqman探针荧光定量检测各鼠痘病毒DNA样本的 Real-time扩增曲线；
[0047] 其中，Delta Rn表示标准指示信号值减去基线信号值，Cycle Number表示PCR循 环数；
[0048] 图8B为ECT-027弓丨物对Taqman探针荧光定量检测阴性对照（NTC)的Real-time 扩增曲线；
[0049] 图9A为ECT-027引物对和Taqman探针对各其他病毒核酸以及各鼠痘病毒感染样 品DNA样本的Real-time PCR扩增后的电泳结果图；
[0050] 其中，1?2泳道依次为小鼠肝炎病毒A59-MHV、JHM-MHV，3泳道为牛痘病毒，4? 5泳道依次为仙台病毒BJ-SV、GZ-SV，6泳道为泰泽病原体，7?16泳道依次为鼠痘病毒感 染样品1?10号，17泳道为阴性对照NTC ;
[0051] 图9B为ECT-027引物对和Taqman探针对各细菌DNA以及各鼠痘病毒感染样品 DNA样本进行Real-time PCR扩增后的电泳结果图；
[0052] 其中，18?24泳道依次为：沙门氏菌、李斯特菌、支气管鲍特菌、大肠埃希菌、铜绿 假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，26?33泳道依次为鼠痘病毒感染样品11?18 号，34泳道为阴性对照NTC ;
[0053] 图IOA为ECT-027引物对克隆质粒Taqman探针标准曲线图；
[0054] 其中，Standard Curve表不标准曲线；
[0055] 图IOB为ECT-027引物克隆质粒标准曲线的扩增曲线图；
[0056] 图11为ECT-027引物Taqman探针灵敏性检测对各浓度ERPV_027克隆质粒的 Real-time PCR扩增结果图；
[0057] 其中，1 ?9 泳道依次为：21. 7X10_9ng/iil、21. 7X10_8ng/iil、21. 7X10_7ng/ ii 1、21. 7X l(T6ng/ ii 1、21. 7X l(T5ng/ ii 1、21. 7X l(T4ng/ ii 1、21. 7X l(T3ng/ ii 1、 21. 7X10-2ng/ii 1、21. 7X10-Sg/ii I ;
[0058] 图12A为ECT-027引物对和Taqman探针对鼠痘病毒标准株和各沙鼠粪便样本DNA 的Real-time PCR扩增结果图；
[0059] 其中，1泳道为阴性对照NTC，2泳道为ECT-BJ，3?7泳道依次为沙鼠粪便样本 61 ?65 ;
[0060] 图12B为ECT-027引物对和Taqman探针对各沙鼠粪便样本DNA的Real-time PCR 扩增结果图；
[0061] 其中，8?24泳道依次为沙鼠粪便样本66?74、76?83 ;
[0062] 图12C为ECT-027引物对和Taqman探针对各鼠痘病毒标准株、鼠痘病毒感染样 本、沙鼠肝脏、沙鼠肺脏样本DNA的Real-time PCR扩增结果图；
[0063] 其中，25?27泳道为鼠痘病毒感染样本19?21号，28、29泳道为ECT-GZ-1、 ECT-GZ-2, 30?35依次为沙鼠肝脏样本1?6号，36?41泳道依次为沙鼠肺脏样本1? 6号；
[0064] 图12D为ECT-027引物对和Taqman探针对各沙鼠粪便、野鼠粪便样本的 Real-time PCR扩增结果图；
[0065] 其中，42?46泳道依次为沙鼠粪便样本84?87、89号，47?49泳道依次为野鼠 粪便样本HN、SH2、SH3。
【具体实施方式】
[0066] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0067] 一引物设计
[0068]将 E.virus culture-collection ATCC:VR-1431(GenBank Accession No : JQ410350. I)(以下简称VR-1431菌株）的183个基因与Nt库对比，获得全部的比对结果。
[0069] 在分析比对结果时，发现 ERPV_027、ERPV_60、ERPV_64、ERPV_77、ERPV_116、 ERPV_140、ERPV_142、ERPV_145、ERPV_148、ERPV_149、ERPV_150、ERPV_174、ERPV_175、 ERPV_177基因有非常好的种内特异和种间的差异性（与牛痘病毒差别较大）。
[0070] 其中，ERPV_027(SEQ ID No. I)、ERPV_150(SEQ ID No. 2)、ERPV_177(SEQ ID No. 3)这三个基因在 VR-1431 菌株、E. virus strain Moscow(GenBank Accession No: AF012825. 2)、E. virus isolate NAVAL(GenBank Accession No :KJ563295. I)中均具 有极高的种内保守性；并且ERPV_027基因在VR-1431菌株和牛痘病毒Cowpox virus strain Norway_1994_MAN(GenBank Accession No :HQ420899.1)之间存在较大的序列差 异，ERPV_150 基因在 VR-1431 菌株与牛痘病毒 Vaccinia virus strain Dryvax clone DPP21 (GenBank Accession No :JN654986. I)之间存在较大的序列差异，ERPV_177 基因在 VR-1431 菌株与沙鼠痘病毒 Taterapox virus strain Dahomey(GenBank Accession No: DQ437594. I)之间存在较大的序列差异。
[0071] 因此，本实施例分别选取ERPV_027基因的480?800位序列段、ERPV_150基因的 60?630位序列段、ERPV_177基因的1000-1680位序列段，作为引物设计位点。
[0072] 同时，本实施例在对 E. virus strain ECT-33221 (GenBank Accession No : AY102991. I)、E. virus strain ECT-Kl(GenBank Accession No :AY102990. I)、 E.virus strain ECT-4908(GenBank Accession No ：AY102989. I)> E. virus strain ECT-4908(GenBank Accession No ：AY102988. I) > E. virus strain MP-I(GenBank Accession No :AY102987. I)的 secreted chemokin e binding protein 的基因 （SEQ ID No. 4)进行序列比对后，针对其202?346位序列段作为引物设计位点。
[0073] 针对以上四个基因利用Primer Express 3.0设计的荧光定量PCR引物对和探针 序列（探针序列的5'端带有荧光报告基团FAM，3'端带有荧光淬灭基团TAMRA)如表1。
[0074] 表1四组荧光定量PCR引物对和Taqman探针序列
【权利要求】
1. 用于检测鼠痘病毒的荧光定量PCR引物对和探针，其特征在于，所述引物对的碱基 序列为： 上游引物：5' -ACAAGGGGITGGGTGTAAGA-3' ； 下游引物：5' -GCGTGCTAGTGGITGCATTA-3' ； 所述探针的碱基序列为：5' -R-ACCAAACTGGGTAGACGATGT-Q-3' ； 其中，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。
2. 如权利要求1所述的荧光定量PCR引物对和探针在制备鼠痘病毒检测试剂盒中的应 用。
3. 用于检测鼠痘病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的用 于检测鼠痘病毒的荧光定量PCR引物对和探针。
4. 如权利要求3所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有阳性对照DNA。
5. 如权利要求4所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA的碱基序 列如SEQ ID No. 1所示。
6. -种检测鼠痘病毒的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测样品的DNA; (2) 以所述DNA为模板，利用如权利要求1所述的荧光定量PCR引物对和探针，进行实 时荧光定量PCR ; (3) 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离、染色，根据显色结果对待测样品进行鉴 定。
7. 如权利要求6所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应 体系中模板DNA的浓度不低于21. 7 X 10_8ng/yl。
8. 如权利要求6或7所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR 的反应体系为：2XTaqMan Fast Advanced Master Mixl2.5lil，10liM 的上下游引物各 0.5iil，5iiM 的探针 L0iil，10ng/iil 的模板 DNA l.Oiil，补水至 25iil。
9. 如权利要求8所述的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应 条件为：50°C培育2min，95°C预变性lOmin ;95°C变性15s，55°C退火20s，72°C延伸20s，预 扩增10个循环；95°C变性15s，60°C退火延伸lmin，共40个循环。
【文档编号】C12Q1/70GK104450964SQ201410734124
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】戴方伟, 周莎桑, 杜江涛, 宋晓明, 郭红刚, 吕宇, 楼琦, 萨晓婴 申请人:浙江省医学科学院