一种果状杜氏藻藻膏的制作和保存方法
【专利摘要】本发明公开了一种果状杜氏藻藻膏的制作和保存方法，属水产养殖领域。过去，果状杜氏藻藻膏的制作大多通过离心机离心藻液或单一沉淀剂沉淀藻细胞来完成，耗电多，耗资巨大，沉淀效果差，沉淀时间长且沉淀不完全。为了克服传统技术的不足，本发明采用复合沉淀剂来沉淀浓缩藻液，沉淀完全且迅速，花钱少，耗时短，操作简便。在藻膏冷冻保存过程中，本发明采用复合冷冻保护剂且采用逐级降温的方法，工艺简单，易掌握，对细胞伤害小，细胞成活率高，营养成分基本不散失，保存时间长达5年，远高于传统保存方法的2-3年。
【专利说明】_种果状杜氏藻藻當的制作和保存方法
[0001]【技术领域】本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种果状杜氏藻藻膏的制作和保存方法。
【背景技术】
[0002]果状杜氏藻Dunaliella carpatica，隶属绿藻门，绿藻纲，杜氏藻目，杜氏藻科，杜氏藻属，单细胞个体，梨形，长8.8-12.5 μ m，宽6.5-11.3 μ m，前端有I对等长鞭毛，胞内有I胞核，含I具蛋白核杯状叶绿体，有一红色眼点，没有伸缩泡。细胞内常含大量胡萝卜素，致细胞呈橘红色，盐生藻类，见于许多盐湖、盐池及一些高盐水体，驯化后可在普通海水中生长繁殖。果状杜氏藻能在光照、温度、盐度适宜水体迅速繁殖，大量积累β胡萝卜素，适宜条件下β-胡萝卜素含量最高占干重的13-18%，是自然界β-胡萝卜素含量最高的生物，早在1980年就有人提出可人工养殖果状杜氏藻提取β-胡萝卜素，现在澳大利亚、以色列先后建立了大规模养殖厂。β胡萝卜素是一种天然抗氧化剂，具良好保健功能，还是优良天然色素，人工养殖杜氏藻生产胡萝卜素前景广阔。
[0003]果状杜氏藻还是对虾、扇贝、梭子蟹、海参、海胆、毛蚶、魁蚶、缢蛏等水产经济动物幼体优质天然饵料。在实际生产中，因天气、季节等因素的影响，常常使得果状杜氏藻培养量不稳定，导致育苗中鲜藻液供给不足，因此，需储备一定量的浓缩藻液或藻膏，以备鲜藻液缺乏时使用。另外，在贝类和虾类的育苗过程中，育苗池水体的水质常因藻液的投入量过多而受到污染，影响育苗效果，特别是投入污染和老化的饵料时更为严重。将藻液浓缩制成藻膏后投喂，可减少代谢产物和氨氮进入育苗池，减少污染。将藻液添加防腐剂制成藻膏，装罐后可保存较长时间，使用方便。使用藻膏还可以提高饵料池利用率，充分利用育苗空闲时间进行微藻生产，保证育苗过程中单细胞饵料的供给。传统上对藻液进行浓缩制作藻膏有物理和化学两种方法，物理方法包括离心法、重力沉降法、遮光法、降温法、超声波沉降法、电流沉淀法；化学浓缩法即使用明矾、氢氧化钠、高锰酸钾等试剂沉淀浓缩。化学浓缩法制作藻膏成本低、见效快，常用的化学试剂是明矾，其它试剂报道较少。
[0004]以前，庞绍强公开了一种螺旋藻膏制作工艺(申请号CN98107212)。该发明将螺旋藻与凉粉混合制成螺旋藻膏，螺旋藻营养成分完全保留且具清热、解暑、祛暑毒功效。该发明组分组合合理，保健效果显著，所产藻膏是一种多功能、高营养天然保健食品。本法缺点是工艺流程长，操作麻烦，费时费力，效率低下。张世文发明了一种小球藻膏的制备方法(申请号CN103740594A)，主要包括过滤、微滤/超滤、离心等步骤。本方法特别适用于小球藻膏的制备，制得的小球藻膏纯度高，浓缩效率高，不存在絮凝剂残留问题，质量稳定，小球藻含量高，保存时间长。不足之处是超滤膜易堵塞，洗刷费事，不能规模生产。张跃群公开了一种海洋微藻活体冷冻膏的生产工艺(申请号CN200910029929)，具体操作步骤是:海水经消毒，加入多量元素、微量元素、维生素及微藻种，经充气，暗光处理，离心处理，加抗冻剂搅拌，灌入藻膏模板冷冻。该发明解决了传统液体培养基保种周期短，易污染，操作麻烦，保藏条件难以控制，易失败，运输不方便，供应受季节限制等问题，优点是藻膏不易污染，体积小，运输方便，保存时间长，营养成分不损失，供应不受季节限制，生产成本低，但缺点是基建投资大，工艺繁杂，对操作者技术要求高，普通工人难以掌握。
[0005]过去，果状杜氏藻藻膏的制作大多通过离心机离心藻液或单一沉淀剂沉淀藻细胞来完成，要么耗电多，耗资巨大，要么沉淀效果差，沉淀时间长且沉淀不完全。为了克服传统技术的不足，本发明采用复合沉淀剂来沉淀浓缩藻液，沉淀完全且迅速，花钱少，耗时短，操作简便。在藻膏冷冻保存过程中，本发明采用复合冷冻保护剂且采用逐级降温的方法，工艺简单，易掌握，对细胞伤害小，细胞成活率高，营养成分基本不散失，保存时间长达5年，远高于传统保存方法的23年。
【发明内容】
[0006]为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种果状杜氏藻藻膏的制作和保存方法，具体方法如下:
[0007]步骤I培养液的制备
[0008]培养液成分:羊粪浸出液I份，磷酸妈0.1份，麦饭石粉0.01份，人尿0.5份，对氨安息香酸0.001份，泛酸钙0.03份，维生素B12 0.0003份，维生素B1 0.0001份，尿素0.2份，甜菜碱 0.006 份，脱落酸 0.008 份，CdCl2 0.02 份，SrSO4 0.004 份，Co (NO3) 2.6Η20 0.03份，Ca (NO3) 2 0.2 份，NH4NO3 0.1 份，FeC6H5O7.3Η20 0.008 份，TiCl2 0.0004 份，NiSO4 0.05份，CoCl2 0.0005份，CuCl2 0.001份，煮沸冷却海水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用；
[0009]步骤2接种培养
[0010]培养分两个阶段，即二级培养。一级培养:取一 3000毫升洁净三角烧瓶，
[0011]加入步骤I所述培养液1500毫升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的果状杜氏藻藻种接种，接种密度2.5万个细胞/每毫升藻液，轻轻摇匀3分钟。高压灭菌锅消毒的报纸和橡皮筋封口，放入光照培养箱中培养，调节温度至25 V，光照强度60001uX，每天光照16小时，黑暗8小时；每天手动摇瓶6次，每次30秒钟，连续培养7天，可同时培养4瓶，转入下一级培养；
[0012]二级培养:取两个带水龙头的塑料蒸馏水桶，每个25升(市场有售)，每个桶加入步骤I所述培养液15升，然后加入步骤一培养完的藻液1500毫升作藻种。每个桶的盖子上打上2个孔，孔直径10毫米，每个盖子上插入2根直径为8毫米的塑料管，I根充气，另I根排气，第一个桶的充气管一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，充入混合气体，气体成分=空气98% +纯CO2L 5% +纯氮气0.5%，每天只在光照时充气，黑暗无光照时停止充气，气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；第二个桶的充气管与第一个桶的排气管以料管相连，如此一来，充入的气体可以得到二次利用，提高了气体利用率。将这两个塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，目光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养9天，前6天调节温度至27°C，光照强度150001ux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为SOOOlux)，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供间歇光，6小时连续光照，6小时连续黑暗，如此循环；后3天，调节温度至30°C，光照强度ISOOOlux，每天提供15小时连续光照，然后9小时连续黑暗，如此循环，至第9天，藻细胞密度可达到t40万/每毫升藻液，后转入下一步骤；
[0013]步骤3藻膏制作
[0014]取硫酸铜，明矾，生石灰，海藻酸钠适量，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过150目筛絹为宜)，按硫酸铜I份，明矾4份，生石灰2份，海藻酸钠0.5份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合15分钟，直至均匀，制成复合沉淀剂，取步骤2所述培养后的藻液1000份，加入复合沉淀剂0.2份，用空气压缩机连接一塑料管插入藻液充气搅拌、混合15分钟，然后静置、沉淀48小时，弃上清液，取底部橘红色牙膏状藻膏，藻膏制作完毕。
[0015]藻膏冷冻保存方法
[0016]复合冷冻保护剂的制备取二甲基亚砜、甘油、碱性苯三酚、氯霉素各适量，按二甲基亚砜I份、甘油2份、碱性苯三酚0.5份、氯霉素0.02份的配比混合，充分混合、搅拌制成复合冷冻保护剂，放在黑色磨口塞试剂瓶中保存，备用。取步骤3所述藻膏1000份，加入200份琼脂，再加入复合冷冻保护剂0.05份，充分搅拌、混合，用食品级塑料袋分装，每袋I千克，封口机封口，外面再套一黑色塑料袋以避免光照，放入4°C冰柜中保存，24小时后再转入_5°C冰柜，24小时后转入_15°C冰柜，24小时后再转入_25°C冰柜长期保存，保存期可长达5年。需要时从冰柜中取出，室温下自然融化，即可投喂对虾、海参、海胆、梭子蟹、扇贝、牡蛎、贻贝、泥蚶、石斑鱼等的幼苗。
[0017]有益结果过去，果状杜氏藻藻膏的制作大多通过离心机离心藻液或单一沉淀剂沉淀细胞来完成，要么耗电多，耗资巨大，要么沉淀效果差，沉淀时间长且沉淀不完全。为了克服传统技术的不足，本发明采用复合沉淀剂来沉淀浓缩藻液，沉淀完全且迅速，花钱少，耗时短，操作简便。在藻膏冷冻保存过程中，本发明采用复合冷冻保护剂且采用逐级降温的方法，工艺简单，易掌握，对细胞伤害小，细胞成活率高，营养成分基本不散失，保存时间长达5年，远高于传统保存方法的2-3年。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为果状杜氏藻形态，其中附图标记为:1鞭毛，2细胞核，3蛋白核，4色素体；
[0019]图2为步骤2中培养果状杜氏藻方法图，其中附图标记为:5充气管，6排气管。
【具体实施方式】
[0020]一种果状杜氏藻藻膏的制作方法，具体方法如下:
[0021]步骤(I)培养液的制备培养液成分:羊粪浸出液I份，磷酸钙0.1份，麦饭石粉0.01份，人尿0.5份，对氨安息香酸0.001份，泛酸钙0.03份，维生素B12 0.0003份，维生素B1 0.0001 份，尿素 0.2 份，甜菜碱 0.006 份，脱落酸 0.008 份，CdCl2 0.02 份，SrSO4 0.004份，Co (NO3) 2.6H20 0.03 份，Ca (NO3) 2 0.2 份，NH4NO3 0.1 份，FeC6H5O7.3H20 0.008 份，TiCl20.0004 份，NiSO4 0.05 份，CoCl2 0.0005 份，CuCl2 0.001 份，煮沸冷却海水 1000 份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用；
[0022]步骤⑵接种培养
[0023]培养分两个阶段，即二级培养；一级培养:取一 3000毫升洁净三角烧瓶，加入步骤
(I)所述培养液1500毫升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的果状杜氏藻藻种接种，接种密度2.5万个细胞/每毫升藻液，轻轻摇匀3分钟，高压灭菌锅消毒的报纸和橡皮筋封口，放入光照培养箱中培养，调节温度至25°C，光照强度60001uX，每天光照16小时，黑暗8小时；每天手动摇瓶6次，每次30秒钟，连续培养7天，可同时培养4瓶，转入下一级培养；
[0024]二级培养:取两个带水龙头的塑料蒸馏水桶，每个25升(市场有售)，每个桶加入步骤I所述培养液15升，然后加入步骤一培养完的藻液1500毫升作藻种；每个桶的盖子上打上2个孔，孔直径10毫米，每个盖子上插入2根直径为8毫米的塑料管，I根充气，另I根排气，第一个桶的充气管一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，充入混合气体，气体成分=空气98% +纯CO2L 5% +纯氮气0.5%，每天只在光照时充气，黑暗无光照时停止充气，气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；第二个桶的充气管与第一个桶的排气管以料管相连，如此一来，充入的气体可以得到二次利用，提高了气体利用率；将这两个塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养9天，前6天调节温度至27°C，光照强度150001ux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为SOOOlux)，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供间歇光，6小时连续光照，6小时连续黑暗，如此循环；后3天，调节温度至30°C，光照强度ISOOOlux，每天提供15小时连续光照，然后9小时连续黑暗，如此循环，至第9天，藻细胞密度可达到140万/每毫升藻液，后转入下一步骤；
[0025]步骤(3)藻膏制作
[0026]取硫酸铜，明矾，生石灰，海藻酸钠适量，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过150目筛絹为宜)，按硫酸铜I份，明矾4份，生石灰2份，海藻酸钠0.5份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合15分钟，直至均匀，制成复合沉淀剂，取步骤2所述培养后的藻液1000份，加入复合沉淀剂0.2份，用空气压缩机连接一塑料管插入藻液充气搅拌、混合15分钟，然后静置、沉淀48小时，弃上清液，取底部橘红色牙膏状藻膏，藻膏制作完毕。
[0027]一种根据权利要求1所述的果状杜氏藻藻膏的保存方法，具体方法如下:
[0028](I)复合冷冻保护剂的制备
[0029]取二甲基亚砜、甘油、碱性苯三酚、氯霉素各适量，按二甲基亚砜I份、甘油2份、碱性苯三酚0.5份、氯霉素0.02份的配比混合，充分混合、搅拌制成复合冷冻保护剂，放在黑色磨口塞试剂瓶中保存，备用；取步骤(3)所得藻膏1000份，加入200份琼脂，再加入复合冷冻保护剂0.05份，充分搅拌、混合，用食品级塑料袋分装，每袋I千克，封口机封口，外面再套一黑色塑料袋以避免光照，放入4°C冰柜中保存，24小时后再转入-5°C冰柜，24小时后转入-15°C冰柜，24小时后再转入_25°C冰柜长期保存，保存期可长达5年；需要时从冰柜中取出，室温下自然融化，即可投喂对虾、海参、海胆、梭子蟹、扇贝、牡蛎、贻贝、泥蚶、石斑鱼等的幼苗。
[0030]步骤I中所述人尿制备方法:取一 3000毫升三角烧瓶，装入人尿1500毫升，静置，自然发酵48小时，放在电炉上加热，煮沸3分钟，冷却，装入磨口塞棕色试剂瓶，密封，置于4°C冰箱冷藏备用；
[0031]步骤2中接种用的果状杜氏藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如米氏提取法)，以确保接种时藻种为纯种、无污染且处于生长旺盛的指数生长期；
[0032]步骤I中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
[0033]步骤I中各种无机营养盐和维生素可预先配成母液且置于4°C冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过30天；
[0034]步骤I中所述羊粪浸出液制备方法:将羊粪堆积在阳光下，适当暴晒，使羊粪含水量在50-75%为宜，用黄泥或塑料薄膜密封发酵，春秋季需一个月，夏季半月即可。发酵好之后，要先将其稍晾。取发酵好的羊粪1000克，置入大小适当的瓷缸，加水10升，充分搅拌15分钟，静置24小时，取上清液4升，煮沸10分钟，冷却，静置36小时，取上清液2升备用；
[0035]步骤I中FeC6H5O7.3H20 (柠檬酸铁)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90°C，并不断搅拌至全部融化；
[0036]步骤2中一级培养所用三角烧瓶需洗刷干净后加入250毫升水，放在电炉上煮沸3分钟消毒，冷却后使用；
[0037]步骤2所述接种过程需在无菌操作台上进行；
[0038]步骤2中充气管、排气管与盖子连接处需用玻璃胶粘合，以防漏气；
[0039]步骤I和3中所用尿素、甜菜碱、脱落酸、CdCl2、SrS04、Co(N03)2.6H20、CuCl2等化学药品纯度均需分析纯级别。
[0040]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种果状杜氏藻藻膏的制作方法，其特征在于具体方法如下: 步骤(I)培养液的制备培养液成分:羊粪浸出液I份，磷酸I? 0.1份，麦饭石粉0.0l份，人尿0.5份，对氨安息香酸0.001份，泛酸钙0.03份，维生素B12 0.0003份，维生素B10.0001 份，尿素 0.2 份，甜菜碱 0.006 份，脱落酸 0.008 份，CdCl2 0.02 份，SrSO4 0.004 份，Co (NO3) 2.6H20 0.03 份，Ca (NO3) 2 0.2 份，NH4NO3 0.1 份，FeC6H5O7.3H20 0.008 份，TiCl20.0004 份，NiSO4 0.05 份，CoCl2 0.0005 份，CuCl2 0.001 份，煮沸冷却海水 1000 份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，密封，放在摇床上摇匀15分钟，置入4°C冰箱保存，备用； 步骤(2)接种培养 培养分两个阶段，即二级培养；一级培养:取一 3000毫升洁净三角烧瓶，加入步骤(I)所述培养液1500毫升，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的果状杜氏藻藻种接种，接种密度2.5万个细胞/每毫升藻液，轻轻摇匀3分钟，高压灭菌锅消毒的报纸和橡皮筋封口，放入光照培养箱中培养，调节温度至25°C，光照强度60001uX，每天光照16小时，黑暗8小时；每天手动摇瓶6次，每次30秒钟，连续培养7天，可同时培养4瓶，转入下一级培养； 二级培养:取两个带水龙头的塑料蒸馏水桶，每个25升(市场有售)，每个桶加入步骤I所述培养液15升，然后加入步骤一培养完的藻液1500毫升作藻种；每个桶的盖子上打上2个孔，孔直径10毫米，每个盖子上插入2根直径为8毫米的塑料管，I根充气，另I根排气，第一个桶的充气管一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，充入混合气体，气体成分=空气98% +纯CO2 1.5% +纯氮气0.5%，每天只在光照时充气，黑暗无光照时停止充气，气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；第二个桶的充气管与第一个桶的排气管以料管相连，如此一来，充入的气体可以得到二次利用，提高了气体利用率；将这两个塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养9天，前6天调节温度至27°C，光照强度150001ux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为SOOOlux)，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供间歇光，6小时连续光照，6小时连续黑暗，如此循环；后3天，调节温度至30°C，光照强度ISOOOlux，每天提供15小时连续光照，然后9小时连续黑暗，如此循环，至第9天，藻细胞密度可达到140万/每毫升藻液，后转入下一步骤； 步骤(3)藻膏制作 取硫酸铜，明矾，生石灰，海藻酸钠适量，分别用粉碎机粉碎至面粉状(粒径大小以通过150目筛絹为宜)，按硫酸铜I份，明矾4份，生石灰2份，海藻酸钠0.5份的比例混合，用搅拌机充分搅拌、混合15分钟，直至均匀，制成复合沉淀剂，取步骤2所述培养后的藻液1000份，加入复合沉淀剂0.2份，用空气压缩机连接一塑料管插入藻液充气搅拌、混合15分钟，然后静置、沉淀48小时，弃上清液，取底部橘红色牙膏状藻膏，藻膏制作完毕。
2.—种根据权利要求1所述的果状杜氏藻藻膏的保存方法，其特征在于具体方法如下: (I)复合冷冻保护剂的制备 取二甲基亚砜、甘油、碱性苯三酚、氯霉素各适量，按二甲基亚砜I份、甘油2份、碱性苯三酚0.5份、氯霉素0.02份的配比混合，充分混合、搅拌制成复合冷冻保护剂，放在黑色磨口塞试剂瓶中保存，备用；取权利要求1中步骤(3)所得藻膏1000份，加入200份琼脂，再加入复合冷冻保护剂0.05份，充分搅拌、混合，用食品级塑料袋分装，每袋I千克，封口机封口，外面再套一黑色塑料袋以避免光照，放入4°C冰柜中保存，24小时后再转入-5°C冰柜，24小时后转入-15°C冰柜，24小时后再转入_25°C冰柜长期保存，保存期可长达5年；需要时从冰柜中取出，室温下自然融化，即可投喂对虾、海参、海胆、梭子蟹、扇贝、牡蛎、贻贝、泥蚶、石斑鱼等的幼苗。
【文档编号】C12N1/04GK104480018SQ201410752306
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】王培磊 申请人:临沂大学