一种从酿酒酵母中提取纯化sod的方法
【专利摘要】本发明涉及一种提取纯化SOD的方法，尤其涉及一种从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法，其包括下述操作步骤：菌体收集，菌体匀浆，粗酶液制备，超滤以及层析。本发明可有效纯化非修饰的SOD蛋白，保持SOD的原始活性。且纯化出的高纯度SOD用邻苯三酚氧化法测得的比活高达15000U/g，整个过程收率较高；操作简单、可实现工业化大生产。
【专利说明】一种从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提取纯化SOD的方法，尤其涉及一种从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法。
【背景技术】
[0002]O厂称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。超氧阴离子既是阴离子又是自由基，既是氧化剂，又是还原剂。现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。在体内，超氧阴离子主要通过超氧歧化酶清除。
[0003]超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, S0D)在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物体内清除超氧阴离子的首要酶。SOD催化如下的反应:
202>2H+— H 202+02
SOD通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶和过氧化物酶会立即将其分解为完全无害的水。
[0004]超氧化物歧化酶根据其活性中心所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜(Cu)锌(Zn)金属辅基，称(Cu-Zn型S0D)，这是最为常见的一种S0D，呈绿色或蓝色，主要存在于细胞质中；第二种是是含锰(Mn)金属辅基的称(Mn型S0D)，存在于真核细胞的线粒体和一些原核细胞内；第三种是含铁(Fe)金属辅基的称(Fe型S0D)，呈黄褐色，存在于原核细胞中。
[0005]目前，应用最广泛的是Cu-Zn型SOD。SOD是生物体内氧自由基的天然清除剂，具有广泛的医用价值，可作为药品、食品及日化产品的添加剂。例如SOD对一些由于年龄、疾病或伤害造成的组织硬化以及纤维化显示出较强的再生修复能力。SOD也已被成功地应用于放疗后的辅助治疗、贝切特氏症的治疗、控制心脏病人的进展、严重的风湿性关节炎的治疗等领域。
[0006]目前，国内外商品化的SOD主要从动物的血液(例如猪血或牛血)或者肝脏中提取得来，然而一些人畜共患病的原因使得许多国家禁止在食品、化妆品、医疗等领域使用动物来源的S0D。因此，从植物和微生物中提取SOD成为了人们的主要研宄方向。然而植物来源的SOD存在含量低、比活低、纯化过程复杂等缺陷，而用微生物生产SOD除了不存在上述缺陷之外，还存在生长速率快的优势，因此微生物逐渐成为SOD的主要的来源。例如，专利号为2011100503115报道了一种用酿酒酵母生产重组人源SOD的方法，但是这个专利集中在重组酿酒酵母的构建，并未公开SOD纯化方法，而从细胞内获取SOD时更是采用超声法，不适合大规模工业化生产；专利号为201310103919.9报道了一种酿酒酵母菌株及其在制备耐热超氧化物歧化酶中的应用，这项专利主要集中在酿酒酵母菌种的筛选以及发酵上，对于SOD的纯化并未深入研宄；专利号为2011103369936的专利中，公布了一种从酿酒酵母中同时提取S-腺苷-L-甲硫氨酸和SOD的方法，然而这种方法纯化的SOD纯度较低，而且在破壁时采用有机溶剂法，纯化时也采用丙酮沉淀法，这对于环境有一定的污染，也使得SOD酶活有一定得损失；专利号为200810061168.8的专利中，报道了从重组酿酒酵母中提取耐高温超氧化物歧化酶的方法，然而这种方法需要用80°C水浴，这会使得酿酒酵母中SOD失活，此外该专利需要用有机溶剂一一乙醇沉淀，这对酿酒酵母SOD的酶活也有损害，最后透析也会影响工艺工业化时的放大。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种操作简单、可实现工业化大生产的从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法，并且所提取纯化的SOD具有较高活性。
[0008]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是:
本发明从酿酒酵母中提取纯化SOD的方法包括下述操作步骤:
O菌体收集:用板框过滤器收集湿酿酒酵母细胞；
2)菌体匀浆:将上述酿酒酵母细胞中加入2~30倍体积的水，搅拌使酿酒酵母均匀分散为悬浮液，用高压均质机在300~1500bar匀浆2~8次；
3)粗酶液制备:向匀浆后产物加入pH7~9的聚醚酰亚胺溶液，使聚醚酰亚胺的终浓度为l~25g/L ;搅拌均匀后加入硅藻土，硅藻土的加入量为每升100~300克；混合均匀后用板框过滤器过滤收集滤液，即为SOD粗酶液；
或将匀浆后产物以10000~16000rpm离心，上清液用陶瓷膜微滤系统过滤得到SOD粗酶液；
4)超滤:将上述SOD粗酶液用1000~40000Da超滤膜处理，超滤膜两侧压力不大于0.4MPa ；
5)层析:将上述超滤后所得滤液通过阳离子层析柱层析，用去离子水冲洗后用5~100mM的pH4.0-7.0乙酸缓冲液进行洗脱，收集富含SOD的洗脱液；所述阳离子层析柱选自 Q-sepharose 或 DEAE-sepharose 层析柱。
[0009]进一步的，本发明向步骤5)中的超滤后所得滤液中加入pH 5.0-7.0的乙酸缓冲液，使乙酸的终浓度为5~30mM的后进行层析。
[0010]进一步的，本发明所述乙酸缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。
[0011]进一步的，本发明层析后将所得富含SOD的洗脱液通过超滤或凝胶排阻层析脱土卜
ΠΤΤ.0
[0012]进一步的，本发明重复步骤4)和5) 2~5次获得高纯度的富含SOD的洗脱液。
[0013]进一步的，本发明步骤2)中所述水的温度为4~15°C。
[0014]采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
本发明提供了一种从酿酒酵母细胞中提取Cu-Zn型SOD的方法。无论从微生物中，还是从植物细胞中提取高纯度的S0D，都具有一定得困难。因为细胞内含有数千种蛋白且酶蛋白较容易失去生物学活力。如今，人们可以通过分子生物学手段在酶基因上连接上一段标签，而后用特殊的层析柱纯化S0D，然而这种方法的纯化成本极高，而且信号肽可能会影响酶活力。本发明公开的方法有效地解决了上述的问题，可有效纯化非修饰的SOD蛋白，保持SOD的原始活性；且纯化出的高纯度SOD用邻苯三酚氧化法测得的比活高达15000U/g，整个过程收率较高；操作简单、可实现工业化大生产。
[0015]本发明的工艺流程用高压均质机对酿酒酵母进行破碎。相对有机溶剂法破坏细胞壁以及细胞膜，具有环保以及酶活损失小等优点；相对超声破碎法，具有破壁率高、处理量大、易于工业化的优点。
[0016]本发明通过合适的层析法以及合理的层析工艺纯化SOD，相较于用高温、有机溶剂、盐析和透析等方法纯化SOD，具有酶活损失小以及SOD产品纯度高的优势。
[0017]本发明中的层析方法可以重复数次，逐步提高SOD产品的纯度，也可根据要求生产不同纯度的SOD冻干粉及溶液。
【具体实施方式】
[0018]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0019]为使本发明的上述目的，特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0020]本发明所选用的酿酒酵母为商业化销售的野生酵母菌，例如安琪干酵母。本发明的方法对所选用的酿酒酵母没有具体的限制，原则上只要表达SOD的菌株均可以使用本发明的方法进行SOD的提取和纯化。
[0021]本发明适用于离子型的SOD的提取，尤其适用于阳离子型的SODjn Cu-Zn型的rhSOD的提取，对于不同离子型的S0D，可以通过变换层析柱、洗脱液、洗脱顺序等实施，原则上属于与本发明方法相同或相近的方法，亦属于本发明保护的范围。
[0022]下述实施例中所使用的板框过滤器的厂家为大张过滤有限公司，型号为BMY4/450-30U ;醋酸纤维素超滤膜的厂家为赛多利斯(Sartorius )公司，型号为SartoconHydrosart，截留分子量为 1KDa ；Q-sepharose 层析柱的厂家为 GE HealthcareLife Sciences，型号为 Q Sepharose Fast Flow ;DEAE_sepharose 层析柱的厂家为 GEHealthcare Life Sciences，型号为 DEAE-sepharose Fast Flow ;陶瓷膜的厂家为南京艾宇琦膜科技有限公司，型号为AYQ-3019-1040。
[0023]实施例1
将200L发酵罐中发酵得到的酿酒酵母发酵液用板框过滤器过滤后，将得到约24kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入60升4~15°C去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散，加入去离子水至终体积为90L。将上述酿酒酵母悬浊液用100bar压力进行匀浆，匀浆产物用100bar再次匀浆，反复3次后，酵母细胞破碎率大于95%。
[0024]在匀浆产物中加入10升250g/L的pH7.9的聚醚酰亚胺(PEI)溶液，使PEI在匀楽产物中的终浓度为25g/L，用约50rpm的速度搅拌lOmin，在其中加入30kg娃藻土混合均匀，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用100升去离子水洗涤。
[0025]将滤液用分离效率为10000 Da醋酸纤维素超滤膜系统将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液通过装有GEhealth care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 6.0浓度为20 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0026]将收集的SOD可以用分离效率为10000 Da的醋酸纤维素系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 6.0浓度为20 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0027]上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定第一法(邻苯三酚法)测定，SOD的纯度约13840 U/mgo经一次层析处理得到的SOD产品纯度为4320 U/mgo
[0028]实施例2
将200L发酵罐中发酵得到的酿酒酵母发酵液用板框过滤器过滤后，将得到约24kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入48升4~15°C去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散。将上述酿酒酵母悬池液用500bar压力进行勾楽，勾楽产物用500bar再次勾楽，反复8次后，酵母细胞破碎率大于95%。匀浆压力低时，匀浆速率较快，通量大，且匀浆产物温度较低，当不具备冷却设备时，可以采用低压力多次匀浆法。
[0029]将匀浆产物用管式离心机在HOOOrpm离心，出料口速率约30L/h条件下离心。离心后的液体用南京艾宇琦膜科技有限公司的陶瓷膜进行过滤。将滤液用分离效率为40000Da的醋酸纤维素超滤膜将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液通过装有GE health care的DEAE-sepharose层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 6.0浓度为20 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0030]将收集的SOD可以用分离效率为10000 Da的醋酸纤维素超滤膜系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次，以脱掉SOD溶液中的盐离子。随后，将SOD溶液再次通过装有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 6.0浓度为20 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。收集的SOD组分继续超滤系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有GE healthcare的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先用10倍柱床体积的pH 6.0浓度为20 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用25mM的pH 5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0031]上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到浅蓝色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定第一法(邻苯三酚法)测定，SOD纯度约15270U/mg。
[0032]实施例3
将100L发酵罐中发酵得到的酿酒酵母发酵液用板框过滤器过滤后，将得到约1kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入80升4~15°C去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散，加入去离子水至终体积为99L。将上述酿酒酵母悬浊液用100bar压力进行匀浆，匀浆产物用100bar再次匀浆，反复3次后，酵母细胞破碎率大于95%。
[0033]在匀浆产物中加入I升200g/L的pH7.9的聚醚酰亚胺(PEI)溶液，使PEI在匀浆产物中的终浓度为2g/L，用约50rpm的速度搅拌lOmin，在其中加入1kg娃藻土混合均勾，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用50升去离子水洗涤。
[0034]将滤液用分离效率为20000 Da的醋酸纤维素超滤膜系统将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液通过装有GEhealth care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用5倍柱床体积的PH5.0浓度为1mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用15mM的pH 4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0035]将收集的SOD可以用分离效率为20000 Da的醋酸纤维素超滤膜系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用5倍柱床体积的pH 5.0浓度为5mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用15mM的pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0036]上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定第一法(邻苯三酚法)测定，SOD的纯度约11830 U/mgo
[0037]实施例4
将200L发酵罐中发酵得到的酿酒酵母发酵液用板框过滤器过滤后，将得到约24kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入48升4~15°C去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散，加水定容到77.5L。将上述酿酒酵母悬浊液用100bar压力进行匀浆，匀浆产物用100bar再次匀浆，反复3次后，酵母细胞破碎率大于95%。
[0038]在匀浆产物中加入2.5升200g/L的pH7.0的聚醚酰亚胺(PEI)溶液，使PEI在匀楽产物中的终浓度为6.25g/L，用约50rpm的速度搅拌lOmin，在其中加入16kg娃藻土混合均匀，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用100升去离子水洗涤。
[0039]将滤液用分离效率为40000 Da的醋酸纤维素超滤膜系统将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液加入pH 6.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，是乙酸的终浓度为30mM后，将粗酶液通过装有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH7.0浓度为20mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用50mM的pH 6.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0040]将收集的SOD可以用分离效率为40000 Da的醋酸纤维素超滤膜系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 7.0浓度为30mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用50mM的pH6.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0041]上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定第一法(邻苯三酚法)测定，SOD的纯度约9710U/mg。
[0042]实施例5 将200L发酵罐中发酵得到的酿酒酵母发酵液用板框过滤器过滤后，将得到约14kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入100升4~15°C去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散，加入水至终体积140L。将上述酿酒酵母悬浊液用1500bar压力进行匀浆，匀浆产物用1500bar再次匀浆。
[0043]在匀浆产物中加入10升75g/L的pH9.0的聚醚酰亚胺(PEI)溶液，使PEI在匀浆产物中的终浓度为5g/L，用约50rpm的速度搅拌lOmin，在其中加入40kg娃藻土混合均勾，而后用板框过滤器再次过滤收集滤液。为了提高SOD收率，滤饼可以用150升去离子水洗涤。
[0044]将滤液用分离效率为40000Da的醋酸纤维素超滤膜系统将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液加入pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，是乙酸的终浓度为25mM后，通过装有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH6.3浓度为20mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用20mM的pH 5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0045]将收集的SOD可以用分离效率为40000Da的醋酸纤维素超滤膜系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有GE health care的Q-sepharose Fast Flow (Q_琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 6.3浓度为25mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用20mM的pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0046]上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到颜色为浅蓝绿色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定第一法(邻苯三酚法)测定，SOD的纯度约12750U/mg。
[0047]实施例6
将200L发酵罐中发酵得到的酿酒酵母发酵液用板框过滤器过滤后，将得到约24kg菌泥加入到搅拌罐中，向其中加入750升4~15°C去离子水并搅拌使得酵母细胞均匀分散。将上述酿酒酵母悬池液用500bar压力进行勾楽，勾楽产物用800bar再次勾楽，反复5次后，酵母细胞破碎率大于95%。匀浆压力低时，匀浆速率较快，通量大，且匀浆产物温度较低，当不具备冷却设备时，可以采用低压力多次匀浆法。
[0048]将匀浆产物用管式离心机在HOOOrpm离心，出料口速率约30L/h条件下离心。离心后的液体用南京艾宇琦膜科技有限公司的陶瓷膜进行过滤。将滤液用分离效率为10000Da的醋酸纤维素超滤膜系统将上述粗酶液浓缩到5L后，向其中加入20L去离子水继续浓缩，反复加水3次后，浓缩到5L。将粗酶液通过装有GE health care的Q-sepharose FastFlow (Q-琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 7.0浓度为30 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用10mM的pH 7.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0049]将收集的SOD可以用分离效率为10000 Da的醋酸纤维素超滤膜系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次，以脱掉SOD溶液中的盐离子。将粗酶液加入pH 7.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，是乙酸的终浓度为5mM后，将SOD溶液再次通过装有GE healthcare的Q-sepharose Fast Flow (Q-琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 7.0浓度为30mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用10mM的pH 7.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。收集的SOD组分继续超滤系统浓缩以后，加入10倍体积的水继续浓缩，反复5次。随后，将SOD溶液再次通过装有GE health care的Q-sepharose FastFlow (Q-琼脂糖凝胶)层析柱，先后用10倍柱床体积的pH 7.0浓度为30 mM乙酸-乙酸钠缓冲溶液冲洗，而后用10mM的pH7.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行洗脱，收集SOD活力组分。
[0050]上述高纯度SOD溶液用超滤膜系统处理；将得到的SOD溶液冷冻干燥可以得到浅蓝色的冻干粉。用GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性测定第一法(邻苯三酚法)测定，SOD纯度约7280U/mg。
【权利要求】
1.一种从酿酒酵母中提取纯化300的方法，其特征在于其包括下述操作步骤: 1?菌体收集:用板框过滤器收集湿酿酒酵母细胞； 2)菌体匀浆:将上述酿酒酵母细胞中加入2~30倍体积的水，搅拌使酿酒酵母均匀分散为悬浮液，用高压均质机在300~15001^1~匀浆2~8次； 3)粗酶液制备:向匀浆后产物加入邱7~9的聚醚酰亚胺溶液，使聚醚酰亚胺的终浓度为1~258凡；搅拌均匀后加入硅藻土，硅藻土的加入量为每升100~300克；混合均匀后用板框过滤器过滤收集滤液，即为300粗酶液； 或将匀浆后产物以100004600011)111离心，上清液用陶瓷膜微滤系统过滤得到300粗酶液； 4)超滤:将上述300粗酶液用1000~40000超滤膜处理，超滤膜两侧压力不大于0.41？3 ； 5)层析:将上述超滤后所得滤液通过阳离子层析柱层析，用去离子水冲洗后用5-1001111的邱4.0-7.0乙酸缓冲液进行洗脱，收集富含300的洗脱液；所述阳离子层析柱选白 0-861)1181-086 02八2—86^)1181086 胃丰斤丰主。
2.根据权利要求1所述的一种从酿酒酵母中提取纯化300的方法，其特征在于 向步骤5)中的超滤后所得滤液中加入邱5.0-7.0的乙酸缓冲液，使乙酸的终浓度为5-301111的后进行层析。
3.根据权利要求2所述的一种从酿酒酵母中提取纯化300的方法，其特征在于所述乙酸缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的一种从酿酒酵母中提取纯化300的方法，其特征在于层析后将所得富含300的洗脱液通过超滤或凝胶排阻层析脱盐。
5.根据权利要求1或2所述的一种从酿酒酵母中提取纯化300的方法，其特征在于重复步骤4)^5)2-5次获得高纯度的富含300的洗脱液。
6.根据权利要求5所述的一种从酿酒酵母中提取纯化300的方法，其特征在于步骤2)中所述水的温度为4~15。〇。
【文档编号】C12R1/865GK104450635SQ201410757440
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】马功臣 申请人:邢台怡通生物科技有限公司