一种原代b细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，公开了一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法。本发明将原代B-ALL细胞与OP9细胞共培养，可维持原代B-ALL细胞的存活率和增殖，并极大程度上缓解B-ALL细胞的分化和衰老。本发明所述培养方法培养的原代B-ALL细胞可增殖，且细胞状态良好，充分体现了肿瘤细胞的异质性。本发明所述方法操作简单，方便、经济，具有良好的应用前景。
【专利说明】一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，特别涉及一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养 方法。
【背景技术】
[0002] B细胞急性淋系白血病（B-ALL，B-cell acute lymphoblastic leukemia)，也称为 前体B细胞（pre B-cell)急性淋巴细胞白血病，是来源于B细胞祖细胞的恶性肿瘤。B-ALL 主要为儿童高发性癌症，在成人发病率下降。在B-ALL未成年患者中预后好，长期存活率 (EFS，event-free survival)可达90%，但在B-ALL成人中却是预后差、低生存率。另外在 成年B-ALL患者中，传统的化疗的效果差，死亡率约为60%。因此，针对B-ALL，需要研发新 的有效治疗方法。
[0003] 迄今为止，B-ALL相关研宄主要依赖于B-ALL细胞系，而细胞系在长期传代培养的 过程中，对高浓度血清的非人体环境中逐渐适应，并形成了一些区别于原代肿瘤细胞的基 因突变和细胞特性（如高表达P53突变）。尽管病人来源的B-ALL样本细胞可以通过异种 移植入免疫缺陷小鼠中扩大增殖后，进行体内实验，然而体内研宄花费高、耗时长，特别是 对于新型治疗方法或药物筛选实验，耗费的人力物力是不可预估的。
[0004] 目前已发表了一些原代B-ALL细胞体外培养的相关报道，如利用人细胞因子SCF、 IL-3、IL-7和FLT-3L等刺激培养，或利用正常人骨髓内皮细胞系（HBME，human bone mariOw endothelial cells)或人骨髓基质细胞（MSC，human marrow stromal cell)等进行共培 养，但培养成功率低，且结果重复性差。
[0005] 综上所述，现有技术利用B-ALL细胞系进行肿瘤研宄不能真实模拟肿瘤的异质 性、无法满足随着药物使用而突变的肿瘤的治疗需求；而原代B-ALL细胞的体外培养仍处 于不成熟阶段，大部分肿瘤细胞样本因无法适应体内外环境的转变而快速凋亡（2周内）， 而可在成功体外长期培养的肿瘤细胞样本比率不高。因此，亟需开发稳定而有效的原代 B-ALL体外培养方法，实现在病人原代肿瘤细胞进行直接、精确的实验和分析，促进B-ALL 相关疾病机制研宄和新型治疗手段研发进展。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种成熟、简便的原代B-ALL细胞的体外培养方法，为B-ALL的疾 病机制研宄、治疗药物的筛选及药效评估提供一个快速、经济、重复性高的体外模型。
[0007] 本发明利用0P9细胞系，一种小鼠骨髓来源的胚胎间充质干细胞系，与B细胞急性 淋系白血病病人来源的原代B-ALL细胞共培养，使原代B-ALL细胞可在体外增殖并长期存 活。
[0008] 本发明所述培养方法是一种有效、简便、利于推广的病人来源的原代B细胞急性 淋系白血病（B-ALL，B-cell acute lymphoblastic leukemia)细胞的体外长期培养方法。 本发明所述病人来源的原代B-ALL细胞的体外培养方法，可用于研宄B-ALL相关的特殊基 因突变、染色体重排、DNA或染色体甲基化的表观遗传变化、药物耐药性、细胞标志的表达和 功能、免疫原性、细胞周期和凋亡机制、治疗药物敏感性等。同时还可用于探索B-ALL的疾 病起始、B-ALL细胞分化等。
[0009] 实验证实，B-ALL体外培养7天后，对照组仅B-ALL已基本没有存活或状态良好的 B-ALL细胞，而OP9共培养组中，还有大量的状态良好的具有完整圆形形态的B-ALL细胞，且 B-ALL细胞呈现增殖状态，成团聚集并粘附于OP9细胞表面。
[0010] 在对照培养的条件下，B-ALL细胞7天后已几乎全部死亡，而与OP9共培养的 B-ALL细胞则不断增殖，3周后平均可增殖6倍。与OP9共培养，可维持原代B-ALL细胞的 存活率和增殖，并极大程度上缓解B-ALL细胞的分化和衰老。
[0011] 作为优选，所述原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病病人，更优选的，来 源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓。
[0012] 所述OP9细胞悬液种板长满即为OP9基质细胞培养板，所述OP9基质细胞培 养板为将稀释至〇. 5-2X105/mL的OP9细胞在OP9培养基培养下在培养板长满；加入 0. 5-2 X 106/mL的B-ALL细胞悬液，使B-ALL细胞与OP9细胞充分接触。
[0013] 共培养对培养基的耗费十分快，需要每两天进行半换液（如用500ul移液器沿培 养液面轻轻吸出500ul培养基后，加入500ul新鲜培养基）；须根据OP9基质细胞的状态和 密度更换新鲜OP9基质细胞培养板；每天需对培养细胞状态、密度和培养基颜色进行观察， 以便及时对培养情况作出相应处理方法，密切观察更换新鲜的OP9基质细胞培养板。
[0014] 现有的B-ALL细胞系一般为单克隆或已适应体外环境的克隆，与原代B-ALL细胞 有着极大的差异，在发起癌症B-ALL、病灶转移和治疗逃逸中都无法真实反映原代B-ALL的 特性；相对于现有技术中的B-ALL细胞系体外培养模型，本发明提供的原代B-ALL细胞体外 培养方法长期培养充分体现了肿瘤细胞的异质性；且本发明所述B-ALL细胞系体外培养方 法可真实反映肿瘤干细胞对免疫治疗、药物治疗等的适应突变和逃逸作用。
[0015] 相对于现有技术中的其它原代B-ALL细胞的体外培养方法，本发明所述培养方 法，有以下优点：
[0016] a)成功率更高，可达44%，更适应原代B-ALL细胞的培养；
[0017] b)培养时间更长，最长可达6个月；
[0018] c)培养效果更好，在培养过程中，原代B-ALL细胞数量可增殖6倍，且细胞状态良 好；
[0019] d)本发明相对于现有技术的如细胞因子培养、病人骨髓间充质细胞共培养而言， 操作更加简单方便、经济，利于本发明的应用推广。
[0020] 术语与定义
[0021] 肿瘤异质性：是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生 物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方 面产生差异。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为通过显徼镜观察到B-ALL在OP9组、对照组两种条件下，B-ALL的体外生长 和增殖的情况。
[0023] 图2为记录B-ALL细胞在OP9组、对照组两种培养条件下，每七天进行的B-ALL细 胞计数结果。
[0024] 图3为通过显徼镜观察到B-ALL细胞与OP9共培养后0天、7天、1个月、2个月、3 个月的细胞状态图。
[0025] 图4为与OP9共培养的B-ALL流式分析结果图。
【具体实施方式】
[0026] 本发明公开了一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法，本领域技术 人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改 动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应 用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内 对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0027] 为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对 本发明作进一步的详细说明。
[0028] 需要说明的是，本专利中涉及到的原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病 病人、优选来源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓是通过中华骨髓库、血液库中获得的样 本。
[0029] 实施例1 :
[0030] 1.0P9细胞系的培养
[0031] OP9 培养基：a MEM 培养基（HyClone，Thermo Scientific，MA，USA)，20%胎牛血清 (Gibco,Life Technologies，NY，USA)，2mM L-glutamine，100U/ml penicillin，and IOOug/ ml streptomycin。
[0032] 细胞传代（贴壁）：
[0033] I)细胞培养和维持在T75培养皿中，首先用巴氏吸管吸出培养液，用2ml PBS清洗 一遍；
[0034] 2)加入 2. 0-3. OmL 0.25% (w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA 溶液孵育 5-15 分钟，直 到显徼镜下观察到细胞层飘起分散；
[0035] 注意：为了避免细胞成团，在等待细胞分离时，勿摇动烧瓶。细胞难以分离，可以放 置在37 °C，便于胰蛋白酶催化。
[0036] 3)加入6. 0-8. OmL培养基，用巴氏吸管轻轻吹散细胞；
[0037] 4)用巴氏吸管将细胞悬液转移至15mL离心管，125xg离心5-10分钟，去除上清；
[0038] 5)用新鲜培养基重悬细胞，加入适当的细胞悬液进入新的培养皿（传代比例为 1 : 4或1 : 5)，加入新鲜培养基至适当体积；
[0039] 6)置于37°C、湿度95%、5% CO2培养箱中培养，每2-3天更换一次培养基。
[0040] 注意：细胞密度对细胞的状态非常重要。如果细胞传代比率太低，细胞会长得很 慢，甚至无法长满，状态会受到影响。另外，培养时间过长，细胞密度过大，会出现非常大的 细胞，这些细胞的出现往往是一个警告标志"0P9细胞不利于作为支持造血细胞的基质"。所 以，在0P9细胞必须在长满之前传代。
[0041] 0P9细胞种板：
[0042] 1)根据细胞传代步骤将OP9细胞用胰蛋白酶分离为单细胞悬液（细胞传代步骤 5)后，加入适当培养基进行稀释后，细胞计数；
[0043] 2)根据细胞计数结果，将OP9细胞悬液稀释至I X 105/mL，并将细胞种于24孔板 中，每孔加入500ul细胞悬液；
[0044] 3)种板后，轻轻将细胞摇匀，使其均匀铺于培养皿中；
[0045] 4)置于37°C、湿度95%、5% 0)2培养箱中培养。
[0046] 实施例2 :B-ALL样本的处理
[0047] 1)将B-ALL病人骨髓样本与生理盐水等比例混合；
[0048] 2)在新的15mL离心管中加入稀释后血液体积二分之一的淋巴分离液 (Lymphoprep，StemCell Technologies)；
[0049] 3)将稀释后的血液沿离心管壁缓缓叠加于分层液面上，注意保持液面的清晰；
[0050] 4)轻轻将骨髓样本混合物离心管放入离心机，800g/min离心20min ;
[0051] 5)轻轻取出离心管，骨髓样本混合物分层，用巴氏吸管小心吸取中间云雾层细胞 置于新的15mL离心管；
[0052] 6)用无血清a MEM培养基或PBS清洗两次，分离出的细胞用培养基重悬作为备用 样本细胞；
[0053] 实施例3 :原代B-ALL共培养
[0054] B-ALL 培养基：MDM 培养基（HyClone，Thermo Scientific，MA，USA)，10 %胎牛 血清（Gibco，Life Technologies，NY，USA)，2mM L-glutamine lOOU/ml penicillin，and lOOug/ml streptomycin ；
[0055] I)在备用样本细胞稀释加入适当B-ALL培养基稀释后，进行细胞计数；
[0056] 2)根据细胞计数结果将备用样本细胞稀释至I X IOfVmL ;
[0057] 3)将种于24孔板的0P9细胞培养基吸出，用B-ALL培养基清洗一遍；
[0058] 4)将2)中I X IOfVmL的样本细胞加入3)的24孔板中，每孔加入500ul ;
[0059] 5)种板后，轻轻将细胞摇匀，使其均匀铺于0P9基质细胞上，与其充分接触；
[0060] 6)置于37°C、湿度95%、5% 0)2培养箱中培养。
[0061] 注意：共培养对培养基的耗费十分快，需要每两天进行半换液（用500ul移液器沿 培养液面轻轻吸出500ul培养基后，加入500ul新鲜培养基）；须根据0P9基质细胞的状态 和密度更换新鲜0P9基质细胞培养板；每天需对培养细胞状态、密度和培养基颜色进行观 察，以便及时对培养情况作出相应处理方法。
[0062] 2.共培养观察
[0063] 细胞状态观察：通过每天观察共培养的B-ALL细胞的大小、形态、增殖等情况。
[0064] 细胞计数：共培养后每7天换新鲜0P9基质板的时候，将共培养的B-ALL细胞轻轻 吹起，300g离心5分钟，加入适量培养基重悬，进行细胞计数。观察结果见图1-4。
[0065] 图1为通过显徼镜观察到B-ALL在0P9组（与0P9共培养）、对照组（仅B-ALL 培养基培养）两种条件下，B-ALL的体外生长和增殖的情况（图标为20uM)。由图1可知， B-ALL体外培养7天后，对照组中已基本没有存活或状态良好的B-ALL细胞，而0P9共培养 组中，还有大量的状态良好（具有完整圆形形态）的B-ALL细胞，且B-ALL细胞呈现增殖状 态（成团聚集并粘附于0P9细胞表面）。
[0066] 图2为记录B-ALL细胞在OP9组（与OP9共培养）、对照组（仅B-ALL培养基培 养）两种培养条件下，每七天进行的B-ALL细胞计数结果。由图可知，在对照组培养的条件 下，B-ALL细胞7天后已几乎全部死亡，而与OP9共培养的B-ALL细胞则不断增殖，3周后平 均可增殖6倍。
[0067] 通过显徼镜观察到B-ALL细胞与OP9共培养后0天、7天、1个月、2个月、3个月的 细胞状态图见图3 (图标为20uM)。由图3可知，与OP9共培养的B-ALL细胞状态良好，且一 直呈现增殖状态。
[0068] 3.流式细胞分析：
[0069] 流式细胞仪：FACSAria? II (BD Biosciences，San Jose，CA，USA)
[0070] I)共培养每14天计数时，取I X IO6B-ALL细胞于I. 5mL，300xg离心5分钟；
[0071] 2)?85清洗一次，用100此？85重悬，加入11^人0)45、11^人0)34、11^人0)38抗 体（ebioscience，San Diego, USA)，置于 4°C孵育 30 分钟；
[0072] (须同时准备四个对照补偿组：无孵育抗体组、单孵育人⑶45组、单孵育人⑶34 组、单孵育人⑶38组）
[0073] 3) PBS清洗孵育细胞两次后，用300ul PBS重悬待分析；
[0074] 结果见图4,流式细胞技术分析与0P9共培养0天、2周、4周、6周的B-ALL细胞的 存活情况、⑶34和⑶38干细胞表面标志物的表达情况。由图4可知，与0P9共培养，可维 持原代B-ALL细胞的存活率和增殖，并极大程度上缓解B-ALL细胞的分化和衰老。
[0075] 实施例4 :
[0076] 获取的25例B-ALL病人的原代肿瘤样本，按照本发明所述体外培养方法分别与 0P9细胞共培养的情况，结果见表1。
[0077] 由表1可知，25例原代B-ALL样本中，有11例样本可在与0P9细胞共培养的条件 下，进行体外长期培养，成功率达44%，平均培养时间为2. 8个月，培养时间最长可达6个 月。由于原代B-ALL样本存在个人机体差异、肿瘤突变位点差异、接受治疗程度差异等，导 致B-ALL与0P9共培养结果的差异。本发明创造提供的方法相对于现有技术，在培养成功 率、培养时长、细胞状态和分化衰老的缓解上都有巨大的改善。
[0078] 表 1
[0079]
【权利要求】
1. 一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法，其特征在于，将原代B-ALL细 胞与0P9细胞共培养。
2. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述原代B-ALL细胞来源于B细 胞急性淋系白血病病人。
3. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述原代B-ALL细胞来源于B细 胞急性淋系白血病病人骨髓。
4. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述共培养利用B-ALL培养基进 行。
5. 根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，所述0P9细胞悬液种板长满即为 0P9基质细胞培养板，加入0. 5-2 X 106/mL的B-ALL细胞悬液，使B-ALL细胞与0P9细胞充 分接触。
6. 根据权利要求4所述的体外培养方法，其特征在于，每两天进行半换液。
7. 根据权利要求5或6所述的体外培养方法，其特征在于，密切观察更换新鲜的OP9基 质细胞培养板。
8. 根据权利要求5所述的体外培养方法，其特征在于，所述OP9基质细胞培养板为将稀 释至0. 5-2X 105/mL的OP9细胞在OP9培养基培养下在培养板长满。
【文档编号】C12N5/0735GK104498435SQ201410778012
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】李鹏, 蒋治武, 林思妙, 魏新茹 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院