慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中受miR-29和miR-181调控的TCL1的表达的制作方法

专利名称：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中受miR-29和miR-181调控的TCL1的表达的制作方法
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中 受miR-29和miR-181调控的7TZ7的表达
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N/A
政府资助
本发明总体或部分由来自NIH授予/合同号P01 CA81534的基金 资助。政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)是世界上最常见的人白血病，在 美国每年占有大约IO，OOO个新病例。1在成熟T细胞白血病中，发现 7TZ7(T-细胞白血病/淋巴瘤l)癌基因为14q31. 2上频繁染色体重排的 靶。2之前已报导在B细胞中表达7TZ7的转基因小鼠发生B-CLL。3本 发明者现在本文中认为7TZ7的失调在B-CLL的发病机理中可能是因果 事件，因为本发明者现也已显示7TZ7是Akt癌蛋白(B细胞和T细胞 中抗细胞凋亡信号转导中的至关重要的分子)的辅激活因子。4
最近的报导显示，人CLL中高7TZ7 W《迷与未突变的Vh状悉和 ZAP70阳性相关，表明7TZJ-驱动的CLL是B-CLL的侵袭性形式。5与 人B-CLL中的不良预后相关的最重要的遗传因子之一是染色体llq缺 失。6
MicroRM是据认为参与时间和组织特异性基因调控的高保守非 编码基因的大家族。7我们最近证明microRNA表达谱可用于区分正常 B细胞和恶性B-CLL细胞，并且microRNA特征(s ignature)与慢性淋 巴细胞性白血病的预后和进展相关。s'9
目前未获得普遍成功的治疗或预防B-CLL的方法。通常基于多种预后参数(包括特定肿瘤标记的分析)来选择疗程。
尽管对B-CLL的治疗进行了相当多的研究，但仍然难以对CLL进 行有效的诊断和治疗，并且在患者中观察到的死亡率表明需要对疾病 的诊断、治疗和预防进行改进。
发明概述
本发明部分基于与正常对照细胞相比在乳腺癌细胞中差异表达 的miRNA的慢性淋巴细胞性白血病癌症特异性特征的鉴定。
因此，本发明包括诊断受试者是否患有慢性淋巴细胞性白血病 (B-CLL)或处于发展其的风险中的方法，该方法包括测量来自所述受试 者的受试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中相 应的miR基因产物水平相比，受试样品中raiR基因产物水平的改变表 示受试者患有B-CLL或处于发展B-CLL的风险中。
在某些实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-29或miR-181。 在某些实施方案中，至少一种miR基因产物是miR-29b和/或 miR-181b。
可使用多种本领域技术人员熟知的技术测量至少一种miR基因产 物的水平。在一个实施方案中， -使用Northern印迹分析测量至少一种 miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，受试样品中至少一种miR 基因产物的水平低于对照样品中相应的miR基因产物的水平。此外， 在另一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物的水平可高 于对照样品中相应的oiiR基因产物的水平。
本发明还提供了诊断与受试者中一个或多个预后标记关联的 B-CLL的方法，该方法包括测量来自所述受试者的B-CLL样品中至少 一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中相应的miR基因产物水 平相比，受试样品中至少一种miR基因产物水平的改变表示受试者患 有与一个或多个预后标记关联的B-CLL。在一个实施方案中，这样测 量至少一种miR基因产物的水平，即通过逆转录获自受试者的受试样 品的RM以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将所述靶寡脱氧核苷酸与包含
7raiRNA-特异性探针寡核普酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交镨； 和，将受试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相比较来进行测量。 至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有B-CLL或处于发展 B-CLL的风险中。
本发明还包括治疗受试者的CLL的方法，其中与从对照样品产生 的信号相比，至少一种miRM的信号失调(例如，下调，上调)。
在某些实施方案中，微阵列包含针对选自miR-29或miR-181和 其组合的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸。
本发明还包括诊断受试者是否患有与受试者中一种或多种不利 的预后标记关联的B-CLL或处于发展其的风险中的方法，即通过逆转 录获自受试者的受试样品的RNA以提供一组耙寡脱氧核苷酸；将所述 靼寡脱氧核苷酸与包含miRM-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以 提供所述受试样品的杂交i普；和，将受试样品杂交谦与从对照样品产 生的杂交镨相比较来进行诊断。信号的改变表示受试者患有癌症或处 于发展癌症的风险中。
本发明还包括治疗患有B-CLL的受试者的B-CLL的方法，其中， 与对照细胞相比，受试者的癌细胞中至少一种miR基因产物被下调或 上调。当至少一种miR基因产物在癌细胞中下调时，该方法包括对受 试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，以便癌细胞在受试 者中的增殖被抑制。当至少一种miR基因产物在癌细胞中上调时，该 方法包括对受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因 产物表达的化合物，以便癌细胞在受试者中的增殖被抑制。在某些实 施方案中，至少一种分离的miR基因产物选自raiR-29、 miR-181和其 组合。
在相关实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗B-CLL的方法， 该方法包括测定与对照细胞相比，B-CLL细胞中至少一种miR基因 产物的量；和通过对受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因 产物(如果癌细胞中表达的miR基因产物的量低于对照细胞中表达的 miR基因产物的量)；或对受试者施用有效量的至少一种用于抑制至少一种miR基因产物的表达的化合物(如果癌细胞中表达的miR基因 产物的量高于对照细胞中表达的miR基因产物的量)来改变B-CLL细 胞中表达的miR基因产物的量，以便癌细胞在受试者中的增殖被抑制。 在某些实施方案中，至少一种分离的miR基因产物选自miR-29、 miR-181和其组合。
本发明还提供了用于治疗B-CLL的药物组合物，所述药物组合物 包舍至少一种分离的miR基因产物和药学上可接受的载体。在特定的 实施方案中，药物组合物中至少一种分离的ffliR基因产物相应于在 B-CLL细胞中下调(与合适的对照细胞相比)的miR基因产物。在特 定的实施方案中，药物组合物选自ffliR-29、 ffliR-181和其组合。在另 一个特定的实施方案中，药物组合物包含至少一种miR表达抑制剂化 合物和药学上可接受的载体。此外，在特定的实施方案中，药物组合 物包含至少一种特异于在B-CLL细胞中上调(与合适的对照细胞相比) 的miR基因产物的miR表达抑制剂化合物。
在另 一个实施方案中，本发明提供了鉴定抗B-CLL试剂的方法， 该方法包括对细胞提供受试试剂和测量与B-CLL细胞中减少的表达水 平关联的至少一种raiR基因产物的水平，其中与合适的对照细胞相比， 细胞中raiR基因产物水平的增加表示受试试剂为抗B-CLL试剂。在某 些实施方案中，miR基因产物选自miR-29、 miR-181和其组合。
本发明还提供了鉴定抗B-CLL试剂的方法，该方法包括给细胞提 供受试试剂和测量与B-CLL细胞中增加的表达水平关联的至少一种 miR基因产物的水平，其中与合适的对照细胞相比，细胞中miR基因 产物水平的减少表示受试试剂为抗B-CLL试剂。在特定的实施方案中， miR基因产物选自miR-29、 miR-181和其组合。
当按照附图
阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明
附图简述
图la-lf- 7TZ/的表达受历/) i^和/z7J X^/调控:
9图la- CLL中raj的表达。泳道l-8， CLL样品。泳道2和6:
7T^7的表达被评定为低水平。所有其他泳道，rai的表达评定为高至
极高水平。
图lb-三组B-CLL中7rU的表达。条图表示指定的B-CLL样品的 相对数目。
图lc-迈/i -2外和肌？-7《/6和7T"的3' UTR的序列比对。
图ld-荧光素酶测定中迈/; -2夕和/zl^-/( /靶向7TZ7的表达。对 于迈/i -i^荧光素酶测定，使用在下游紧接荧光素酶的终止密码子的 Xbal位点将包括与/zz/y -W互补的区域的7"a/ cDNA的片段(Tcll)插 入所示的包含构建体的pGL3栽体(Promega， Madison， WI)或单独的 pGL3栽体。对于顶/y -7(57测定，将全长7TW cDNA以有义(TcllFL) 或反义(TcllFLAS)方向插入pGL3栽体。用所示的迈/i -2外或混杂 (scramble)阴性对照以及所示的包含一部分7"7 cDM (包括与 /z7/W-2夕同源的区域)的pGL3构建体(Tcl 1)或单独的pGL3载体共转染 293细胞。对于肌'A-J^/测定，7TZ7FL或7"aJFLAS与miR181 —起 共转染。使用双荧光素酶测定系统(Promega)测定萤火虫和海肾 (reni 1 la)的荧光素酶活性，将萤火虫的荧光素酶活性对海肾的荧光素 酶活性进行标准化(如厂商所建议)。以一式三份重复进行所有实验。
图le-miR-29b和迈L -M76对ra/蛋白质表达的影响。用单独 的pcDNA3 7rZ//7(包含全长ra/cDNA的哺乳动物表达载体)(泳道1) 转染293细胞或用pcDNA3ra7/7和/s/i -Z^广泳道2 )前-miR( pre-miR) 阴性对照(泳道3 )或迈/y -/476 (泳道4)共转染293细胞。使用7TZ/ 抗体通过Western印迹检观'J 7T" #4这。
图lf-通过微阵列分析7TZ7蛋白质表达与范/i -7W6和/z /v -2外 的关系。值代表microRNA微阵列杂交信号。
图2a和2b-代表性CLL样品的实时RT-PCR分析。选择三个 /zl^-/W和范/W-W都具有高表达的样品(25、37和41)和四个/z /W-7《/ 和历/i -i^都具有低表达的的样品(55、 56、 72和81)。按照厂商的实 验方案对miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-29a、miR-29b式三份重复进行所有实 验。
图3包括显示区分CLL亚型的统计学上显著的microRNA的表1。 图4a-4d包括CLL样品信息图4a包括CLL样品信息；图4b包 括侵袭性CLL的信息；图4c包括进展緩慢的CLL的信息；以及图4d 包括具有11q缺失的侵袭性CLL。如之前所描述的(Rassenti LZ, Huynh L， Toy TL，等人N Engl. J. Med. 2004; 351 :893-901)，测量表达 的IgVH基因的突变状态和就ZAP-70进行免疫表型分型。使用针对CLL panel的常规Vysis探针进行FISH。这些FISH测定可检测下列染色体 异常(成组的探针):llq-和17p-(llq23上的ATM和17pl3. 1上的P53)、 13q-和三体性12 (13ql4上的D13S319, 13q34上的LAMP1和着丝粒 12上的D12Z3)。
图5包括显示三种类型的B-CLL中成对比较的microRNA表达的表2。
优选实施方案的详述
本发明证明ra7癌基因的失调是该疾病的侵袭性形式的发病机 理中的因果事件，这通过使用动物模型来验证。为了研究CLL中ra7
调控的机制，进行三种类型的CLL (进展緩慢的CLL、侵袭性CLL和显 示llq缺失的侵袭性CLL)的外microRNA表达i瞽分析(out microRNA expression profiling)。鉴定了相应于各组CLL的不同的microRNA 特征。进一步确定了 7*a7的表达受迈L -2夕和顶/7 4<$7( CLL中差异表 达的两种microRNA )调控。/wV -i^和顶L -7W的表达水平通常与进行 检测的CLL样品中的7TZ7的表达呈负相关。本文中显示，CLL中7"7 的表达至少部分地受范/i -i^和/ZL^-/》/调控，并且此类miRNA可以是 过表达ra7的CLL的治疗剂的候选物。
如在本文中可互换使用的，"miR基因产物"、"microRNA"、 "miR，，或"miRNA，，是指来自miR基因的未加工或已加工的RNA转录 物。由于miR基因产物不翻译成蛋白质，因此术语"miR基因产物"不包括蛋白质。未加工的raiR基因转录物也称为"miR前体"，其通 常包括长度大约70-100个核苷酸的RNA转录物。可通过用RNA酶(例 如，Dicer、 Argonaut或RM酶III例如大肠杆菌(E. coli)RNA酶 IIi)将其消化成具有活性的19至25个核苷酸的RM分子来加工miR 前体。该具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称为"已加工的，， miR基因转录物或"成熟的"miRNA。
可通过天然加工途径(例如使用完整的细胞或细胞裂解物)或通 过合成加工途径(例如4吏用分离的加工酶，例如分离的Dicer、 Argonaut或RM酶III)从raiR前体获得具有活性的19-25个核苷酸的 RNA分子。应理解，还可通过生物或化学合成(而不用从miR前体加 工)直接产生具有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。
本发明包括诊断受试者是否患有CLL或处于发展CLL的风险中的 方法，该方法包括测量来自受试者的受试样品中至少一种miR基因产 物的水平和将受试样品中的miR基因产物水平与对照样品中的相应 ffliR基因产物水平相比较。如本文所使用的，"受试者"可以是患有 或怀疑患有乳腺癌的任何哺乳动物。在特定的实施方案中，受试者是 患有或怀疑患有CLL的人。
可在从受试者获得的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产
物的水平。例如，可通过常规的活组织检查技术从怀疑患有相关的CLL
的受试者中取出组织样品。在另一个实施例中，可从受试者中取出血 液样品，并且可通过标准技术分离白细胞以用于DNA提取。优选在开
始放射疗法、化学疗法或其他疗法之前从受试者获得血液或组织样品。 可从受试者的未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体或从 相应于受试者的样品的大部分细胞的培养细胞获得相应的对照组织或 血液样品。然后将对照组织或血液样品与来自受试者的样品一起进行 处理，以便可将从来自受试者的样品的细胞中给定的miR基因产生的 miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的相应的miR基因产物的 水平进行比较。
与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，从受试者获得的
12样品中miR基因产物水平的改变(即增加或减少)表示于受试者中存 在CLL。在一个实施方案中，受试样品中至少一种miR基因产物水平 高于对照样品中相应的miR基因产物的水平(即，ffliR基因产物的表达 "上调")。如本文中所使用的，当来自受试者的细胞或组织样品中 miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时， miR基因产物的表达"上调，，。在另一个实施方案中，受试样品中至 少一种miR基因产物水平低于对照样品中相应miR基因产物的水平 (即，miR基因产物的表达"下调")。如本文中所使用的，当从来自 受试者的细胞或组织样品中的该基因产生的miR基因产物的量低于从 对照细胞或组织样品中的相同基因产生的量时，miR基因的表达"下 调，，。可根据一个或多个RM表达标准确定对照和正常样品中相对miR 基因表达。所述标准可包括例如0 miR基因表达水平、标准细胞系中 的miR基因表达水平或之前获得的正常人对照的群体的ffliR基因表达 的平均水平。
可使用适合用于检测生物样品中RM表达水平的任何技术测量样 品中miR基因产物的水平。用于测定来自生物样品的细胞中的RNA表 达水平的合适技术(例如，Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交) 对于本领域技术人员来说是熟知的。在特定的实施方案中，使用 Northern印迹分析检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过 在核酸提取緩冲液存在的情况下进行匀浆，接着进行离心来从细胞纯 化总的细胞RNA。沉淀核酸，然后通过用DM酶处理和沉淀来除去DM。 然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离RNA分子，并将 其转移至硝酸纤维素滤器。然后通过加热将RNA固定在滤器上。使用 适当标记的与所述RM互补的DM或RNA探针进行特定RNA的检测和 定量。参见，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook等人,eds.， 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989， Chapter 7，其全部公开内容通过引用合并入本文。
用于给定的miR基因产物的Northern印迹杂交的合适的探针可 从给定的miR的核酸序列产生。用于制备标记的DNA和RM探针的方法以及用于其与耙核苷酸序列的杂交的条件描述于Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook等人，eds.， 第2版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989， Chapters 10和11， 其公开内容通过引用合并入本文。
例如，可用例如放射性核素例如3H、 32P、 33P、 "C或"S、重金属 或能够用作已标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素、 抗生物素蛋白或抗体)、荧光分子、化学发光分子、酶等来标记核酸探 针。
可通过Rigby等人(1977), J. Mol. Biol. 113: 237-251的切 口平移法或Fienberg等人(1983)， Anal. Biochem. 132:6-13的随 机引物法(其全部公开内容通过引用合并入本文)将探针标记至高比 放射性(specific activity),后者是选择用于从单链DNA或从RNA 模板合成高比放射性的"P-标记的探针的方法。例如，按照切口平移 法通过用高放射性的核苷酸置换预先存在的核苷酸，可能制备具有大 大超过108 cpm/微克的比放射性的32P-标记的核酸探针。然后可通过 将杂交滤器暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。暴露于杂 交滤器的照相胶片的光密度扫描提供了 miR基因转录物水平的精确测 量。使用另一个方法，可通过计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences, Piscataway， NJ获得的Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager定量miR基因转录物水平。
当不能进行DM或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引 物法将类似物例如dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-s -氨基己酰 基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子。可通过与结合生 物素的蛋白质例如偶联至荧光染料或产生颜色反应的酶的抗生物素蛋 白、链霉抗生物素蛋白和抗体(例如抗生物素抗体)反应来检测生物 素化的探针寡核苷酸。
除了 Northern和其他RNA杂交技术外，可使用原位杂交技术来 测定RNA转录物的水平。该技术需要比Nor thern印迹^t术更少的细胞， 其包括将整个细胞置于显微镜盖玻片上和用含有放射性标记的或另外标记的核酸(例如，cDNA或RM)探针的溶液探测细胞的核酸含量。该 技术特别适合用于分析来自受试者的组织活组织检查样品。原位杂交 技术的实施在美国专利5,427,916 (其全部公开内容通过引用合并入 本文)中进行了更详细的描述。用于给定的miR基因产物的原位杂交 的合适的探针可从核酸序列产生。
细胞中miR基因转录物的相对数目还可通过对miR基因转录物进 行逆转录，然后通过聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增经逆转录的转录物 来进行测定。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的"持家" 基因的mRNA的水平相比较来定量miR基因转录物的水平。用作内部标 准的合适的"持家"基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (G3PDH)。用于定量RT-PCR和其变型的方法在本领域技术人员的能力 之内。
在一些情况下，可能期望同时测定样品中多个不同miR基因产物 的表达水平。在其他情况下，可能期望测定与癌症关联的所有已知miR 基因的转录物的表达水平。评估数百种miR基因的癌症特异性表达水 平非常费时并且需要大量的总RNA(对于每一个Northern印迹需要至 少20 )jg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
为了克服这些限制，可构建以微芯片形式(即，微阵列)存在的寡 核普酸文库，该文库包含一组特异于一组miR基因的探针寡脱氧核普 酸。使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸， 将它们与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交以产生杂交谱或表达谱来 测定生物样品中多个mi croRNA的表达水平。然后将受试样品的杂交谱 与对照样品的杂交镨比较，从而确定在CLL中具有改变的表达水平的 microRM。如本文中所使用的，"探针寡核苷酸"或"探针寡脱氧核 苷酸"是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。"靶寡核苷酸"或"靶 寡脱氧核苷酸"是指待检测(例如，通过杂交)的分子。"miR-特异 性探针寡核苷酸"或"特异于miR的探针寡核苷酸"是指具有选择用 于与特定miR基因产物或特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的 探针寡核苷酸。
15特定样品的"表达谱"或"杂交i脊"本质上是样品的状态指紋； 虽然两种状态可能具有相似表达的任何特定基因，但同时评价大量基 因允许产生对于细胞的状态是独特的基因表达谙。即，正常细胞可与 CLL细胞相区别，并且在CLL细胞内，可确定不同的预后状态(例如， 良好的或不良的长期存活希望)。通过比较不同状态中CLL细胞的表达 谱，获得关于在这些状态的每一个状态中为重要的(包括基因的上调 或下调)基因的信息。在CLL细胞或正常细胞中差异表达的序列的鉴 定以及导致不同预后结果的差异表达允许以许多方法使用该信息。例 如，可评估特定的治疗方案(例如，确定化疗药物是否改善特定患者 的长期预后)。类似地，可通过将患者样品与已知的表达i普比较来进 行或确认诊断。此外，这些基因表达镨(或个体基因)允许筛选抑制 CLL表达镨或将不良预后谦转变成更好的预后傳的药物候选物。
因此，本发明提供了诊断受试者是否患有CLL或处于发展CLL的 风险中的方法，该方法包括逆转录获自受试者的受试样品的RNA以提 供一组靶寡脱氧核苷酸，将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针 寡核苷酸的微阵列杂交以提供受试样品的杂交镨，和将受试样品杂交 镨与从对照样品产生的杂交语比较，其中至少一种miRNA的信号的改 变表示受试者患有CLL或处于发展CLL的风险中。
在一个实施方案中，微阵列包含针对人miRNome的大部分的 miRNA-特异性探针寡核普酸。在特定的实施方案中，微阵列包含针对 选自miR-29或miR-181和其组合的一种或多种miRNA的miRNA特异性 探针寡核苷酸。
可从基因特异性寡核苷酸探针(所述探针从已知的m i RM序列产 生)制备微阵列。对于各miRNA,阵列可包含两种不同的寡核苷酸探 针， 一种探针包含活性成熟序列，而另一种探针特异于miRNA的前体。 阵列还可包含可用作杂交严格条件的对照的对照，例如与人直系同源 物只相异于少数几个碱基的一个或多个小鼠序列。还可将来自两个物 种的tRNA印制在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定 的阳性对照。还可将用于非特异性杂交的一个或多个合适的对照包含在微芯片上。为了该目的，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源 性选择序列。
可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对 合适长度例如40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5，-胺修饰，并且使 用可商购获得的微阵列系统例如GeneMachine OmniGrid 100 Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化的载玻片进行印制。通过 用标记的引物逆转录靼RNA来制备相应于乾RNA的标记的cDM寡聚 物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交物变性以降解RM模板。然后 将所制备的标记的靶cDM在杂交条件(例如在25。 C下于6X SSPE/30% 甲酰胺中进行18小时，然后在37。 C下于O. 75XTNT中清洗40分钟) 下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固定的探针DNA识别样品中的 互补靶cDNA的位置上，发生杂交。标记的乾cDNA标记阵列上的其中 发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出信号由一列杂 交事件组成，其标示了特定cDNA序列的相对丰度，从而标示了患者样 品中相应的互补miR的相对丰度。才艮据一个实施方案，标记的cDNA 寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDM。然后通过使 用例如链霉抗生物素蛋白-Alexa647缀合物直接检测包含生物素的转 录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法扫描微阵列。阵列上的各点 的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
使用阵列对于miRM表达的检测具有几个有利方面。第一，可在 一个时间点上鉴定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过 寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成熟分子和前体分子的表达。第三， 与Northern印迹分析相比，芯片需要少量RM，并且使用2.5 ju g总 RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRM(每物种数百个)允许 对数个物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核苷酸 探针。这样的工具允许分析各已知的ffliR在不同条件下的跨物种表达。
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于raiRNome 的大部分(优选整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核苷酸的微芯 片可用于进行miR基因表达谱分析，以分析miR的表达模式。可使不同的raiR特征与已建立的疾病标记关联或直接与疾病状态关联。
按照本文中描述的表达语分析法，对来自怀疑患有癌症(例如 CLL)的受试者的样品的总RNA进行定量逆转录以提供一组与样品中的 RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。然后将靶寡脱氧核苷酸与包含 m i RNA-特异性探针寡核普酸的微阵列杂交，从而提供样品的杂交语。 结果是显示样品中iniRNA的表达模式的样品的杂交镨。杂交镨包括来 自靶寡脱氧核苷酸(其来自样品)与微阵列中的miRNA-特异性探针寡 核苷酸结合的信号。所述谱可记录为结合的存在或不存在(信号对0 信号)。更优选地，记录的谱包括来自各杂交的信号的强度。将所述 镨与从正常的(即非癌的)对照样品产生的杂交镨相比较。信号的改 变表示受试者中存在癌症。
用于测量miR基因表达的其他技术也在本领域技术人员的能力之 内，其包括用于测量RM转录和降解的速率的各种方法。
本发明还提供了诊断与一个或多个预后标记关联的CLL的方法， 该方法包括测量来自受试者的CLL受试样品中至少一种miR基因产物 的水平，将CLL受试样品中该至少一种raiR基因产物的水平与对照样 品中相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品相比受试样品中 至少一种miRNA的信号的改变(例如，增加、减少)表示受试者患有 与一个或多个预后标记关联的CLL或处于发展其的风险中。
CLL可与一个或多个预后标记或特征关联，包括与不利的(即， 负面)预后关联的标记或与良好的(即，正面)预后关联的标记。在 某些实施方案中，使用本文中描述的方法诊断的CLL与一个或多个不 利预后特征关联。
本文中描述了其表达在与这些预后标记中的每一个关联的CLL细 胞中发生改变的特定microRNA。在一个实施方案中，这样测量至少一 种miR基因产物的水平，即通过逆转录获自受试者的受试样品的RM 以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将该靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异 性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交镨，然后将 受试样品的杂交镨与从对照样品产生的杂交谱相比较来进行测量。
18不希望受任何理论束缚，据信，细胞中一种或多种miR基因产物 水平的改变可导致这些miR的一种或多种预期的靶失调，这可导致CLL 形成。因此，改变miR基因产物水平(例如，通过减少在CLL细胞中上 调的miR的水平，通过增加在癌细胞中下调的miR的水平)可成功地治 疗CLL。本文中描述了在CLL细胞中失调的miRM的假定的基因靶的 实例。
因此，本发明包括治疗受试者的CLL的方法，其中至少一种miR 基因产物在受试者的癌细胞中失调(例如，下调、上调)。当至少一种 分离的miR基因产物在CLL细胞中下调时，该方法包括施用有效量的 该至少一种分离的miR基因产物，以便癌细胞在受试者中的增殖被抑 制。当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中上调时，该方法包括 对受试者施用有效量的至少一种用于抑制该至少一种miR基因表达的 化合物(本文中称为miR基因表达抑制化合物)，以便CLL细胞的增 殖^皮抑制。
如本文中所使用的，术语"治疗"、"医治"和"疗法"是指改 善与疾病或病况例如CLL相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发 作，和/或减少疾病或病况的症状的严重度或频率。术语"受试者"和 "个体"在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长 类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或 其他牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实 施这群中，动物是人。
如本文中所使用的，分离的miR基因产物的"有效量"是足以在 患有CLL的受试者中抑制癌细胞增殖的量。通过考虑因素例如受试者 的大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用 的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确 定对给定的受试者施用的miR基因产物的有效量。
例如，分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的受试者的大 致或估计的体重。优选，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用这样 的有效量。例如，对受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可在大约5- 3000微克/kg体重、大约700-1000微克/kg体重的范围内或 大于大约1000微克/kg体重。
本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用分离 的miR基因产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次(例 如，作为单次注射或沉积(deposition) ) miR基因产物。可选择地， 可以每天1次或2次对受试者施用miR基因产物，进行大约3至大约 28天，特别地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每 天1次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时， 应理解，对受试者施用的miR基因产物的有效量可包括在整个给药方 案中施用的基因产物的总量。
如本文中使用的，"分离的，，miR基因产物是合成的或通过人工 介入从天然状态改变或取出的miR基因产物。例如，合成的miR基因 产物，或部分或完全从其天然状态的共存材料分离的miR基因产物被 认为是"分离的，，。分离的miR基因产物可以以大体上纯化的形式存 在，或可以存在于已将所述miR基因产物递送入其中的细胞中。因此， 有意地被递送至细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是"分离 的"miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也 被认为是"分离的"分子。
分离的miR基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本 领域已知的方法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案 中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学 合成miR基因产物。合成RNA分子或合成试剂的提供商包括例如 Proligo (Hamburg, Germany)、 Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A.) 、 Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL， U. S.A. )、 Glen Research (Sterling, VA， U. S. A.) 、 ChemGenes (Ashland, MA， U. S. A.)和Cruachem (Glasgow, UK)。
可选择地，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒 表达miR基因产物。用于从质粒表达RM的合适的启动子包括例如U6 或HI RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质粒还可包括用
于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的 miR基因产物。还可将从重組质粒表达的miR基因产物递送至癌细胞 并且在其中直接表达。下面更详细地论述重组质粒将miR基因产物递 送至癌细胞的用途。
miR基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组 质粒表达。在一个实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA 前体分子，然后通过合适的加工系统(包括但不限于癌细胞中现有的 加工系统)将该前体分子加工成功能性raiR基因产物。其他合适的加 工系统包括例如体外果蝇细胞裂解物系统(例如，如属于Tuschl等人 的美国公开专利申请2002/0086356中所描述的，其全部公开内容通过 引用合并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如属于Yang等人 的美国公开专利申请2004/0014113中所描述的，其全部公开内容通过 引用合并入本文)。
适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入 质粒以表达基因产物的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在 本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Zeng等人(2002)， Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002)， Nat. Biotechnol， 20:446-448; Brummelkamp等人 (2002)， Science 296:550-553; Miyagishi等人(2002)， Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison 等人 (2002)， Genes Dev. 16:948-958; Lee等人 (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505;和Paul等人(2002)， Nat. Biotechnol. 20:505-508，其全部公开内容通过引用合并入本文。
在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV立即早 期启动子(intermediate-early promoter )控制下编码miR前体RNA 的序列。如本文中所使用的，"在启动子的控制下"是指编码miR基 因产物的核酸序列位于启动子的3'端，以便启动子可起始miR基因产 物编码序列的转录。miR基因产物还可从重组病毒栽体表达。可预期miR基因产物可 从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技 术从培养的细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA或所述RNA 可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒栽体将ffliR基因 产物递送至癌细胞的用途。
本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达 RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括例如U6或H1 RM po 1 III启动子序列，或巨细胞病毒启动子。其他合适的启动子的选择在 本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在 癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒栽体；例如， 来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒 (LV)、弹状病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、疱渗病毒等的 栽体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型化栽体 或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向 性。
例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies )、 埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本发明 的慢病毒栽体。可通过对栽体进行工程改造以表达不同的衣壳蛋白血 清型来制备本发明的AAV载体，使之靶向不同的细胞。例如，表达血 清型2型基因组上的血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV2/2。AAV2/2 栽体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而 产生AAV 2/5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV栽体的 技术在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，Rabinowitz， J. E.， 等人(2002)， J. Virol. 76:791-801，其全部公开内容通过引用合 并入本文。
适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RM的
核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达 的RNA产物的回收在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，
22Dornburg (1995)， Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988)， Biotechniques 6:608-614; Miller (1990)， Hum. Gene Therap. 1:5-14;和Anderson (1998), Nature 392:25-30，其全部公开内容 通过引用合并入本文。
特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达raiR 基因产物的合适的AV栽体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将 载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等人(2002)， Nat. Biotech. 20:1006-1010，其全部^〉开内容通过引用合并入本文。用于表达miR 基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于 将载体递送至靶细胞的方法描述于Samulski等人(1987)， J. Virol. 61:3096-3101; Fisher等人(1996)， J. Virol, 70:520-532; Samulski等人(1989)， J. Virol. 63: 3822-3826;美国专利 5， 252， 479;美国专利5， 139， 941;国际专利申请WO 94/13788;和国 际专利申请WO 93/24641，其全部公开内容通过引用合并入本文。在 一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体表 达miR基因产物。
在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6 RM 启动子控制下的与polyT终止序列有效连接的编码miR前体RM的核 酸序列。如本文中所使用的，"与polyT终止序列有效连接"是指编 码有义或反义链的核酸序列以5'方向与polyT终止信号紧密邻接。在 从栽体转录miR序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。
在本发明的治疗方法的其他实施方案中，还可对受试者施用有效 量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文中所使用的，"抑制miR 表达"是指治疗后miR基因产物的活性成熟形式的产量低于治疗前产 生的量。通过使用例如上述用于诊断方法的测定miR转录物水平的技 术，本领域技术人员可容易地确定miR的表达在癌细胞中是否已被抑 制。抑制可在基因表达的水平上(即，通过抑制编码ffliR基因产物的 miR基因的转录)或在加工的水平上(例如，通过抑制miR前体至成熟 的活性miR的加工)发生。如本文中所使用的，抑制miR表达的化合物的"有效量，，是足以 在患有与癌症相关性染色体特征关联的癌症的受试者中抑制癌细胞的 增殖的量。通过考虑因素，例如受试者的大小和体重、疾病侵入的程 度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是 全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的抑制 miR表达的化合物的有效量。
例如，抑制表达的化合物的有效量可基于待治疗的受试者的大致 或估计的体重。如本文中所描述的，除其他以外，胃肠外或肠内施用 这样的有效量。例如，对受试者施用的抑制表达的化合物的有效量可 在大约5- 3000微克/kg体重、大约700-1000微克/kg体重的范围内 或其可大于大约1000微克/kg体重。
本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用抑制 miR表达的化合物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次(例 如，作为单次注射或沉积)抑制表达的化合物。可选择地，可以每天 1次或2次对受试者施用抑制表达的化合物，进行大约3至大约28天， 更优选大约7至大约IO天的时期。在特定的给药方案中，每天1次施 用抑制表达的化合物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理 解，对受试者施用的抑制表达的化合物的有效量可包括在整个给药方 案中施用的化合物的总量。
用于抑制miR基因表达的合适的化合物包括双链RM (例如短的 或小干扰RNA或"siRNA")、反义核酸和酶促RNA分子例如核酶。这 些化合物中的每一种可被靼向给定的miR基因产物并且破坏靶miR基 因产物或诱导靶miR基因产物的破坏。
例如，给定的miR基因的表达可通过用分离的双链RNA( "dsRNA") 分子诱导miR基因的RM千扰来抑制，所述双链RNA分子与miR基因 产物的至少一部分具有至少90%、例如至少95%、至少98°/。、至少99% 或100%的序列同源性。在特定的实施方案中，dsRM分子是"短的或 小干扰RM"或"siRM"。
用于本方法的siRNA包括长度大约17个核苷酸至大约29个核苷
24酸、优选长度大约19至大约25个核苷酸的短双链RNA。 siRNA包含通 过标准Watson-Crick碱基配对相互作用(在下文中"碱基配对")退 火在一起的有义RM链和互补反义RNA链。有义链包含大体上与靶miR 基因产物内包含的核酸序列同一的核酸序列。
如本文中所使用的，siRNA中与靶mRM内包含的靶序列"大体上 同一"的核酸序列是与靶序列同一的核酸序列或与靶序列相异于l或 2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义和反义链可包括两个互补的单链 RM分子或可包括其中两个互补部分碱基配对并且通过单链"发夹结 构"区域共价连接的单个分子。
siRNA还可以是与天然存在的RNA相异于一个或多个核苷酸的添 加、缺失、置换和/或改变的经改变的RM。这样的改变可包括非核苷 酸材料的添加，例如至siRNA的末端或至siRNA的一个或多个内部核 苷酸的添加，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修饰或用脱氧核糖核普酸 对siRNA中的一个或多个核普酸的置换。
siRNA的一条或两条链还可包含3:悬突。如本文中所用的，"3' 悬突"是指从双链RNA链的3'-末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。 因此，在某些实施方案中，siRNA包含至少一个长度为1至大约6个 核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为1至大约5 个核苷酸、长度为1至大约4个核苷酸或长度为大约2至大约4个核 苷酸的3'悬突。在特定的实施方案中，3:悬突存在于siRNA的两条链 上，且其长度为2个核苷酸。例如，siRNA的各条链可包含二胸苷酸 ("TT，，)或二尿苷酸("uu")的3'悬突。
siRNA可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体 表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测dsRM 或siRNA分子的示例性方法描述于属于Gewirtz的美国公开专利申请 2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请2004/0018176， 其全部公开内容通过引用合并入本文。
给定的miR基因的表达还可通过反义核酸抑制。如本文中所使用 的，"反义核酸，，是指通过RM-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用与耙RM结合的核酸分子，其改变耙RNA的活性。适合用于本方法 的反义核酸是通常包含与miR基因产物中的连续核酸序列互补的核酸 序列的单链核酸(例如，RNA、 DM、 RM-DNA嵌合物、PM)。反义核酸 可包含与miR基因产物中的连续核酸序列50-100%互补、75-100%互补 或95-100%互补的核酸序列。本文提供了用于miR基因产物的核酸序 列。不希望受任何理论束缚，据信，反义核酸激活RNA酶H或降解miR 基因产物/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。
反义核酸还可包含对核酸主链或对糖和碱基部分(或它们的等价 物)的修饰，从而增加靶特异性、核酸酶抗性、递送或与分子的功效 相关的其他性质。此类修饰包括胆固醇部分、双链体插入剂例如吖啶 或一种或多种抗核酸酶基团。
反义核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载 体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测的 示例性方法在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，S te i n和Cheng (1993)， Science 261:1004以及属于Woolf 等人的美国专利 5， 849， 902，其全部公开内容通过引用合并入本文。
给定的miR基因的表达还可通过酶促核酸(enzymatic nucleic acid)抑制。如本文中所使用的"酶促核酸"是指包含与miR基因产 物的连续核酸序列互补的底物结合区并且能够特异性切割miR基因产 物的核酸。酶促核酸底物结合区可以例如与miR基因产物中的连续核 酸序列50-100%互补、75-100%互补或95-100%互补。酶促核酸还可包 括在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。用于本方法的示例性酶促核酸 是核酶。
酶促核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒栽 体表达，如上文对分离的miR基因产物所描述的。用于产生和检测 dsRNA或s iRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck (1995): Nucl. Acids Res. 23: 2092-96; Hammann等人(1999)， Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31;以及属于Cech等人的美国专利 4, 987, 071,其全部公开内容通过引用合并入本文。至少一种miR基因产物或至少一种用于抑制raiR表达的化合物的 施用将在患有与癌症相关性染色体特征关联的癌症的受试者中抑制癌 细胞的增殖。如本文中所使用的，"抑制癌细胞的增殖"是指杀死细 胞或永久性或暂时地阻止或减緩细胞的生长。如果受试者中癌细胞的 数目在施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物后保持恒定或 减少，那么可推断癌细胞增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但
肿瘤生长的速度下降，则也可推断癌细胞增殖被抑制。
受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转
移性肿瘤块的大小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通 过免疫组织学方法、流式细胞术或经设计用于检测癌细胞的特征表面 标记的其他4支术来测量。
可通过适合用于将此类化合物递送至受试者的癌细胞的任何方 法来对受试者施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。例如，
染受试者的细胞的方法来施用miR基因产物或抑制miR表达的化合物。 在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或抑制miR基 因表达的化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。
用于真核细胞的转染方法在本领域内是熟知的，包括例如核酸至 细胞的细胞核或前核(pronucleus)的直接注射、电穿孔、脂质体转 移和由亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、基因枪或微粒加 速、磷酸钙沉淀以及由病毒载体介导的转染。
例如，细胞可用质脂体转移化合物例如DOTAP (N-[1-(2， 3-二油 酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基石克酸铵，Boehringer- Mannheim) 或等价物例如LIPOFECTIN进行转染。使用的核酸的量对于实施本发明 不是至关重要的；可接受的结果可用0. 1-100微克核酸/105个细胞来 获得。例如，可使用在3微克D0TAP中的大约0. 5微克质粒载体/105 个细胞的比例。
还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用raiR基 因产物或抑制ffliR基因表达的化合物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内给药。合适的胃肠外施用途径包括例
如血管内给药(例如，静脉内团注(bolus injection)、静脉内输注、 动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织外周 (peri-t issue )和组织内注射(例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网 膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通 过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其他安置装置(例 如，；f见网膜丸剂(retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或 凝胶状材料的植入物)；以及吸入。特别合适的施用途径是注射、输注 和静脉内施用入患者。
在本方法中，miR基因产物或抑制miR基因产物表达的化合物可 以以棵露的RNA形式、与递送试剂一起或以包含表达miR基因产物或 抑制表达的化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)的形 式对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TK0 亲脂试剂、lipofectin、 1 ipofectamine、 cellfectin、聚阳离子(例
如，多聚赖氨酸)和脂质体。
本文中公开了包含表达miR基因产物或抑制miR基因表达的化合 物的序列的重组质粒和病毒载体、以及用于将此类质粒和栽体递送至 癌细胞的4支术。
在特定的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物或抑制miR基 因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质 体还可增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小嚢泡的 脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常包括中性的或带 负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如 期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多 用于制备脂质体的方法，例如如Szoka等人(1980)， Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467; 和美国专利4,235, 871 、 4, 501,728 、 4， 837， 028和5， 019， 369 (其全部^^开内容通过引用合并入本文)中所 描述的方法。
用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结
28合癌细胞中普遍的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是 优选的。
用于本方法的脂质体还可进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统
("丽S")和网状内皮系统("RES")清除。此类经修饰的脂质体在表 面具有调理作用-抑制部分或所述部分被整合入脂质体结构。在特别优 选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制部分和配体。 用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体
膜结合的巨大的亲水聚合物。如本文中所使用的，抑制调理作用的部 分，当其通过化学或物理方式(例如通过将脂溶性锚嵌入膜本身或通 过与膜脂质的活性基团的直接结合)附着至膜时，与脂质体膜"结合"。 此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被醒S和RES 吸收的保护性表面层；例如，如美国专利4，920，016中所描述的，其 全部公开内容通过引用合并入本文。
适合于修饰脂质体的抑制调理作用的部分优选是具有大约500至 大约40， 000道尔顿，更优选大约2， 000至大约20， 000道尔顿的数量 平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二 醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG硬脂酸酯；合 成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性的、分支 的或树枝状聚酰胺；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基化学连接 的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GM1。 PEG、 甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑 制调理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚乙二胺、聚 乙烯胺或多聚核普酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是 包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖 醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶(carrageenan ); 胺化的多糖或低聚糖(线性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例 如与具有所得的羧基的连接的碳酸的衍生物反应的多糖或低聚糖。优 选，抑制调理作用的部分是PEG、 PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍 生物修饰的脂质体有时称为"PEG化脂质体"。可通过许多熟知的技术中的任一种将抑制调理作用的部分结合
至脂质体膜。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺 脂质可溶性锚结合，然后再与膜结合。类似地，可使用Na(CN)BH3和 溶剂混合物(例如以30: 12比例的四氢呋喃和水)在60° C下通过还 原胺化作用，用硬脂酰胺脂质可溶性锚衍生葡聚糖(dextran)聚合物。 用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体 保持更长时间。因此，此类脂质体有时称为"隐形(stealth)"脂质 体。已知隐形脂质体在通过多孔或"渗漏"微脉管系统饲喂的组织中 积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如实体瘤将有效地 积累这些脂质体；参见Gabizon，等人(1988)， Proc. Natl. Acad. Sci.， U.S.A., 18: 6949-53。此外，减少的通过RES的吸收通过阻止 脂质体在肝和脾中的大量积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调 理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适合用于将miR基因产物或抑制 miR基因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤 细胞。
可在对受试者施用前，按照本领域已知的技术将miR基因产物或 抑制miR基因表达的化合物配制为药物组合物，有时称为"药剂"。 因此，本发明包括用于治疗CLL的药物组合物。在一个实施方案中， 药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物和药学上可接受的栽 体。在特定的实施方案中，该至少一种miR基因产物相应于与适合的 对照细胞相比在CLL细胞中具有减少的表达水平的miR基因产物。在 某些实施方案中，分离的miR基因产物选自迈2V -2夕或迈L -/c!i7和其组 合。
在其他实施方案中，本发明的药物组合物包括至少一种抑制miR 表达的化合物。在特定的实施方案中，至少一种抑制miR基因表达的 化合物特异于其在CLL细胞中的表达高于对照细胞的miR基因。在某 些实施方案中，抑制miR基因表达的化合物特异于选自或 忠/i -7《7和其组合的一种或多种miR基因产物。
本发明的药物组合物表征为是至少无菌的和无热原的。如本文中所使用的，"药物制剂"包括用于人和兽医用途的制剂。用于制备本 发明的药物组合物方法在本领域技术人员的能力之内，例如在
Remington's Pharmaceutical Science, 第17版，Mack Publishing Company, Easton， Pa. (1985)中所描述的，其全部分公开内容通过 引用合并入本文。
本药物制剂包含至少一种与药学上可接受的载体混合的miR基因 产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码它们的序列 的核酸)(例如，按重量计算O. 1至90%)，或其生理上可接受的盐。 本发明的药物制剂还可包含至少一种由脂质体封装的miR基因产物或 抑制raiR基因表达的化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸) 和药学上可接受的载体。
特别适合的药学上可接受的载体是水、緩冲水溶液、常用盐溶液、 0. 4%的盐溶液、0. 3%的甘氨酸、透明质酸等。
在特定的实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抗核酸 酶降解的miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包 含编码它们的序列的核酸)。本领域技术人员可以例如通过将一个或 多个在2'-位置被修饰的核糖核苷酸掺入miR基因产物来容易地合成 具有核酸酶抗性的核酸。合适的2'-修饰的核糖核苷酸包括在2'-位置 用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修饰的核糖核苷酸。
本发明的药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合 适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、重量摩尔渗透压浓度调节剂、 緩冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括例如生理上生物相容性緩沖剂 (例如，氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙 螯合络合物(例如，钙DTPA、 CaNaDTPA-双酰胺)的添加或任选地，钙 或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的添加。 本发明的药物组合物可以以液体形式包装使用或可以进行冻千。
对于本发明的固体药物组合物，可使用常规无毒性的固体的药学 上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖 精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。例如，用于口服施用的固体药物组合物可包含上文所列的任一载
体和赋形剂以及10-95%,优选25%-75%的至少一种miR基因产物或抑 制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。 用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可包含按重量计算0. 01-20%,优 选l。/。-10。/。的至少一种封装在上文所述的脂质体中的miR基因产物或抑 制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸) 和喷射剂。还可如所期望的包含载体例如卵磷脂以用于鼻内递送。
本发明还包括鉴定抗CLL试剂的方法，该方法包括给细胞提供受 试试剂和测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案 中，该方法包括给细胞提供受试试剂和测量至少一种与CLL细胞中减 少的表达水平关联的miR基因产物的水平。与合适的对照细胞相比， 细胞中miR基因产物水平的增加表示受试试剂为抗CLL试剂。在特定 的实施方案中，至少一种与CLL细胞中减少的表达水平关联的raiR基 因产物选自肌W-W或肌'i -M7和其组合。
在其他实施方案中，该方法包括给细胞提供受试试剂和测量至少 一种与CLL细胞中增加的表达水平关联的miR基因产物的水平。与合 适的对照细胞相比，细胞中miR基因产物水平的减少表示受试试剂是 抗CLL试剂。在特定的实施方案中，至少一种与CLL细胞中增加的表 达水平关联的miR基因产物选自瓜/j -i^或范/i -747和其组合。
合适的试剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)和生物大分子 (例如，蛋白质、核酸)。试剂可通过重组、合成产生，或其可从天然 来源分离(即，纯化)。用于给细胞提供此类试剂的各种方法(例如， 转染)在本领域内是熟知的，并且在上文中描述了几种此类方法。用 于检测至少一种miR基因产物的表达的方法(例如，Northern印迹、 原位杂交、RT-PCR、表达谦分析)在本领域内也是熟知的。
本发明现将通过下列非限定性实施例来举例说明。
实施例CLL样品和microRNA孩i:芯片实验。
在CLL Research Consortium institution, 在征得经诊断患有 CLL的患者同意后，获得80个CLL样品。简而言之，从CLL患者获得 血液，通过Ficol 1/Hypaque梯度离心(Amersham， Piscataway, NJ) 分离淋巴细胞并使用标准Trizol法处理其以进行RNA提取。如之前所 述进行蛋白质提取。lfl如之前所述进行MicroRNA-微芯片实验。9各 microRNA孩i芯片包舍相应于326个人和249个小鼠microRNA基因的 两重探针。如之前所述进行统计学分析。11为了鉴定统计学上显著的 差异表达的microRNA， ^吏用BRB ArrayTools进4亍种类预测分析。 DNA-构建体、转染、Western印迹和荧光素酶测定法 将包含5'和3' UTR cDNA的全长7TZ/ cDNA克隆入pUSEamp栽 体(Upstate Biotechnology, Chicago, IL)(用于图le) 。 2夕6 和迈/v —RNA欢链体购自A迈bion (Austin, TX) 。 i口之前戶斤述进孑亍 转染。12用双荧光素酶测定系统(Promega)测定萤火虫和海肾的荧光 素酶活性，并将萤火虫的荧光素酶活性对海肾荧光素酶活性进行标准 化。如之前所述4，使用抗7TZ7单克隆抗体(克隆27D6)进行细胞裂 解物制备和Western印迹分析。
结果和讨论
Tell的高表达与侵袭性B-CLL表型相关。
为了评价B-CLL样品中ra7和microRNA的表达，选择三组 B-CLL: 23个进展緩慢的B-CLL样品、25个侵袭性B-CLL样品和32 个显示lld缺失的侵袭性B-CLL样品。样品的详细描述示于图4a-4d。
MicroRNA樣￡芯片实验显示三組CLL在microRNA表达才莫式上显示 显著的特征差异(参见图3-表1和图5-表2)。
为了测定三组CLL中7TW蛋白的表达，使用27D6 Ta7单克隆 抗体进4亍Western印迹分析。这些实验的结果示于图la-b.
7TL 的表达被评定为低水平、中等水平、高水平和极高水平。我 们的实验在23个进展緩慢的B-CLL的15个(65%)中、25个侵袭性B-CLL
33的11个(44%)中和32个具有llq缺失的侵袭性B-CLL的1个(3%)中显 示低水平；然而在23个进展緩慢的B-CLL的1个(4%)中、25个侵袭 性B-CLL的14个(56%)中和在32个具有llq缺失的侵袭性B-CLL 的24个(75°/。)中观察到高和极高的ra7的表达(图lb)。在本文中，本发明者认为ra7的过表达与侵袭性B-CLL表型 (p〈10,和11q缺失(p〈l(T)相关。该结果与最近公布的研究一致，所 述研究显示人CLL中的高TCL1的表达与未突变的Vh状悉和ZAP70阳 性相关。5MiR-29和miR-181乾向Tcll的表达为了确定輩巴向7Ti^的miRNA， 4吏用由Bielefeld University Bioinfo鹿tics Server提供的RNAhybrid软件和miRBase数据库13。 在耙向7n:7的miR-候选物中，发现范/i -2外和历/W-JW6 (图lc，具 有更低同源性的几个其他位点未显示)在具有llq缺失的侵袭性B-CLL 中也下调(图3-表1)。这些miR的表达通过代表性样品组中的实时RT-PCR来验证(图 4a-4d)。此外，之前已显示，miR-29家族成员的表达可区分具有良好和不 良预后的CLL样品。9然后如之前所描述的，使用插入到荧光素酶ORF 下游的3' UTR确定这些miR是否确实耙向ra/的表达。12用所 示的历/y -2外或混杂(scramble)阴性对照以及所示的包含cDM 的一部分(含有与范/i -ZP同源的区域)的pGL3构建体(Tcll)或单独 的pGL3载体共转染HEK293细胞。对于yz /i —W测定，将全长cDM以有义(TcllFL)或反义 (TcllFLAS)方向插入pGL3栽体。图ld显示7VX7 niRNA的表达被迈M-W 和/Z7/W:W抑制。为了验证这些发现，将包含5'和UTR的全长ra7 cDNA克隆入CMV哺乳动物表达载体并且观察迈L -2外和/z/"-J476是 否影响7TZ7蛋白的表达水平。我们将该构建体与巡/W-^^. 和前-miR阴性对照(混杂)共转染入293细胞，如在图le上所显示的。这些实验显示与顶/i -2夕和迈/j -747的共表达显著减少了TCLl的表达(图le，泳道2对泳道1和3)。因此，本文中显示迈W-i^6和巡/i -7W6在mRNA和蛋白质水平上 草巴向7a7的表达。有趣地，在B-CLL样品中肌V -Z^和迈/^ -/《M表达与ra7蛋白表达之间存在负相关(图If):所有显示高肌7 -"6和迈/i -7^6表达的样品也显示低或中等的ra/w《《；所有显示极高 ra7的表达的样品普遍显示低迈/i -2外和/3 /> -7476的表达。这些结果显示CLL中7^7的表达至少部分受历L -Z 和/Z7/7 -7W调控。本文中证明，ra7的表达受/Z72'w-w和/z L -7(^调控，并且该调控与所研究的三组B-CLL相关。尽管观察到ra/蛋白表达和这两种miR之间的负相关，但显著比例的B-CLL样品显示低7TZ7的表达和低 yz /i -2夕和范/i -747的表达(图lf)。这表明在这些样品中，7^7的表 达在转录上被下调或被其他miRNA下调。迈/W-W和肌V -7W都不位于 llq的事实表明该区域可能包含这两种raiR的表达的重要调节子。有趣地，yz /v -7《7在B细胞中差异表达，7TZ7主要是B细胞特异 性基因。14然而不希望受理论束縛，本发明者在本文中认为在B细胞 成熟的不同阶段raj和肌V -7W表达之间存在负相关。因为范/i -i^ 和/z7/i -/<W是天然的7TX7抑制剂，因此这些miR可以是过表达7TZ7 的B-CLL的治疗剂的有用的候选物。根据专利法规的条款，已在其优选实施方案中解释和说明了本发 明实施的原理和模式。然而，必须理解，可以不按明确解释和说明的 方法来实施本发明而不背离其精神或范围。参考文献上述参考文献和下面的参考文献，以它们为本文中所示内容提供 示例性方案或其他详细补充的程度，明确地通过引用合并入本文。1. Sgambati M， Linet M, Devesa S. Chronic Lymphocytic Leukemia, Epidemiological, Familial, and Genetic Aspects. Chronic Lymphocytic Leukemias， Second Edition, Revised and Expanded,Bruce Cheson， Ed Marcel Dekker， Inc. NewYork. 200; 33-62.2. VirgilioL, Narducci MG， IsobeM，等人Identification of the TCLl gene involved in T—eel 1 malignancies. Proc Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91 :12530-12534.3. Bichi R， Shinton SA， Martin ES，等人 Human Chronic Lymphocytic Leukemia modeled in mouse by targeted TCLl expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99:6955-6960.4. Pekarsky Y， Koval A， Hallas C,等人Tell enhances Akt kinase activity and mediates its nuclear translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97:3028—3033.5. HerlingM, Patel KA， Khalili J，等人 TCLl shows a regulated expression pattern in Chronic Lymphocytic Leukemia that correlates with molecular subtypes and proliferative state. Leukemia. 2006; 20:280-285.6. Dohner H， Stilgenbauer S， Benner A,等人Genomic aberrations and survival in Chronic Lymphocytic Leukemia. N. Engl. J. Med. 2000; 343: 1910-1916.7. Anibros V. The functions of animal microRNAs. Nature. 2004;431: 350-355.8. Calin GA， Liu CG, Sevignani C，等人 MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell Chronic Lymphocytic Leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101:11755-11760.369. Calin GA， Ferracin M， Cimmino A，等人A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in Chronic Lymphocytic Leukemia. N. Engl. J.Med. 2005; 353:1793-1801.10. Palamarchuk A， Efanov A， Maximov V, Aqeilan RI， Croce CM， Pekarsky Y. Akt phosphorylates Tal 1 oncoprotein and inhibits its repressor activity. Cancer Res. 2005; 65:4515-4519.11. Vol inia S, Calin GA， Liu CG,等人 A'microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 2257-2261.12. Cimmino A， Calin GA， FabbriM，等人miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102: 13944-13949.13. Griffiths-Jones S， Grocock RJ， van Dongen S， Bateman A， Enright AJ. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 2006'， 34:D140-144.14. Ramkissoon SH，Mainwaring LA，Ogasawara Y， 等人 Hematopoietic-specific microRNA expression in human cells. Uuk Res. 2005.
权利要求
1. 诊断受试者是否患有慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)或处于发展其的风险中的方法，该方法包括测量来自所述受试者的受试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，受试样品中miR基因产物的水平的改变表示受试者患有B-CLL或处于发展B-CLL的风险中。
2. 权利要求l的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-29或miR-181。
3. 权利要求1的方法，其中所述至少一种raiR基因产物是miR-29b。
4. 权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-181b。
5. 权利要求1的方法，其中^f吏用Northern印迹分析测量所述至少一种miR基因产物的水平。
6. 权利要求1的方法，其中受试样品中所述至少一种miR基因产物的水平低于对照样品中相应的miR基因产物的水平。
7. 权利要求1的方法，其中受试样品中所述至少一种miR基因产物的水平高于对照样品中相应的miR基因产物的水平。
8. 用于诊断受试者中与一个或多个预后标记关联的B-CLL的方法，该方法包括测量来自所述受试者的B-CLL样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，受试样品中至少一种miR基因产物的水平的改变表示受试者患有与一个或多个预后标记关联的B-CLL。
9. 诊断受试者是否患有B-CLL或处于发展其的风险中的方法，该方法包括(1) 逆转录来自获自受试者的受试样品的RM以提供一组靶寡脱氧核苷酸；(2) 将耙寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交谱；和(3)将受试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相比较， 其中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有B-CLL或处于发展B-CLL的风险中。
10. 权利要求9的方法，其中与从对照样品产生的信号相比，至 少一种miRNA的信号下调。
11. 权利要求9的方法，其中与从对照样品产生的信号相比，至 少一种miRNA的信号上调。
12. 权利要求9的方法，其中微阵列包含针对选自miR-29或 miR-181和其组合的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸。
13. 诊断受试者是否患有与受试者中一个或多个不利预后标记 关联的B-CLL或处于发展其的风险中的方法，该方法包括(1) 逆转录来自获自受试者的受试样品的MA以提供一组靶 寡脱氧核苷酸；(2) 将靶寡脱氧核苷酸与包含miRM-特异性探针寡核苷酸 的微阵列杂交，从而提供所迷受试样品的杂交镨；和(3) 将受试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相比较， 其中信号的改变表示受试者患有癌症或处于发展癌症的风险中。
14. 权利要求13的方法，其中微阵列包含至少一个针对选自 miR-29或miR-181和其组合的miRM的miRM-特异性探针寡核苷酸。
15. 治疗患有B-CLL的受试者的B-CLL的方法，在所述B-CLL中， 与对照细胞相比，至少一种raiR基因产物在受试者的癌细胞中下调或 上调，该方法包括(1) 当至少一种miR基因产物在癌细胞中下调时，对受试者 施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，以便癌细胞在受试者中 的增殖被抑制；或(2) 当至少一种miR基因产物在癌细胞中上调时，对受试者 施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种raiR基因产物表达的化合物，以便癌细胞在受试者中所述的增殖被抑制。
16. 权利要求15的方法，其中步骤(l)中所述至少一种分离的 miR基因产物选自miR-29、 miR-181和其组合。
17. 权利要求15的方法，其中步骤(2)中至少一种miR基因产物 选自迈iR-29、 miR-181和其組合。
18. 治疗受试者的B-CLL的方法，该方法包括(1) 测定与对照细胞相比，B-CLL细胞中至少一种miR基因 产物的量；和(2) 通过下列步骤改变B-CLL细胞中表达的miR基因产物的i) 对受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产 物，如果癌细胞中表达的niiR基因产物的量低于对照细胞中表达的miR 基因产物的量；或ii) 对受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少 一种niiR基因产物的表达的化合物，如果癌细胞中表达的miR基因产 物的量高于对照细胞中表达的miR基因产物的量，以便癌细胞在受试 者中的增殖被抑制。
19. 权利要求18的方法，其中步骤(i)中所述至少一种分离的 miR基因产物选自miR-29、 miR-181和其组合。
20. 权利要求18的方法，其中步骤(ii)中所述至少一种miR基 因产物选自miR-29、 ffliR-181和其组合。
21. 用于治疗B-CLL的药物组合物，其包含至少一种分离的ffliJR 基因产物和药学上可接受的载体。
22. 权利要求21的药物组合物，其中所述至少一种分离的miR 基因产物相应于与合适的对照细胞相比在B-CLL细胞中下调的miR基 因产物。
23. 权利要求22的药物组合物，其中所述分离的ffliR基因产物 选自miR-29、 miR-181和其组合。
24. 用于治疗B-CLL的药物组合物，其包含至少一种miR表达抑制剂化合物和药学上可接受的载体。
25. 权利要求24的药物组合物，其中所述至少一种miR表达抑 制剂化合物特异于与合适的对照细胞相比在B-CLL细胞中上调的miR 基因产物。
26. 权利要求25的药物组合物，其中所述至少一种miR表达抑 制剂化合物特异于选自miR-29、 miR-181和其组合的miR基因产物。
27. 鉴定抗B-CLL试剂的方法，该方法包括给细胞提供受试试剂 和测量至少一种与B-CLL细胞中减少的表达水平关联的miR基因产物 的水平，其中与合适的对照细胞相比，细胞中miR基因产物水平的增 加表示所述受试试剂是抗B-CLL试剂。
28. 权利要求27的方法，其中所述miR基因产物选自miR-29、 miR-181和其组合。
29. 鉴定抗B-CLL试剂的方法，该方法包括给细胞提供受试试剂 和测量至少一种与B-CLL细胞中增加的表达水平关联的miR基因产物 的水平，其中与合适的对照细胞相比，细胞中miR基因产物水平的减 少表示所述受试试剂是抗B-CLL试剂。
30. 权利要求29的方法，其中所述miR基因产物选自miR-29、 miR-181和其组合。
全文摘要
本发明提供了用于诊断、预后和治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的新的方法和组合物。本发明还提供了鉴定抗CLL试剂的方法。
文档编号C12Q1/68GK101535505SQ200780040146
公开日2009年9月16日 申请日期2007年9月17日 优先权日2006年9月19日
发明者C·M·克罗斯 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会