一种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒，所述试剂盒包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫，所述衬垫上设有小孔，装有TBTVdF引物的试剂管、装有TVDVdF引物的试剂管、装有SatTBTVdF引物的试剂管、装有TBTVdR引物的试剂管、装有TVDVdR引物的试剂管、装有SatTBTVdR引物的试剂管、装有CTAB缓冲液的试剂管、装有PCR扩增试剂的试剂管、装有琼脂糖凝胶的试剂管被设置在所述小孔内，盒盖顶部内侧设有检测对比卡，本实用新型在对烟草丛顶病多种病原物复合侵染烟草和传毒介体昆虫进行检测时具有高效、灵敏、特异且低成本的特点，可以准确检测烟草及传毒介体昆虫中是否含有TBTV、TVDV和Sat-TBTV病原物；本实用新型的试剂盒结构简单、设计合理，方便携带、保存，不易受污染。
【专利说明】—种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于分子生物学【技术领域】，涉及一种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒。
【背景技术】
[0002]烟草丛顶病(tobacco bushy top disease)于1957年在津巴布韦北部的春克旺里烟区首次发生，此后爆发流行并造成很大损失。烟草丛顶病在我国的云南早有出现，但长期以来由于该病仅为零星发生，未对烟草生产造成重大损失而被忽视，直到1993年在云南保山、大理等地大面积爆发流行后才逐渐受到关注。此后该病在我国云南中西部烟区大规模流行，给部分烟区造成毁灭性损失，发病区域除涉及保山、大理、楚雄3个州市外，昆明、玉溪、红河、思茅、文山、西双版纳及怒江等州市也有烟草丛顶病零星发生。截止2001年，云南省累计发病面积达51300 hm2，其中8700 hm2绝收，1400 hm2改种，直接经济损失高达2.1亿元，烟草丛顶病已经成为云南省自20世纪90年代以来唯一导致大面积绝产的烟草病害。
[0003]烟草丛顶病由幽影病毒属的烟草丛顶病毒(TbAacco bushy top virus, TBTV)和黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属的烟草扭脉病毒(TbAacco vein distorting virus, TVDV)复合侵染引起。另外在云南烟草丛顶病的感病烟株中常检测到一条伴随TBTV出现且其分子量约为1000 bp的小分子RNA，根据目前的研究推测该小分子RNA为TBTV的卫星RNA，称其为烟草丛顶病毒类似卫星 RNA (Tobacco bushy top virus satellite-like RNA,Sat-TBTV)0 2010年又从感染烟草丛顶病的植株中检测到了大小为3.0kbp与烟草丛顶病相关的RNA,第九次国际病毒分类报告中将其命名为TVDVaRNA (Tobacco vein distortingvirus-associated RNA，TVDVaRNA)。TBTV基因组不含编码外壳蛋白的基因，它可通过摩擦接种传播，在辅助病毒TVDV的帮助下可通过蚜虫传播。目前的研究结果表明，自然条件下表现典型烟草丛顶病症状的烟株，都由上述4种病原物复合侵染引起，而云南烟草丛顶病发病区很多未表现症状的烟株，也经常能够检测到TVDV及TVDVaRNA。迄今，国内外尚无特别有效的植物病毒病防治药剂，因此除了严防蚜虫的传播外加强烟株及蚜虫中烟草丛顶病病原复合体的检测和监测，对于准确诊断病害和防止病毒病的传播流行具有重要的现实意义，是生产上对烟草丛顶病进行综合治理的重要措施之一。
[0004]通常检测鉴定植物病毒的方法有生物学、电镜技术、血清学技术和分子生物学技术等。生物学方法操作简单，但该方法检测周期长、灵敏度低，还受到季节、环境以及病毒种类等方面的影响，因此很难用于烟草丛顶病病原物复合体的准确诊断。由于TBTV、Sat-TBTV和TVDVaRNA不编码外壳蛋白，没有粒体结构，电镜技术和常规血清学技术无法用于这3种烟草丛顶病病原物的检测鉴定；电镜技术仅能观察到病毒的粒体形态，很难准确鉴定出病毒种类，且设备昂贵，不适合作为TVDV检测的普通方法。TVDV的基因组能够编码外壳蛋白，病毒具有完整的粒体结构，可以用来作为抗原制备抗血清，但由于TVDV的分布局限于韧皮部，且病毒含量较低，不易直接从病株里提纯到病毒粒子，因此目前国内外尚无有关TVDV抗血清方面的报道。分子生物学技术，尤其是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性强、灵敏度高，但普通RT-PCR方法每次只能检测一种病毒，对于多种病原物复合侵染的情况，则需要针对每种病毒进行单独检测，工作量大，成本高，且效率低。
实用新型内容
[0005]为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒,在对烟草丛顶病多种病原物复合侵染烟草和传毒介体昆虫进行检测时具有高效、灵敏、特异且低成本的特点，可以准确检测烟草及传毒介体昆虫中是否含有TBTV、TVDV和Sat-TBTV病原物；本实用新型的试剂盒结构简单、设计合理，方便携带、保存，不易受污染。
[0006]为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是:一种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒，所述试剂盒包括盒体1、盒盖2和设置在盒体I内的衬垫3，所述衬垫3上设有小孔，装有TBTVdF引物的试剂管4、装有TVDVdF引物的试剂管5、装有SatTBTVdF弓丨物的试剂管6、装有TBTVdR引物的试剂管7、装有TVDVdR引物的试剂管8、装有SatTBTVdR引物的试剂管9、装有CTAB缓冲液的试剂管10、装有PCR扩增试剂的试剂管11、装有琼脂糖凝胶的试剂管12被设置在所述小孔内，盒盖2顶部内侧设有检测对比卡13。
[0007]所述衬垫3上设有9个小孔，所述小孔在所述衬垫3上分成三排平行排列，前后两排排为4个小孔,中间为I个小孔。
[0008]其中所述的TBTVdF引物为TBTV的正向引物，引物序列如下:
[0009]TBTVdF: 5，-TACCACACCTAAACAGCGTTG-3，，
[0010]其中所述的TVDVdF引物为TVDV的正向引物，引物序列如下:
[0011]TVDVdF: 5，-GCAACAGCGAGACTTTCATCT-3，，
[0012]其中所述的SatTBTVdF引物为SatTBTVdF的正向引物，引物序列如下:
[0013]SatTBTVdF: 5，-TGTTGGCCGTGGGCAGCAA-3，，
[0014]其中所述的TBTVdR引物为TBTV的反向引物，引物序列如下:
[0015]TBTVdR: 5，-CTCATCTCCCGCTAAGTCAG-3，，，
[0016]其中所述的TVDVdR引物为TVDV的反向引物，引物序列如下:
[0017]TVDVdR: 5，-CRTTGCCTTTATAGAGCAGCC-3，，
[0018]其中所述的SatTBTVdR引物为Sat-TBTV的反向引物，引物序列如下:
[0019]SatTBTVdR: 5，-TTCGTATTTGGCTCCGTCGC-3，，
[0020]CTAB 缓冲液由质量百分比为 2% CTAB,2% PVP-40，pH 8.0 的 100 mMTris-HCl,
1.4M NaCl,20mM EDTA组成混合液，最后根据混合溶液的体积加入0.2%巯基乙醇、
[0021]PCR扩增试剂为 15 KL,由 0.6 M-L 的 PrimeScript I Step Enzyme Mix、7.5 M-L 的2X1 Step Buffer、各0.6 μL的 10 μ M正反向引物TBTVdF和TBTVdR、各0.5μL的 10 μ M正反向引物 TVDVaRNAdF 和 TVDVaRNAdR、各 0.4μL 的 10 μ M 正反向引物 SatTBTVdF 和 SatTBTVdR、
2.8 μL的ddH20和0.5 μL的RNA模板混合而成。
[0022]琼脂糖凝胶为1.0%的琼脂糖凝胶，在配好的凝胶中每100 ml加入5μL Gold View染色剂混匀。检测对比卡13的信息如下:
[0023]
【权利要求】
1.一种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括盒体(I)、盒盖(2 )和设置在盒体(I)内的衬垫(3 )，所述衬垫(3 )上设有小孔，装有TBTVdF弓丨物的试剂管(4 )、装有TVDVdF引物的试剂管(5 )、装有SatTBTVdF引物的试剂管(6 )、装有TBTVdR引物的试剂管(7 )、装有TVDVdR引物的试剂管(8 )、装有SatTBTVdR引物的试剂管(9)、装有CTAB缓冲液的试剂管(10)、装有PCR扩增试剂的试剂管(11)、装有琼脂糖凝胶的试剂管(12)被设置在所述小孔内，盒盖(2)顶部内侧设有检测对比卡(13)。
2.按照权利要求1所述的一种用于检测TBTV、TVDV和Sat-TBTV的试剂盒，其特征在于:所述衬垫(3)上设有9个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成三排平行排列，前后两排排为4个小孔,中间为I个小孔。
【文档编号】C12Q1/68GK203960210SQ201420240807
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】梁建军, 杨栎 申请人:梁建军