一种用于检测hbv-b/c的数字pcr绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子诊断生物学技术领域，具体涉及一种用于检测HBV-B/C的数字PCR 绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法。
[0002]
【背景技术】
[0003] 乙型肝炎病毒是导致人类急性和慢性乙型肝炎的病原体，它能引起肝脏细胞的严 重损伤，并且持久稳固的HBV感染与肝硬化及肝癌的发生密切相关，对人类的健康危害极 大。据估计，全世界感染过HBV的人数大约有20亿，并且超过3.5亿的感染者具有持久稳固和 慢性感染;每年因 HBV感染导致的相关疾病死亡人数可达60万-100万。HBV在世界各地的流 行感染率差别极大，在亚洲东部地区HBV的感染流行率最高，而在北美和欧洲的西北部地区 流行率很低。中国HBV感染人数超过7亿，其中约1.2亿携带者，3000万慢性感染者，每年新增 HBV感染人数约50万，是世界上HBV感染率最高的国家之一。
[0004] 不同HBV基因型可以导致不同的临床表现及预后。有研究表明基因 B型感染者较C 型感染者较少发生肝损害，且基因 B型感染者较C型不易发展至肝硬化、炎症程度较轻;基因 C型感染者其肝脏炎症坏死评分高于基因 B型感染者，基因 C型感染者容易发展为肝硬化和 肝癌。在中国主要流行HBV-B/C型。因此，HBV基因分型检测可以在乙肝炎患者的临床类型、 预后判断及治疗方法的选择等方面发挥重要的作用。
[0005] 乙型肝炎病毒表面抗原的血清学检测在HBV感染的诊断中起着重要作用。目前采 用免疫学方法检测HBV血清学标志物广泛用于急、慢型感染的诊断、疗效观察和预后判断。 然而，由于HBV亚型和变异株的存在以及病毒的免疫逃逸，即使在HBV携带者血液中，检测不 到HBs Ag且抗HBs Ag抗体阳性，仍然不能确定该携带者体内的HBV已经完全清除，也不能排除 其他将来发生与HBV感染相关的严重肝脏疾病并发症的可能。HBV的血清学诊断是间接诊 断，不能直接反映病原体的存在，故用这些血清学标志物检测疾病的发展有一定的限制。分 子诊断技术的引入为直接和真实地反映患者体内病毒复制水平，以及判断患者病情、疗效 和预后提供了可能。
[0006] 目前HBV基因分型的分子诊断主要包括核酸杂交法、基因芯片和荧光PCR法等。其 中核酸杂交包括斑点杂交、液相杂交、支链DNA技术等方法，但是由于杂交步骤较为繁琐，在 大样本研究中耗时较长，易导致交叉杂交反应，而存在着一定的不足;基因芯片由于其成本 较高，制作工艺复杂，而且信号检测需要专门的仪器设备，限制了其在临床上的应用。目前 认为实时荧光定量PCR技术是检测HBV DNA以及分型的最好方法，该技术目前被公认为第二 代定量PCR技术，但其定量需要参考标品、标准曲线和内标校正，对有限的标本材料以及低 拷贝数HBV的准确定量仍存在一定的应用限制。
[0007]
【发明内容】
[0008] 针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种用 于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法，用于克服现有检测技术 中步骤繁杂、耗时较长、易导致交叉杂交反应、需要进行定量矫正、准确度不高等不足之处， 且具有准确度高、灵敏度高、精确度高、重现性好的特点。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:一种用于检测HBV-B/C的数字 PCR绝对定量分型检测试剂盒，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液 B、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液； 所述数字PCR反应缓冲液A中包括有HBV-B型的引物及探针和HBV-C型的引物及探针;所 述数字PCR反应缓冲液B中包括有内标的引物及探针;所述HBV-B型、HBV-C型和内标的引物 及探针如下所示： HBV-B型和HBV-C型通用上游引物： ctagactcgtggtggacttctc； HBV-B型和HBV-C型通用下游引物： atgaggcatagcagcaggat； HBV-B 型探针：tcgcagtcccaaatctccagtcactc; HBV-C 型探针：tcgcagtccccaacctccaatca; 内标上游引物：ctgccgttactgccctgtg; 内标下游引物:ttggtctccttaaacctgtcttg; 内标探针：accaccaacttcatccacgttcacc; 所述HBV-B型探针5'端荧光报告基因为FAM，HBV-C型探针5'端荧光报告基团为VIC，内 标探针5 '端荧光报告基团为VIC，所有探针3 '端淬灭基团均为BHQ; 所述HBV-B病毒基因阳性质控为HBV-B的标准质粒溶液;所述HBV-C病毒基因阳性质控 为HBV-C的标准质粒溶液； 所述阴性质控为灭菌生理盐水； 所述内标溶液为β-globin的标准质粒溶液。
[0010] 一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测方法，采用上述用于检测HBV- B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒进行检测，具体检测方法包括如下步骤： (1) 受检样品处理:将待测样品用无菌生理盐水洗涤并离心弃去上清液后，加入灭菌水 震荡混匀，向震荡混匀后的溶液中加入所述试剂盒中的DNA提取液和内标溶液，剧烈震荡混 勾，并于100~105°C恒温处理10~16分钟，再于12,000~14,000印111/111；[11离心5~10分钟，取上清 液，获得PCR扩增样品DNA模板； (2) 质控品的处理:分别取所述试剂盒中的HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳 性质控和阴性质控，按照与步骤（1)相同的方法处理，分别得到HBV-B病毒基因阳性质控、 HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的DNA模板； (3) 配制数字PCR反应混合液：向步骤（1)和步骤(2)处理后得到的样品DNA模板、HBV-B 病毒基因阳性质控DNA模板、HBV-C病毒基因阳性质控DNA模板和阴性质控DNA模板中分别加 入灭菌水和所述试剂盒中的数字PCR反应缓冲液，分别配制得到样品、HBV-B病毒基因阳性 质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性质控的数字PCR反应混合液;其中，阳性质控和阴性质 控的数字PCR反应混合液均采用数字PCR反应缓冲液A配制，样品的数字PCR反应混合液分为 两种，分别采用数字PCR反应缓冲液A和数字PCR反应缓冲液B配制； (4) 将步骤(3)制备的样品、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控和阴性 质控的数字PCR反应混合液分别制作为油包水PCR微反应液滴，生成的微反应液滴数量为 10，000~20，000个，然后对所述微反应液滴进行PCR扩增反应； (5) 读取荧光信号:步骤(4)PCR扩增后，将PCR反应板放入荧光读取仪器中，分别在FAM 和/或VIC通道中进行HBV-B和/或HBV-C的分型检测，通过Quanta soft软件进行定量分析， 计算出HBV-B型和/或HBV-C型的拷贝数。
[0011]相比现有技术，本发明的有益效果在于： 1、本发明通过创造性的试验研究设计出扩增HBV-B型和C型的引物及双色荧光探针，使 这些引物能够很好地与模板DNA上目标片段结合，而不会与模板DNA上目标片段以外的区域 结合，具有良好的PCR扩增特异性，进而将这些引物和探针加入数字PCR反应缓冲液中，可以 使样品的特异性PCR反应产物可以分别在FAM和VIC通道中进行HBV-B和HBV-C的分型检测， 准确定量出HBV两种亚型的拷贝数，检测效果更高、检测数据结果更加精确。
[0012] 2、本发明用于检须_V-B/C的数字PCR绝对定量分型检测方法，基于数字PCR平台 对HBV-B/C含量进行绝对定量检测，检测方法中主要依靠数字PCR技术和双色荧光探针，检 测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量，不受扩增效率的影响，无需依靠标准曲线 和看家基因来测定核酸量，而是直接采用数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测 片段从大量的复杂背景中分离出来，直接数出DNA分子的个数，大大简化操作步骤，使该方 法检测时间仅需要3小时，有效节约了准备时间和检测时间，且结果判读直观可靠，具有可 以稳定实施的特点，检测灵敏度及精确性都达到精准定量的要求，提高了检测的灵敏度和 精确性。
[0013] 3、本发明检测方法在HBV含量极低的组织样品检测中，通过微滴化处理可以大大 减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝，而不会受到背景DNA或杂质的干扰，克服 了现有实时荧光定量PCR技术无法精确对低丰度基因进行定量的不足之处。
[0014] 4、本发明试剂盒可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于 检测，具备产业化推广条件，具有良好的市场前景。
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【附图说明】
[0016] 图1为FAM通道检须_V-B/C引物及探针特异性； 图2为VIC通道检测HBV-B/C引物及探针特异性； 图3为VIC通道检测HBV-C/B引物及探针特异性； 图4为FAM通道检测HBV-C/B引物及探针特异性； 图5为阴性样品的荧光检测结果； 图6为HBV-B感染样品的荧光检测结果； 图7为HBV-C感染样品的荧光检测结果。
[0017]
【具体实施方式】
[0018] 为更好地理解本发明的内容，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说 明。应该理解，下列具体实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制。 一、一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，包括DNA提取液、数字 PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质 控、阴性质控和内标溶液； 所述DNA提取液包括50mMpH8.3的Tris-HCl，0.5MNaCl，5