一种用于检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，该探针试剂盒包括即用型杂交液，该即用型杂交液的组分及浓度为：AML1基因探针、ETO基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/μl。本发明试剂盒的组合探针信号强度高，稳定性强，可以在单细胞水平同时检测定性定量检测5个目的基因的改变情况。
【专利说明】—种用于检测t (8; 21) AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种应用高分辨定量多色荧光原位杂交，检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，尤其是用于检测亚克隆间的进化关系及在化疗药物的作用下优势克隆的演变及亚克隆的消长。本发明提供的组合探针信号强度高，稳定性强，在 Chroma 公司的 DAPI (SP-100), Spectrum Green?(MF101), Cy3?vl (SP-102), Texas Red(SP_107)和 Zeiss 公司的 Cy5 (50)，PF_415 (45)六种滤光片通道下无信号交叉，可以在单细胞水平同时定性定量检测5个目的基因的改变情况。可以用于检测目的基因拷贝数的改变、肿瘤异质性及亚克隆演变，检测肿瘤细胞基因组的不稳定性和复杂程度。为临床制定特异性的靶向治疗方案具有重要的指导意义。
【背景技术】
[0002]急性髓系白血病是一种克隆性异质性疾病，它的发生是一个多步骤的发病过程，累积多个基因，涉及多种遗传学异常。正常造血干祖细胞在致癌物质的作用下获得选择性的增殖优势，转化为前癌细胞。前癌细胞基因组不稳定，在增殖过程中不断获得遗传学损伤形成不同的变异体。在生存空间有限、营养物质缺乏、缺氧及最重要的在免疫杀伤的作用下，并非所有的亚克隆均能存活，直至出现的变异体能够突破上述进化屏障，这一变异体即为白血病起始细胞。白血病起始细胞克隆性增殖最终导致临床发病。虽然白血病细胞群全都来自白血病起始细胞，但是从生物学发病到临床发病的过程中，白血病起始细胞克隆性增殖的同时不断累积新的遗传学损伤形成一个异质性群体，亚克隆间的生长速度、侵袭能力及对药物的敏感性不同。其 中比例最高的亚群称为优势亚克隆，优势亚克隆的生物学特性和白血病的临床表现相关。同一肿瘤患者体内可以存在有很多不同亚克隆细胞群，同一类肿瘤可以有不同的亚型，同一亚型的患者预后不同。单就急性白血病而言，其异质性存在的证据表现为:细胞形态学和免疫表型的多样性，细胞遗传学和分子生物学的异常。正是由于异质性的存在，使得肿瘤在治疗过程中逐渐表现出耐药、复发和侵袭力改变等行为。因此，在临床上研究肿瘤的异质性及亚克隆分群对肿瘤的靶向治疗具有重要意义。
[0003]目前，常用的检测异质性的方法具有两大类:一类是临床上治疗相关的检测指标:染色体核型分析、免疫表型、分子生物学检测等；另一类是近几年新近崛起的测序技术。但是目前应用的临床指标，在检测肿瘤细胞异质性上分辨率太低。以染色体核型分析为例:虽然可检测单细胞水平上多种基因组异常并列存在的情况，但分辨率太低(大约10Mb)，只能检测大片段的缺失、扩增、异位等，而且染色体核型分析只能检测处于有丝分裂中期的细胞，计数的细胞少，只能反映增殖活跃细胞的遗传学改变；而测序技术虽然分辨率非常高，能获得海量的基因组异常信息也能观察到优势突变的演变，但是也只能从整体水平上反应异质性的存在及演变，不能分析多种基因异常在同一细胞水平同时存在的情况。
[0004]本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，应用高分辨定量多色荧光原位杂交，克服了以上两种方法的不足，兼顾了以上两者的优势，不仅分辨率较高，可以检测到隐匿性的基因异位、缺失和基因扩增，而且可在单细胞水平同时检测多个基因的异变。从而直观的分析肿瘤的异质性，亚克隆间的进化关系及优势克隆的演变。
【发明内容】
[0005]本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，可用于高分辨定量多色荧光原位杂交，检测单细胞水平上多种基因异常并列出现的情况，从而将个体细胞进行不同的亚克隆分群，本方法适用于大规模的临床研究并对靶向治疗具有重要的指导意义。
[0006]本发明的一个目的是提供一种AML1基因探针，ΕΤ0基因探针，WT1基因探针，P27基因探针、C-kit基因探针的制备方法。
[0007]本发明的另一目的是提供一种包括AML1基因探针，ΕΤ0基因探针，WT1基因探针，P27基因探针和C-kit基因探针的即用型杂交液。
[0008]本发明的另一目的是提供一种包括上述即用型杂交液的试剂盒。
[0009]本发明采用的技术方案是:
[0010]一种单个基因探针的制备方法，包括如下步骤:
[0011]1)、探针制作:在常用的数据库如 NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser 和 UCSC Genome Bioi nformatics 上定位检索含检测目的基因的 BAC (Bacterialartificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后,大量提取质粒DNA,再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上，沉淀DNA，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针；
[0012]2)、探针验证:采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
[0013]一种包括AML1基因探针，ΕΤ0基因探针，WT1基因探针，P27基因探针和C_kit基因探针的即用型杂交液的制备方法，包括如下步骤:
[0014]2)、探针制作:在常用的数据库如 NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser 和 UCSC Genome Bioinformatics 上定位检索分别含检测 AML1、ETO、WT1、P27、C-kit基因的BAC (Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取质粒DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上，对标记好的目的DNA进行组合沉淀，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，制得即用型杂交液；
[0015]2)、探针验证:采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
[0016]作为一个优选方案:含AML1基因最优的克隆，编号为:RP11-77G18，RP11-697C13或RP11-177L11中的一种或两种或三种；
[0017]作为一个优选方案:含ΕΤ0基因最优的克隆，编号为:RP11-11808或RP11-122C21中的一种或两种；
[0018]作为一个优选方案:含WT1基因最优的克隆，编号为:RP11_258G7或RP11-955L20中的一种或两种；
[0019]作为一个优选方案:含p27基因最优的克隆，编号为:RP11-380E18，RP11-70N14或RP11-377D9中的一种、两种或三种；
[0020]作为一个优选方案:含c-kit基因最优的克隆，编号为:RP11_103A16或RP11-178P22中的一种或两种；
[0021]上述最优克隆均来源于UCSC Genome Bioinformatics数据库。
[0022]具体地，所述的步骤1)为在常用的数据库如NCBI Clone Registry、EnsemblGenome Browser 和 UCSC Genome Bioinformatics 上定位检索分别含检测 AML1、ETO、WT1、P27、C-kit 基因的 BAC (Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取质粒DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上，用100%的乙醇将连接好的DNA在_20°C进行组合沉淀过夜，次日离心14000rpm，4°C，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入70%乙醇(4°C )，混匀，离心14000rpm,4°C，15分钟，用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，制得即用型杂交液。
[0023]本发明还提供了一种检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，包括上述即用型杂交液。
[0024]优选地，所述即用型杂交液的组分及浓度为:AML1基因探针、ΕΤ0基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/l.! 1。
[0025]进一步，该检测试剂盒还包括:12*12mm盖玻片，18*18mm盖玻片，载玻片，DAPI复染剂和液体橡胶。
[0026]具体地，该试剂盒的应用方法，包括如下步骤:
[0027]1)杂交:将要检测的标本处理好后，加入试剂盒中的即用型杂交液，加上盖玻片，用液体橡胶封片，放入杂交仪，78-81°C变性5分钟37°C杂交过夜；
[0028]2)洗片，荧光显微镜检:标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入核酸杂交的缓冲液(Saline Sodium Phosphate EDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水后晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果；
[0029]3)图像采集与分析:采用Zeiss公司多色突光显微镜Axio Imager Z2型,六种滤光片采用 Chroma 公司分别为:DAPI (SP-100)，Spectrum Green?(MF101), Cy3?vl (SP-102),Texas Red(SP-107)和 Zeiss 公司 Cy5 (50)，PF-415 (45)组合，首先在 DAPI 滤光片下选择视野，定位，然后用高分辨率CCD (Charge-Coupled Device,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5-10层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰的多色图像；
[0030]4) cut-off值建立:将试剂盒中的即用型杂交液与相应的正常细胞杂交，应用步骤3)采集图像信息，计数5种基因在正常细胞中表现出的异常信号的种类及其比例，以其比例的“M+2SD”为cut-off值，这种异常是由于信号重叠，弯曲折叠等造成的系统误差；
[0031]5)肿瘤细胞群中亚克隆的检测:将试剂盒中的即用型杂交液与病人的肿瘤细胞标本杂交，应用步骤3)采集图像信息，在AML1-ET0融合信号阳性的细胞中进行信息采集，内容包括:①计数每个细胞内的·融合信号、非融合信号的个数；②计算每种信号在肿瘤细胞群(至少200个AML1-ET0融合信号阳性的细胞)中出现的比例，并将此比例减掉相对应的cut-off值:若结果>0则表示信号数目改变为阳性结果，若结果< 0则表示信号数目改变为假阳性将所有信号都为阳性且阳性信号表型相同的细胞归为一个阳性亚克隆，计算其比例建立克隆衍变进化图，根据阳性亚克隆间遗传学上的相关性，推演亚克隆间的进化关系,列入克隆衍变进化图中的亚克隆的比例均> 1%。
[0032]本发明所具有的有益效果:
[0033]本发明试剂盒的组合探针信号强度高，稳定性强，在Chroma公司的DAPI (SP-100), Spectrum Green?(MF101), Cy3?vl (SP-102), Texas Red(SP_107)和 Zeiss公司的Cy5(50)，PF-415(45)六种滤光片通道下无信号交叉。用于高分辨定量多色荧光原位杂交，可以在单细胞水平同时检测定性定量检测5个目的基因的改变情况，可大规模检测临床标本的基因异位和等位基因拷贝数改变。从而检测同一标本中不同亚克隆的种类及比例，同一病人初诊和复发病例前后对照可以检测亚克隆的演变状况。总之，本发明提供了一种用于高分辨定量多色荧光原位杂交对t (8; 21) AML中5种目的基因进行定性定量检测的试剂盒，不仅可以分析基因拷贝数的改变，而且能够以基因拷贝数作为亚克隆的标志检测肿瘤细胞群的异质性。而且适用于检测同一白血病患者初诊和复发的克隆衍变，通过比较初诊和复发时的克隆衍变图，判断是否发生优势克隆的演变、某些治疗敏感克隆的消失及某些耐药克隆的新生。对于指导临床的靶向治疗具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1 为，分别用 Green dUTP, PF555_dUTP，PF590_dUTP 标记含 AMLl 基因的 3 个BAC克隆(表2)，将这3色探针杂交于正常人二倍体成纤维细胞，经荧光显微镜检测得到的图像，结果显示三个探针融合为I个点，说明这3个BAC克隆可以用来共定位检测AMLl基因，来增强荧光信号强度。
[0035]图 2 为 ，分别用 PF555-dUTP，Green dUTP, PF590_dUTP，HyPer5-dCTP, PF415_dUTP标记含有AMLl，ETO, WTI, P27，C_kit基因的BAC克隆(如表3所示)，将这五色探针混色后杂交于正常人二倍体成纤维细胞，经荧光显微镜检测得到的图像，结果显示每种探针都有两个清晰的荧光信号，信号强度高、稳定性强，可用于后续患者标本的检测。
[0036]图3为，应用本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，在t (8; 21) AML患者中检测的肿瘤异质性的表现以及4个亚克隆间的树状进化关系，从各个亚克隆的比例来看，该病人这个时期的优势克隆的信号表型为:1个AMLl-ETO融合信号，2个AMLl信号，I个ETO信号，2个WTl信号，2个p27信号，3个c-kit信号。
[0037]图4为，应用检测t (8; 21) AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，在t (8; 21)AML患者中检测的肿瘤异质性的表现，各个亚克隆间的树状进化关系，以及初诊(图4-1)和复发(图4-2)时优势克隆的演变关系的对比可以明显的看出亚克隆的演变:复发时有一个亚克隆消失，同时又有2个新生的亚克隆出现，而亚克隆“1F1G102R3I3B”(I个融合信号，I个ΕΤ0, I个AMLl，2个WT1，3个p27，3个c-kit)的比例由初诊时的2.00%演变为复发时的27.59%，表现出明显的上升趋势。
【具体实施方式】
[0038]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不限定本发明的保护范围。
[0039]实施例1:AML1基因探针的制备
[0040]一、探针DNA的获取
[0041]I)划线接种:将3个分别携带有AMLl基因的BAC菌种(RP11-77G18，RP11-697C13,RP11-177L11;购买于 Children’s Hospital Oakland Research Institute)分别按照如下步骤操作，首先将BAC菌种划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上，37°C培养过夜(约14小时)。
[0042]2)初始培养:次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放入37°C摇床，设置摇床速度约200rpm，培养6_8小时。
[0043]3)过夜培养:每Iml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，放置于37°C摇床，转速200rpm，培养过夜(约14-16小时)。
[0044]4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
[0045]二、探针标记
[0046]1.酶切 DNA:
[0047]I )按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
【权利要求】
1.一种即用型杂交液，其特征在于:该即用型杂交液的组分及浓度为:AML1基因探针、ETO基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/ μ 1。
2.权利要求1所述即用型杂交液的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:1)、探针制作:在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser 和UCSC Genome Bioinformatics 上定位检索分别含检测 AML1、ETO、WT1、P27、C-kit 基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取质粒DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上，对标记好的目的DNA进行组合沉淀，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，制得即用型杂交液；2)、探针验证:采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述含AML1基因最优的克隆，编号为:RP11-77G18，RP11-697C13和RP11-177L11的组合;所述含ET0基因最优的克隆，编号为:RP11-11808和RP11-122C21的组合；所述含WT1基因最优的克隆，编号为:RP11_258G7和RP11-955L20的组合；所述含p27基因最优的克隆，编号为:RP11_380E18，RP11-70N14和RP11-377D9的组合；所述含c_kit基因最优的克隆，编号为:RP11_103A16和RP11-178P22的组合。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述的步骤1)为在常用的数据库如 NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser 和 UCSC Genome Bioinformatics上定位检索分别含检测 AML1、ETO、WT1、P27、C_kit 基因的 BAC (Bacterial artificialchromosomes)克隆，获得目的基因的克隆后，大量提取质粒DNA，再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上，用100%的乙醇将连接好的DNA在_20°C进行组合沉淀过夜，次日离心14000rpm，4°C，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入70%乙醇(4°C)，混匀，离心14000rpm，4°C，15分钟，用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟，用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，制得即用型杂交液。
5.一种检测t(8;21)AML 中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒，其特征在于:包括权利要求1所述即用型杂交液。
6.根据权利要求5所述的探针试剂盒，其特征在于:该检测试剂盒还包括:12*12mm盖玻片，18*18mm盖玻片，载玻片，DAPI复染剂和液体橡胶。
【文档编号】C12Q1/68GK103627787SQ201310338445
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】王建祥, 王英婵, 胡林萍, 程涛 申请人:中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）