一种用于烟梗处理的微生物制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟用微生物制剂及其制备方法和应用，属于烟用添加剂的【技术领域】。本发明由生产菌株液体发酵培养后得到相应的微生物制剂。生产菌株为短梗霉菌OF-01菌株（CGMCC?No.?7609）。本发明的微生物制剂，能够明显提高梗丝的香气量、愉悦性等品质，杂气、刺激性等下降，烟气浓度和劲头减少，余味变得舒适，从而进一步提高梗丝在卷烟中的掺配量，达到减害降焦、降低卷烟生产成本的目的。
【专利说明】—种用于烟梗处理的微生物制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于烟用添加剂的【技术领域】，更具体地说，本发明涉及一种可改善卷烟品质的微生物制剂，以及所述微生物制剂的制备方法和在烟梗处理和卷烟加工中的应用。
【背景技术】
[0002]烟梗是卷烟生产中所产生的利用率较低的下脚料，其化学成分与烟叶相差无几。现代的卷烟生产流程中，都会对烟梗进行处理后以较小的比例添加到卷烟中，这样不仅可以节约成本，也可起到降低卷烟焦油量的作用。
[0003]然而由于烟梗燃烧其灼热感明显，木质气较重，使得其在卷烟配方中所占比例较低，对烟叶依赖严重。因此如何改善烟梗的质量，提高其综合利用率，是兹待解决的问题。
[0004]相比于正常烟叶，烟梗中所含的木质素，纤维素，半纤维素和果胶的含量较高。这些大分子糖类物质具有较高的燃烧值，因此带来了烟梗的特有杂气，严重影响其抽吸品味。如何降低这些成分在烟梗中的含量，是提高烟梗利用率的关键所在。
[0005]实验表明，很多微生物在与烟草作用时，可利用烟草所含的大分子糖类，并降解为有明显芳香气息的小分子糖类。因此如果可以将微生物作用于烟梗，降解掉其中的大分子木质素，果胶等成分，有望改善其抽吸品质。
[0006]现有技术中未见有用微生物菌株出芽短梗霉0F-01菌株(CGMCC N0.7609)制备的微生物制剂的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的本发明 的目的在于提供一种新的微生物制剂及其制备方法，以及该微生物制剂在改善烟草梗丝品质中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案予以实现:
[0009]一种微生物制剂，由微生物菌株出芽短梗霉菌OF-OI菌株(CGMCC N0.7609)制得。
[0010]所述的微生物制剂的制备方法，包括下述步骤:
[0011](I)烤烟叶面上分离得到出芽短梗霉菌0F-01菌株；
[0012](2)将0F-01菌株接种于MYP培养基斜面上，在26_32°C下培养4_10天获得斜面菌种；
[0013](3)将斜面菌种接种于MYP液体培养基中，在26-32°C、50-250rpm条件下摇床培养4-10天获得液体种子；
[0014](4)将液体种子按1-5% (V/V)的比例接入发酵罐中的MYP液体培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件为:温度26-32°C，搅拌速度150_250rpm，发酵时间4_6天；发酵产物经过离心或板框过滤去除滤液后烘干得到菌粉，或将发酵产物直接喷雾干燥得到菌粉，菌粉经过粉碎和用200目筛子去除大颗粒后得到该微生物制剂。
[0015]如所述的微生物制剂的制备方法，其中烤烟叶面上分离得到出芽短梗霉菌0F-01菌株是将仓储陈化3年的红花大金元烟叶样品粉碎，取5克粉碎后的烟末放入装有IOOml无菌水的三角瓶中，在100-250rpm摇床上震荡30分钟后过滤去除烟末，用悬液涂布MYP培养基即麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0平板，200微升/皿，共50皿，在28 °C温箱中培养5-7天后用MYP培养基纯化出单一的微生物，从纯化的烟叶表面微生物中筛选得到具有产香特性的出芽短梗霉菌OF-Ol菌株。
[0016]所述的微生物制剂在梗丝处理和卷烟加工中的应用。
[0017]如所述的应用，在于在梗丝处理和卷烟加工中的应用包括下述步骤:
[0018](I)称取含水率在11%_13%的梗丝IOOg ；
[0019](2)取菌剂lg，用水稀释10-20倍后用小型喷雾器将其均匀地喷洒到IOOg梗丝上，密封，以防止水分蒸发；
[0020](3)直接喷洒等量的无菌水作为对照；
[0021](4)将样品封入密封袋，30°C恒温6h; [0022](5)将梗丝置于120°C烘箱中烘干，使含水率达到11%_13% ；
[0023](6)将梗丝于22°C相对湿度为60%的恒温恒湿箱平衡48h ；
[0024](7)取出部分烟丝，检测主要化学成分含量和致香物质；
[0025](8)将剩余的烟丝手工卷制成烟支，样品和对照随机编号，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。
[0026]与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点:
[0027](I)本发明提供的微生物制剂能明显提高梗丝的香气量、愉悦性等品质，杂气、刺激性等下降，烟气浓度和劲头减少，余味变得舒适。
[0028](2)本发明成本低、可控性强、操作简单，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【具体实施方式】
[0029]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
[0030]实施例1:
[0031]本发明的微生物短梗霉菌0F-01的菌株来源:
[0032]本发明提供了一种改善烟梗品质的微生物制剂，该制剂的微生物是采用下述方法制备获得:将仓储陈化3年的红花大金元烟叶样品粉碎，取5克粉碎后的烟末放入装有IOOml无菌水的三角瓶中，在100-250rpm摇床上震荡30分钟后过滤去除烟末，用悬液涂布MYP培养基(麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0)平板，200微升/皿，共50皿，在28°C温箱中培养5-7天后用MYP培养基纯化出单一的微生物，从纯化的烟叶表面微生物中筛选得到具有产香特性的0F-01菌株，经鉴定该为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)。
[0033]出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)是一种类酵母真菌，具有酵母型和真菌型两种菌丝体形态，据其生理特征和孢子产生的特征将其归属于半知菌门、丛梗孢目、短梗霉菌属。0F-01菌株在Yro培养基上，25 °C下7天，菌落初期为典型的酵母状:粘稠、污白色，显微镜下菌体为单细胞个体、椭圆形；菌落后期为典型的真菌状:转暗为黑色，边缘呈根状，显微镜下菌体呈丝状体。利用引物5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’和5’ -GGAAGTAAAAGTCG TAACAAG-3’经PCR扩增，获得OF-Ol菌株获得的ITS区基因序列，提交到GeneBank公共数据库,其序列号为JQ916049，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。鉴于该菌株由于(自发的、物理的或化学的)突变、原生质体融合，转化或其他通过生物技术会发生变化或被改造，因此，本菌株的任何突变株、变种和衍生物均应视为本专利申请所能预见和能得到的技术方案。
[0034]保藏生物材料的说明
[0035]本发明涉及的短梗霉菌0F-01的菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国.北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期:2013年5月13日;保藏号为CGMCC N0.7609 ;分类命名为:出芽短梗霉Aureobasidium pullulans。
[0036]实施例2:
[0037]本发明的微生物制剂采用下述步骤制备:
[0038]1、将实施例1烤烟叶面上分离得到霉菌0F-01的液体菌种进行试管斜面培养:将该菌株0F-01的菌体接种到MYP培养基(麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0)斜面上，20-30°C下培养4_10天后获得斜面培养的种子，适宜的培养条件是26-32°C下，最好的是在28°C下培养7天。
[0039]2、液体种子培养:
[0040]将斜面培养后的种子接种到三角瓶中的MYP的液体培养基中，15-30°C，50-300rpm条件下摇床培养3-7天获得。最适培养条件为28 V，200rpm条件下培养4天。
[0041]3、发酵罐大量培养:
[0042]将液体种子培养后的种子按1-5% (V/V)的比例接入发酵罐中的MYP液体培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件为:温度26-32 °C，搅拌速度150-250rpm，发酵时间4-6天。用无菌水洗漆沉淀,离心,最后用20mL无菌水振荡均勻，使用时稀释10倍即为菌剂。
[0043]应用实施例1:
[0044]微生物制剂对梗丝的作用:
[0045]用实施例1和2制备好的微生物制剂改善梗丝品质的具体实验步骤如下:
[0046]( 1)称取含水率在11%-13%的梗丝100g。
[0047](2)取实施例2所得菌剂20ml，用水稀释10-20倍后用小型喷雾器将其均匀地喷洒到IOOg梗丝上，密封，以防止水分蒸发。
[0048](3)直接喷洒等量的无菌水作为对照。
[0049](4)将样品封入密封袋，以防止水分蒸发，30°C恒温6h。
[0050](5)将梗丝置于120°C烘箱中烘干，使含水率达到11%_13%。
[0051 ] (6)将梗丝于22°C相对湿度为60%的恒温恒湿箱平衡48h。
[0052](7)取出部分烟丝，检测主要化学成分含量和致香物质。
[0053](8)将剩余的烟丝手工卷制成烟支，样品和对照随机编号，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。
[0054]常规化学成分的检测结果表明:经所述的微生物制剂处理后，梗丝的生物大分子化合物的含量发生了较大的改变，其中还原糖和总糖的含量发生了明显的提高，同时还检测到纤维素和木质素的含量发生了下降。
[0055]致香成分检测结果表明:经微生物制剂处理后，梗丝的致香成分，包括苯甲醇、茄酮、香兰素、3 -大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮、西柏三烯二醇和新植二烯等的含量较对照显著提高。
[0056]感官评吸结果表明:梗丝经微生物制剂处理后，香气量、愉悦性较对照显著提升，杂气、刺激性等下降，烟气浓度和劲头减少，余味变得舒适。
[0057]试验结果表明该发明的微生物制剂具有明显降低梗丝刺激性、掩盖杂气、细腻醇和烟气的效果，能够达到提 高梗丝抽吸品质，提高梗丝在卷烟中的掺配量的目的。
【权利要求】
1.一种微生物制剂，其特征在于由微生物菌株出芽短梗霉OF-Ol菌株(CGMCCN0.7609)制得。
2.权利要求1所述的微生物制剂的制备方法，包括下述步骤: (1)烤烟叶面上分离得到出芽短梗霉菌0F-01菌株； (2)将0F-01菌株接种于MYP液体培养基斜面上，在26-32°C下培养4_10天获得斜面菌种； (3 )将斜面菌种接种于MYP液体培养基中，在26-32 °C、50_250rpm条件下摇床培养4_10天获得液体种子； (4)将液体种子按1-5% (V/V)的比例接入发酵罐中的MYP液体培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件为:温度26-32°C，搅拌速度150-250rpm，发酵时间4_6天；发酵产物经过离心或板框过滤去除滤液后烘干得到菌粉，或将发酵产物直接喷雾干燥得到菌粉，菌粉经过粉碎和用200目筛子去除大颗粒后得到该微生物制剂。
3.如权利要求1所述的微生物制剂的制备方法，其特征在于烤烟叶面上分离得到霉菌0F-01菌株是将仓储陈化3年的红花大金元烟叶样品粉碎，取5克粉碎后的烟末放入装有IOOml无菌水的三角瓶中，在100-250rpm摇床上震荡30分钟后过滤去除烟末，用悬液涂布MYP培养基即麦芽提取物7g，酵母提取物0.5g，蛋白胨2.5g，琼脂20g，水1L，pH7.0平板，200微升/皿，共50皿，在28 °C温箱中培养5-7天后用MYP培养基纯化出单一的微生物，从纯化的烟叶表面微生物中筛选得到具有产香特性的出芽短梗霉菌0F-01菌株。
4.权利要求1或2所述的微生物制剂在梗丝处理和卷烟加工中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的微生物制剂在梗丝处理和卷烟加工中的应用包括下述步骤: (1)称取含水率在11%_13%的梗丝IOOg； (2)取菌剂20ml，用水稀释10-20倍后用小型喷雾器将其均匀地喷洒到IOOg梗丝上，密封，以防止水分蒸发； (3)直接喷洒等量的无菌水在梗丝上作为对照； (4)将样品封入密封袋，30°C恒温6h； (5)将梗丝置于120°C烘箱中烘干，使含水率达到11%-13%； (6)将梗丝于22°C相对湿度为60%的恒温恒湿箱平衡48h； (7)取出部分烟丝，检测主要化学成分含量和致香物质； (8)将剩余的烟丝手工卷制成烟支，样品和对照随机编号，由评吸专家组成的评吸小组进行感官评吸。
【文档编号】C12N1/14GK103451106SQ201310338093
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】杨蕾, 杨乾栩, 蔡波, 何雪峰, 党立志, 杨清, 段焰青, 杨洪明, 周国福, 李勇, 师建全, 冯洪涛, 莫明和 申请人:红云红河烟草(集团)有限责任公司