一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法
【专利摘要】本发明一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法,属于肿瘤细胞检测和核酸试剂制备领域。由合成纳米银簇序列和与HIF有相互作用的识别序列组成的双功能DNA。其次以这种双功能DNA为模板，于柠檬酸钠缓冲溶液中，利用NaBH4还原AgNO3的方法，成功合成了具有荧光的核酸纳米银簇。这种核酸纳米银簇在激发波长为510nm下能发射585nm的荧光，DNA-AgNCs的荧光量子产率为34.4%（以罗丹明B为参照），纳米银簇的大小为~2nm。本发明利用HIF与特定核酸序列的特异结合，将这种微观结合信号放大为宏观荧光变化，来实现HIF的探测，是一种简便，直观的分析方法。
【专利说明】—种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法
[0001]【技术领域】:
本发明属于肿瘤细胞检测和核酸试剂制备领域，特指一种纳米核酸-银簇(DNA-AgNCs)的制备方法及其在用荧光光谱法快速检测细胞中HIF含量的运用。[0002]【背景技术】:
最近几年，纳米银簇(AgNCs)因具有独特的物理学、电学和光学性质，在化学传感、生物传感、成像及诊断等方面的应用，引起了很多的关注。鉴于纳米银易聚集不稳定的特点，用模板来合成较稳定纳米银簇的方法得到了广泛研究，以树枝状大分子、小分子物质、多肽、蛋白质和DNA等为模板,成功的合成了在水中稳定的纳米银簇(J.Sharma, R.C.Rocha,M.Lj Phipps, H.C.Yehj K.A.Balatskyj Dung M.Vuj A.P.Shrevej J.H.Werner,J.S.Martinez, A DNA-templated uorescent silver nanocluster with enhancedstability, Nanoscale, 2012，4，4107 - 4110)。先后有以聚甲基丙烯酸、植酸钠、双功能络合剂(翁建；崔强；丁家包，一种聚甲基丙烯酸微波合成荧光银纳米粒子的方法，中国发明专利201010540810.8 ;杨海峰；王娜，具表面增强拉曼散射活性的菜花状纳米金-银合金的制备方法，中国发明专利201010133185.5 ;吕荣文；邹伟；张淑芬，对含硝基的爆炸化合物高敏感检测的银纳米簇及其制备，中国发明专利201110194650.0,)等为模板合成不同尺寸和用途银纳米粒子。由于Ag+和Ag与DNA上的胞嘧啶有很高的亲和性，以多胞嘧啶核苷酸的DNA为模板可合成稳定、有优异的光谱和光物理性的银簇。DNA不仅是生命体中重要的遗传物质，与蛋白质的翻译和酶的形成有中要关联，还是许多物质的目标分子，因此，基于DNA的纳米银簇(DNA-AgNCs)为探测各种疾病治疗和诊断中重要的分子提供强大平台(H.C.Yeh, J.Sharma, 1.M.Shih, D.M.Vu, J.S.Martinez, J.H.Werner, Afluorescence light-up Ag nanocluster probe that discriminates single-nucleotidevariants by emission color, J.Am.Chem.Soc., 2012, 134, 11550 11558)。 缺氧诱导因子(HIF)是激活线粒体氧化磷酸化和无氧酵解的开关，通过诱导糖酵解酶和葡萄糖转运子基因的表达，激活和促进糖酵解过程。肿瘤细胞中HIF高表达因此，HIF成为肿瘤重要标志之一，探测肿瘤细胞HIF的变化对于肿瘤诊断和治疗具有重大意义。目前HIF-1的体外检测一般采用凝胶电泳的方法，此方法有检测灵敏度较低，操作复杂，周期长等缺点。因此，开发简单快速，灵敏度高，特异性强，准确检测细胞内HIF的分析技术仍然是一个挑战。
[0003]
【发明内容】
:
本发明设计了一种新的脱氧核酸(DNA )序列:5 ’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3 ’，其特点为由合成纳米银簇序列(5 ’ CCTCCTTCCTCC3 ’)和与HIF有相互作用的识别序列(5，CTACGTGCT3)组成的双功能DNA序列为5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。其次以这种双功能DNA为模板，于柠檬酸钠缓冲溶液中，利用NaBH4还原AgNO3的方法，成功合成了具有荧光的核酸纳米银簇(DNA-AgNCs )。这种核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)在激发波长为510 nm下能发射585 nm的荧光，DNA-AgNCs的荧光量子产率为34.4% (以罗丹明B为参照)，纳米银簇的大小为~2 nm。其585 nm的荧光能被DNA的互补序列(AGCACGTAG)及HIF高表达的肿瘤细胞全蛋白淬灭，说明该核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)是一种灵敏的荧光探针，可用于定性分析细胞全蛋白中HIF的含量，并可用于区分HIF高表达的肿瘤细胞和正常细胞。此荧光探针4°C环境中可保存大于4个月荧光未见明显变化。
[0004]一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，按照下述步骤进行: 以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为模板，在柠檬酸钠缓冲溶液中，加入由合成纳
米银簇序列5’ CCTCCTTCCTCC3’和与HIF有相互作用的识别序列5’ CTACGTGCT3?组成双功能DNA，序列为5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’和AgN03混匀后放置到水浴中，20-68°C加热0.5-2 min,最佳lmin，后缓慢降温到室温1-2 h,最佳Ih ;加入NaBH4溶液将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，转移到4°C环境中避光放置1-4天，最佳3天，即可得到稳定的荧光探针。
[0005]其中所述的柠檬酸钠缓冲溶液的pH 5.0-6.0，浓度为10-20 mM，最佳条件pH5.0,浓度为 10 mM。
[0006]其中所述的双功能DNA与Ag+的摩尔比为1:10 -1:20，最佳摩尔比为1:15。
[0007]其中所述的NaBH4与Ag+的摩尔比:1:2- 4:1，最佳摩尔比:1:1。
[0008]本发明利用HIF与特定核酸序列的特异结合，将这种微观结合信号放大为宏观荧光变化，来实现HIF的探测，是一种简便，直观的分析方法。
[0009]【专利附图】
【附图说明】:
图1为DNA-AgNCs的荧光激发和发射光谱图；
图2为DNA-AgNCs柠檬酸钠缓冲液中逐渐增加正常细胞全蛋白㈧，H印G-2细胞全蛋白⑶的荧光图。
[0010]【具体实施方式】:
核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)的合成
实施例1 (核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)最佳制备方案):以5’CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为樽板，在3 mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.0，10 mM)中，加入 400 umol 的双功能 DNA (DNA 的序列是“5，CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’ ”)(序列由我们自己设计，用上海生物生工公司DNA合成仪合成，经过HPLC纯化，质谱验证序列为5’CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’ )和 6mmol AgNO3 (其中 DNA 与 Ag+ 的摩尔比为 1:15 )混匀后放置到水浴中，68°C加热稳定I min后，开始降温，经过2h后，降为室温。在稳定于室温的反应液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4与Ag+的摩尔比2:1)，于室温静止放置15 min，将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，将反应液转移到4°C环境中避光放置3天，即可得到稳定的荧光探针溶液5mL。以激发510 nm获得波长585 nm的荧光，荧光量子产率为34.4% (以罗丹明B为参照)。纳米粒径2 nm。
[0011]实施例2:以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为樽板，在3 mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.4, 10 mM)中，加入400umol的模板DNA和8 mmol AgNO3 (其中DNA与Ag+的摩尔比为1:20 )混匀后放置到水浴中，68°C加热稳定0.5 min后，开始降温，经过Ih后，降为室温。在稳定于室温的反应液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4与Ag+的摩尔比2:1)，于室温静止放置20 min，将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，将反应液转移到4°C环境中避光放置I天，即可得到DNA-AgNCs荧光探针溶液5mL。以激发510 nm获得波长585 nm的荧光，荧光量子产率为11.4% (以罗丹明B为参照)。
[0012]实施例3:以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为模板，在6 mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 6.0, 20 mM)中，加入 400 umol 的模板 DNA 和 8 mmol AgNO3 (其中 DNA 与 Ag+的摩尔比为1:20 )混匀后放置到水浴中，30°C加热稳定2 min后，开始降温，经过1.5 h后，降为室温。在稳定于室温的反应液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4与Ag+的摩尔比4:1)，于室温静止放置10 min，将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，将反应液转移到4°C环境中避光放置I天，即可得到DNA-AgNCs荧光探针溶液6 mL。以激发510 nm获得波长585 nm的荧光，荧光量子产率为3.4% (以罗丹明B为参照)。
[0013]实施例4:以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为模板，在3 mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.0, 10 mM)中，加入 400 umol 的模板 DNA 和 6 mmol AgNO3 (其中 DNA 与 Ag+的摩尔比为1:15 )混匀后放置到水浴中，40°C加热稳定I min后，开始降温，经过1.5 h后，降为室温。在稳定于室温的反应液中加入NaBH4溶液(其中NaBH4与Ag+的摩尔比2:1)，于室温静止放置20 min,将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，将反应液转移到4°C环境中避光放置3天，即可得到DNA-AgNCs荧光探针溶液5 mL。以激发510 nm获得波长585 nm的荧光，荧光量子产率为16.7% (以罗丹明B为参照)。
[0014]
核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)与DNA互补序列及细胞全蛋白的作用 实施例5 DNA-AgNCs荧光探针溶液与互补序列的作用
步骤一.取合成好的DNA-AgNCs，配成4uM的DNA-AgNCs柠檬酸钠缓冲液(pH 7.0，10mM)，放于4°C避光环境中。
[0015]步骤二.配置浓度为IOuM的DNA互补序列。
[0016]步骤三.在4uMDNA _AgNCs中加入DNA互补序列。使互补序列的最终浓度分别为
O,0.7，1.4，2.1，2.8，3.5，4.2 uM)，并分别测荧光光谱。整个过程样品应保持在4°C环境下。
[0017]测量结果显示互补序列使DNA-AgNCs的荧光淬灭，表明DNA-AgNCs与互补序列结合导致纳米其荧光淬灭。
[0018]实施例6 DNA-AgNCs荧光探针与肿瘤细胞H印G_2全蛋白的作用
步骤一.取合成好的DNA-AgNCs，配成4uM的DNS-AgNCs柠檬酸钠缓冲液(pH 7.0，10mM)，放于4°C避光环境中。
[0019]步骤二.用细胞裂解法提取H印G-2细胞全蛋白，浓度为2 mg/mL。
[0020]步骤三.在4uM DNA-AgNCs中加入H印G-2全蛋白，使全蛋白的最终浓度分别为
O,0.7，1.3，2.0，2.7，3.3，4.7，6.0，ug/mL.，并分别测荧光光谱。整个过程样品应保持在4°C环境下。
[0021]测量结果见附图2，图2显示肿瘤细胞全蛋白显著淬灭DNA-AgNCs的荧光。
[0022]实施例7 DNA-AgNCs荧光探针与正常肝细胞全蛋白的作用
步骤一.取合成好的DNA-AgNCs，配成4uM的DNS-AgNCs柠檬酸钠缓冲液(pH 7.0，10mM)，放于4°C避光环境中。
[0023]步骤二.用细胞裂解法提取正常肝细胞wrl-68细胞全蛋白，浓度为2 mg/mL。
[0024]步骤三.在4uMDNA_AgNCs中加入wrl_68全蛋白，使全蛋白的最终浓度分别为0，
0.7，1.3，2.0，2.7，3.3，4.7，6.0，ug/mL.，并分别测荧光光谱。整个过程样品应保持在4°C环境下。[0025]测量结果见附图2.图2显示正常肝细胞wrl-68全蛋白使DNA-AgNCs的荧光增强。
[0026]核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)与肿瘤细胞全蛋白和正常细胞全蛋白的作用参见实施例6和实施例7，具体特征为:将HIF高表达的肿瘤细胞H印G-2的细胞全蛋白，逐量加到DNA-AgNCs柠檬酸钠缓(pH 7.0)冲溶液中，分别测量其荧光光谱的变化(图2)，可发现随着细胞全蛋白量的增加，荧光逐渐减弱。由于ctDNA和BSA均使核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)探针的荧光强度增强，可排除细胞中核酸和蛋白物质的影响，对比试验也显示正常细胞的全蛋白使核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)荧光增强，由于H印G-2中HIF高表达(HIF的含量通过电泳分析得到证实)，HIF与核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)特异性结合作用使其荧光淬灭，荧光的降低归于HIF与DNA-AgNCs的作用。结果显示核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)可作为细胞中HIF变化的定性分析核酸纳米银簇(DNA-AgNCs)荧光探测试剂，也可用去区别肿瘤细胞与正常细胞。`
【权利要求】
1.一种核酸序列5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’,其特征为:由合成纳米银簇序列(5’ CCTCCTTCCTCC3’ )和与HIF有相互作用的识别序列(5’ CTACGTGCT3)组成双功能核酸(DNA),质谱验证序列为 5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。
2.一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行: 以5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3，序列为模板，在柠檬酸钠缓冲溶液中，加入由合成纳米银簇序列5’ CCTCCTTCCTCC3’和与HIF有相互作用的识别序列5’ CTACGTGCT3组成双功能DNA，序列为5’ CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’和AgN03混匀后放置到水浴中，20-68°C加热0.5-2 min,最佳lmin，后缓慢降温到室温1-2 h,最佳Ih ;加入NaBH4溶液将DNA-Ag+还原成DNA-Ag，转移到4°C环境中避光放置1-4天，最佳3天，即可得到稳定的荧光探针。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于其中所述的柠檬酸钠缓冲溶液的pH 5.0-6.0，浓度为10-20 mM。
4.根据权利要求2所述的一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于其中所述的双功能DNA与Ag+的摩尔比为1:10 -1:20。
5.根据权利要求2所述的一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于其中所述的NaBH4与Ag+的摩尔比:1:2- 4:1。
6.根据权利要求 2所述的一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于其中所述的柠檬酸钠缓冲溶液的PH5.0，浓度为10 mM。
7.根据权利要求2所述的一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于其中所述的双功能DNA与Ag+的摩尔比1:15。
8.根据权利要求2所述的一种用于检测缺氧诱导因子的荧光纳米核酸银的制备方法，其特征在于其中所述的NaBH4与Ag+的摩尔比为1:1。
9.权利要求2制备的荧光纳米核酸银在HIF检测中的运用，可用于定性分析细胞全蛋白中HIF的含量，并可用于区分HIF高表达的肿瘤细胞和正常细胞。
【文档编号】C12N15/11GK103602670SQ201310338051
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】陈秋云, 赵婷婷, 杨欢 申请人:江苏大学