一种单通道双浓度梯度微流控芯片的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种单通道双浓度梯度微流控芯片，包括侧通道、主通道以及位于侧通道和主通道之间的一层PDMS膜，所述侧通道为化学吸氧反应通道，其两端分别为反应物入口和出口，所述反应物入口和出口之间依次设有混合区和反应区域，所述主通道为细胞培养通道，所述主通道的两端分别为入口和出口，氧气梯度和药物浓度梯度在主通道上形成。本发明还公开了上述芯片的制备方法和使用方法，建立了一个氧气浓度和化学药物浓度的双重梯度模型，应用于肿瘤细胞药物筛选。
【专利说明】一种单通道双浓度梯度微流控芯片的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微流控【技术领域】、药物筛选领域及生物检测领域，具体涉及一种可在 单通道实现氧气浓度和化学浓度双梯度的微流控芯片。
【背景技术】
[0002] 目前，大部分药物筛选的考察方法忽略了肿瘤细胞在体内所处的缺氧微环境，由 于细胞的生长状态与其在体内的微环境差异很大，因而药效测试准确度不高，且受体内诸 多因素制约。在人类的各种癌症中，实体瘤占了大于90 %的比例，实体瘤内部存在的一部分 的细胞处在缺氧或者无氧的微环境下，处于缺氧微环境下的肿瘤细胞对化学药物的治疗有 抵抗性，这不仅仅是因为处于缺氧情况下的细胞本身对大多数抗肿瘤药物具有抗性，更因 为缺氧的细胞位于肿瘤内离血管最远的地方，而且抗肿瘤的化学药物一般是通过血管扩散 到细胞的周围，因为离血管较远的缺氧肿瘤细胞能够接收到的抗肿瘤药物比离血管较近的 细胞少的多，导致缺氧微环境下化学抗肿瘤药物对肿瘤细胞药物毒性作用较弱。因此，肿瘤 药物的筛选要结合肿瘤细胞所处的缺氧微环境，才能更好的发挥药效。实体瘤细胞不但处 在低氧的微环境，而且微环境的氧气浓度并不是均一的，而是以浓度梯度的方式存在的。因 此，在肿瘤药物筛选时，考察肿瘤药物在不同氧气浓度下的药效，可为抗癌药物的研发提供 理论依据。
[0003] 传统的方法在体外制造低氧浓度是通过将培养液与特定氧浓度气体进行交换来 实现，但是这种物理方法需要很多设备的辅助，例如氧气罐和气体混合装置。用氯化钴、 硫代硫酸钠等化学除氧物质也可以实现低氧，同时会伴随有重金属毒性和有毒副产品的产 生。
[0004] 近年来，微流控芯片以能够更好地模拟体内环境以及多功能集成等特点逐渐成为 一种新兴的研究平台。目前，基于微流控芯片技术来产生氧浓度梯度的方法已经有了报道。 最简单的方法是将用于细胞培养的微流控芯片装置置于细胞培养箱中，通过调节细胞培养 箱中氧气的浓度实现缺氧环境，但整个芯片通道中的氧浓度均一，不能实现氧气浓度梯度； 另一种方法是通过细胞自身呼吸在管道内产生氧浓度梯度，利用微流控芯片的设计，在一 定操作环境下调节芯片内细胞培养的自分泌和旁分泌代谢物，在芯片的轴向形成氧浓度梯 度，但是这种方法也有不足之处，产生的氧浓度梯度仅仅只能在沿管道轴向的方向，而且不 能产生非常低的氧浓度和高氧浓度。最普遍的方法是利用PDMS良好的透气性，在芯片上集 成不同浓度气体通道，不仅可以实现细胞培养通道和气体控制通道的分割，而且可以有效 快速地实现气体的交换，进而形成氧气浓度梯度。这种方法存在的缺限是，芯片结构较复 杂，需要两层或者三层，制作较麻烦，需要外接气瓶并对其精确控制，操作复杂。现在，利用 一些缺氧试剂实现氧气浓度梯度，这种方法很好地简化了芯片的复杂程度，操作也更加简 单方便，但化学试剂都是有细胞毒性的，对其生物相容性有很严格的要求，对细胞的活性有 影响。更为重要的是，目前现有的这些方法都只能实现氧浓度梯度这一种类型的浓度梯度。
[0005] 生物分子的浓度梯度在许多生物过程中发挥着重要作用，包括细胞增殖、炎症和 伤口的愈合以及肿瘤转移等。体外研究这些生理现象，就需要模仿生物体内这种可控的、可 以量化的浓度梯度。微流控技术是研究生物体内化学浓度梯度比较有前景的技术，其可以 通过控制对流与扩散的传输过程使生化分子在时间和空间上分布产生化学浓度梯度。但 是，目前的微流控浓度梯度发生器，仍然有许多不足的地方，例如不能再现细胞在体内的空 间和时间的动态梯度，形成梯度的跨度窄和精度不高等，因此需要研制性能更好的微流控 浓度梯度发生器，以满足更高的研究需要。构建氧气浓度梯度和化学浓度梯度的微流控 芯片需要复杂的微流控芯片设计和精密的仪器。例如，L. Wang等人构建了氧气梯度和化 学浓度提度双浓度梯度的微流控芯片（Lab Chip，2013, 13, 695 - 705.)，用于细胞研究，但 是，这种微流控装置氧气梯度是通过直接向细胞培养基中加入耗氧试剂，化学试剂会改变 细胞培养基的组成，更可能影响细胞行为。最近，Wen Chang等改进了氧气浓度的产生，采 用对细胞无毒害的方式，制备了一种氧气梯度和化学浓度梯度双浓度梯度的PDMS-PC微 流控芯片（Chia-Wen Chang, Yung-Ju Cheng, Melissa Tu, Ying-Hua Chen, Chien-Chung Peng, Wei-Hao Liaoa, Yi-Chung Tung, Lab Chip, 2014, 14, 3762 - 3772)，但该芯片有三层复 杂结构，操作繁琐。郑允焕等研究了一种用于药物筛选的微流控双层结构细胞阵列芯片， 芯片设计了药物浓度梯度网络，通过对芯片3种共培养细胞活性的检测和药物伊立替康 (CTP-Il)对肝癌细胞的浓度梯度刺激等实验结果，验证该芯片在细胞研究和药物筛选等方 面的可行性。
【发明内容】
[0006] 针对上述现有技术，本发明提供了 一种单通道双浓度梯度微流控芯片，建立了一 个氧气浓度和化学药物浓度的双重梯度模型，应用于肿瘤细胞药物筛选。
[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0008] -种单通道双浓度梯度微流控芯片，包括侧通道、主通道以及位于侧通道和主通 道之间的一层PDMS膜，所述侧通道为化学吸氧反应通道，其两端分别为反应物入口和出 口，所述反应物入口和出口之间依次设有混合区和反应区域，所述主通道为细胞培养通道， 所述主通道的两端分别为入口和出口，氧气梯度和药物浓度梯度在主通道上形成。
[0009] 所述反应物入口为2个。
[0010] 所述混合区为S型通道，可以使两者反应物充分混合，并发生反应。
[0011] 所述反应区域为槽状结构,其中，槽深60-80 μ m，宽400-500 μ m，可以增加键合的 牢固度，保证反应液不会进入下侧通道。
[0012] 所述PDMS膜的厚度为60-80 μ m，太薄缺氧反应液容易进入主通道，太厚不利于氧 气扩散。
[0013] 所述侧通道的反应物入口和出口均为球形，两者的半径均为200-300 μ m。
[0014] 所述主通道的出、入口均为球形，两者的半径均为300-500 μ m。
[0015] 所述主通道宽度为800-1000 μ m，侧通道宽度为100-120 μ m，高度均为 80-100 μ m，便于细胞生长。
[0016] 本发明还提供了一种上述芯片的制备方法，是通过以下步骤完成的：
[0017] (1)在设定厚度的SU-8负光胶的硅基片模板上通过紫外曝光形成微通道图案； (2)将PDMS预聚物和交联剂混合均勻，浇注到水平放置的周围有围堰的SU-8模具上，空脱 气后加热至固化后取出、切割和剥离PDMS，然后分别在入口和出口处打孔；（3)再将打孔后 的PDMS厚片与玻璃片进行永久性键合，形成封闭微通道，即完成整个芯片的制作。
[0018] 本发明还提供了一种上述芯片的肿瘤细胞药物筛选的应用，是通过以下步骤实现 的：
[0019] (1)先用多聚赖氨酸对芯片主通道进行修饰；（2)然后在主通道中通入肿瘤细胞， 之后向侧通道的两个反应物进口同时分别邻苯三酚和氢氧化钠；（3)从主通道左侧通入 1640培养基，然后在主通道两侧各加一个储液池，并向入口一侧的储液池中加入肿瘤细胞 药物，向出口一侧的储液池加入同体积的1640培养基；(4)将芯片放入培养箱中，测试氧气 浓度、药物浓度和细胞存活率指标。
[0020] 双梯度是一种集合的方式，氧气浓度是利用氧气扩散形成的，化学浓度梯度是通 过化学试剂扩散形成的。侧通道中通入缺氧试剂进行缺氧反应，主通道中氧气纵向向侧通 道中扩散，平衡后，形成氧气梯度。主通道中顺钼通过扩散横向形成浓度梯度。氧气浓度梯 度和化学浓度梯度的表征是通过测定对氧气敏感和浓度敏感的荧光物质实现的。由于氧 气扩散的方向和化学物质的扩散方向是垂直的，荧光物质又是溶液，同时使用荧光物质表 征氧气浓度和化学药物浓度，将不能得到准确地氧气浓度梯度。因此，在双浓度梯度下培养 Hela细胞，Hela细胞是肿瘤细胞，对氧气和肿瘤药物敏感，通过Hela肿瘤细胞的存活率反 应双浓度梯度的实现。
[0021] 本发明的有益效果为：
[0022] 1.本申请采用整合双重浓度梯度的方法，不仅可以在时间和空间上对氧气梯度和 浓度梯度进行精确控制，而且氧气梯度和药物浓度梯度是在单通道上渐变的，更能准确模 拟体内细胞微环境；
[0023] 2.这个微流控装置可用于同时研究对氧和化学药物敏感的细胞生物学行为，通过 计算细胞存活率一次性的得出半数抑制浓度IC 5tl，为肿瘤药物筛选提供理论依据；
[0024] 3.氧气浓度梯度是通过化学吸氧反应使氧气扩散实现的，能够稳定存在，并且耗 氧试剂不跟细胞直接接触，对细胞无毒害；同时在单通道上形成化学药物梯度，药物浓度梯 度是通过药物分子的扩散实现的，通过在出入各加一个储液池维持药物浓度梯度稳定；我 们利用设计的微流控装置观察了抗癌药物在双浓度梯度下对Hela细胞存活率的影响，同 时得出抗癌药物的ICJt ;
[0025] 4.这种微流控装置研究对肿瘤细胞的药物筛选提供了一个直观的比较，更精确的 模拟肿瘤细胞的微环境，更真实的反映肿瘤药物的药效，为在体外建立药物筛选模型提供 依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明涉及的芯片结构示意图；
[0027] 图2为氧气浓度梯度形成示意图，其中，（a)为俯视图，（b)为截面图；
[0028] 图3为药物浓度梯度形成示意图，其中，（1)为加入0. 2μ 1药物工作液，（2)为继 续加入0. 2μ 1工作液，（3)为在出入口两端加储液池，左侧为药物工作液，右侧为1640培 养基，（4)为形成浓度梯度后的侧视图；
[0029] 图4为吸氧反应下荧光强度分布图；
[0030] 图5为吸氧反应下通道不同位置氧气浓度分布图；
[0031] 图6为荧光强度与罗丹明B浓度的关系图；
[0032] 图7为罗丹明B浓度与位置的关系图；
[0033] 图8为Hela细胞在氧气浓度梯度和药物浓度梯度下的存活率示意图，其中A、B、 C、D为芯片中的不同区域。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0035] 本发明【具体实施方式】中所用试剂如下：
[0036] Sylard 184聚二甲基硅氧烷（PDMS，道康宁公司，美国），实验所用水和溶液配置 所需纯水由Milli-Q超纯水系统（Millipore，美国）制备，邻苯三酚（国药集团化学试剂 有限公司），NaOH(北京化工厂），无水乙醇（北京化工厂），三（4, 7-联苯-1，10菲咯啉） 二氯化钌（II)复合物（sigma)，顺钼（sigma)，微量注射泵（HARVARD)，硅基片SU-8模具 (北京博奥生物有限公司），SU-8负光胶（Microchem公司）、荧光显微镜（1X81，OLYMPUS)， DMSO (Invitrogen 公司）、Calcein-AM(Invitrogen 公司）、PI (Invitrogen 公司）、1640 培 养基（Invitrogen 公司）。
[0037] 本发明【具体实施方式】中相关溶液的组分或配制方法如下：
[0038] (a) I XPBS缓冲液溶液（磷酸盐缓冲液）IOOOml，其中
[0039] NaCl 8.00 g KCl 0.20 g Na2HPO4* 12H20 1.56 g KHoPO4 0.20 g
[0040] (b)胰蛋白酶溶液100ml，其中
[0041] Tripsin (1 ； 250) 0. 25g
[0042] IXPBS缓冲液溶液 50ml
[0043] 胰蛋白酶具体使用方法：吸掉培养瓶内的培养基，加2mlPBS溶液，重复清洗两次， 移除瓶内PBS溶液，加入Iml 0. 25%胰蛋白酶溶液，轻轻摇晃培养瓶，使胰酶溶液充分覆盖 底部所有细胞，倒掉胰酶溶液，随后将培养瓶放入培养箱中孵育8min ;加入2ml培养基终止 消化，用移液枪吸取瓶内培养基，反复吹打培养瓶底部至所有细胞脱落；将细胞悬液转移到 I. 5ml的PV管中，用离心机离心5min ;离心结束后，用移液枪去除上层的培养基，吹打离心 后的细胞，使其成为均匀的细胞悬液，将细胞悬浮液通入芯片用于实验。
[0044] (C)活死细胞双染溶液
[0045] 用 Iml 无水 DMSO 溶解 Img Calcein-ΑΜ,制备成 lmmol/L 的 Calcein-AM 储备 液，-20°C下保存；
[0046] 用Iml二次水溶解Img PI (碘化批陡），制备成I. 5mmol/L的PI储备液，-20°C下 密封保存；
[0047] 将Calcein-AM和PI储备液恢复到室温后，加10 μ ICalcein-AM储备液、15 μ I PI 储备液至5mlPBS缓冲液中，Calcein - AM最终浓度为2 μ mol/L，PI最终浓度为4 μ mol/L。
[0048] (d)肿瘤药物的配制
[0049] 顺钼溶液：称取顺钼，溶于生理盐水中，配制lmg/ml的储备液，储存于_20°C。使 用时，用含10%血清的1640培养基稀释至40uM，现配现用。
[0050] ( -）一种单通道双浓度梯度微流控芯片，如图1所示，包括侧通道、主通道以及位 于侧通道和主通道之间的一层厚度为60-80 μ m的PDMS膜，所述侧通道为化学吸氧反应通 道，其两端分别为球形反应物入口和球形出口，所述反应物入口为2个，所述反应物入口和 出口之间依次设有S型混合区和槽状的反应区域，所述主通道为细胞培养通道，所述主通 道的两端分别为球形入口和球形出口，氧气梯度和药物浓度梯度在主通道上形成。
[0051] 所述侧通道的反应物入口和出口的半径均为200-300 μ m。
[0052] 所述主通道的出、入口的半径均为300-500 μ m。
[0053] 所述主通道宽度为800-1000 μ m，侧通道宽度为100-120 μ m，高度均为 80-100 μ m，便于细胞生长。
[0054] (三）上述芯片的制备方法，是通过以下步骤完成的：
[0055] (1)用AutoCAD 2010绘制微通道图案，再将图案打印到透明胶片上，然后采用标 准光刻技术将图案转移到设定厚度的SU-8负光胶的硅基片模板上，坚膜后即形成由凸起 SU-8构成的图案；（2)将PDMS预聚物和交联剂按照质量比10:1混合均匀，浇注到水平放置 的周围有围堰的SU-8模具上，空脱气15分钟后，于70°C烘箱中加热2小时，直至刚好固化 后取出、切割和剥离PDMS，然后用空心不锈钢微针分别在入口和出口处打孔；（3)再利用等 离子清洗机将打孔后的PDMS厚片与洁净干燥的玻璃片进行永久性键合，形成封闭微通道， 即完成整个芯片的制作。
[0056] (三）芯片在肿瘤药物筛选的应用，如图2(a)、（b)所示，⑴先对芯片通道进行 修饰，向主通道中通入0. 1%多聚赖氨酸，放入培养箱中静置2h，用PBS缓冲液将芯片冲 洗三次；（2)然后在微流控芯片主通道中通入经过胰蛋白酶处理的Hela细胞，放入培养箱 12h，之后向侧通道的两个反应物进口同时分别输入100mg/l邻苯三酚和IM氢氧化钠，平 衡2h，使主通道内形成氧气浓度梯度；（3)从主通道左侧通入1640培养液，然后在主通道 两侧各加一个储液池，并向左侧储液池中加入40 μ M顺钼工作液，向右侧储液池加入同体 积的1640培养基，所加的体积大于10倍主通道体积即可，这样储液池两侧液面会保持向 平，顺钼会在主通道中扩散形成浓度梯度，主通道中的Hela细胞会处在氧气浓度和药物浓 度的双浓度梯度环境中；(4)将芯片放入培养箱中12h，用活死细胞双染溶液测定细胞存活 率。侧通道中邻苯三酚在碱性环境下（NaOH)发生吸氧反应，导致与之相邻的主通道中氧气 经PDMS膜向侧通道中扩散，进而在主通道中形成了氧气浓度梯度。氧气浓度测定实验中， 将800 μ m主通道等分为8份，测定九个不同位置的氧气浓度。
[0057] (四）芯片上氧气浓度梯度的测定与表征
[0058] 1.氧气敏感荧光指示剂
[0059] 为了直观准确地测定芯片通道内的氧气浓度，采用对氧气敏感的荧光指示剂三 (4, 7-联苯-1，10菲咯啉）二氯化钌（II)复合物进行表征。原理为，此种荧光指示剂荧 光强度因被分子氧动态猝灭而显著减弱，它是基于强度或衰减时间测量的有效氧探针，在 不同的氧气浓度下有不同的荧光强度，而且氧气浓度越低，荧光强度越大，最大吸收波长为 455nm，最大发射波长为613nm。
[0060] 荧光强度的测定条件：荧光指示剂浓度为250 μ M(溶于无水乙醇），激发波长为 455nm，突光显微镜曝光时间为10ms。
[0061] 2.氧气浓度与荧光强度间关系标准方程的测定
[0062] 为了将荧光强度转换成氧浓度，检测纯N2和空气的荧光强度来做两点标定。氧浓 度通过检测的荧光强度和Stern-Volmer公式来计算：1/1 = 1+Kq[02]。其中I代表有氧时 的荧光强度，Itl代表无氧时即纯氮气环境中的荧光强度，Kq代表淬灭系数。令I代表氧气 浓度为21 %时对应的荧光强度，由上式可知，只要测得ItlU空气就可得到Kq，把Kq值带入 上式就可以得到荧光强度和氧气浓度间的关系方程。
[0063] 控制微量注射泵，同时向侧通道中通入邻苯三酚和氢氧化钠溶液开始吸氧反应， 其中，邻苯三酚浓度C邻苯 ΞΡ&= 100mg/ml，氢氧化钠浓度Cs氧化lmol/1，两个泵的流速都 为0. lml/h，两种反应物的流速总是保持一致，将芯片放到荧光显微镜上，实时测定主通道 内不同位置荧光指示剂的荧光强度。
[0064] 这种测定方法，可以实时快速准确地观测芯片通道内荧光指示剂荧光强度的大小 分布和变化。如图4可以看出，主通道中荧光强度分布规律为从上到下逐渐增大，即越靠近 吸氧反应通道，荧光强度越大，由荧光强度和氧气浓度间关系式可以计算出荧光强度对应 的氧气浓度，进而可以得出图5。由图5可以看出，在吸氧反应和气体扩散作用下，在设计的 芯片上可以实现氧气浓度梯度的建立，氧气浓度范围从接近反应一侧的6. 11%逐渐增大到 远离反应一侧的17. 49%。
[0065](五）药物浓度梯度的建立与表征
[0066] 先在主通道中充满1640培养基，然后向主通道中加入0. 2μ 1肿瘤药物工作液， 由于入口和出口两个液滴的液滴大小不一样，表面张力也不一样，半径小的表面张力大，出 口的液滴半径太大其表面张力可以近似认为零，这样入口液滴的表面张力驱使顺钼工作液 在主通道中流动，如图3 (1);待顺钼工作液停止流动后，继续滴加0. 2 μ 1顺钼工作液，工作 液又会在表面张力的驱使下流动，在肿瘤药物工作液完全进入通道中后，如图3(2);在出 入孔两端加储液池，在储液池中加入足够多且相等的液体，一端加药物工作液，一端加1640 培养液，液体的体积要大于10倍主通道中的体积，之后主通道内药物会通过扩散形成浓度 梯度并维持稳定，如图3(3)、3(4)。由于储液池中的体积远远大于主通道中的体积，在顺钼 扩散过程中，顺钼的初始浓度一直不变，出口处的顺钼浓度一直微零，浓度梯度稳定形成， 即实现了在"单通道"形成梯度浓度。
[0067] 浓度梯度的表征
[0068] 为验证芯片形成了浓度梯度，采用荧光染料罗丹明B代替药物进行芯片的药物浓 度梯度的表征实验。首先配制不同浓度的罗丹明B溶液，测定其浓度与荧光强度的关系，然 后在芯片中形成罗丹明B浓度梯度，测定特定点的荧光强度，可得浓度梯度。
[0069] 为更直观的表征主通道内浓度梯度的生成以及浓度梯度的稳定性，测定荧光染料 在不同位置不同时间的荧光强度。在芯片中通入不同浓度的罗丹明溶液，测出荧光强度，得 到荧光强度与罗丹明B的浓度的关系，如图6。从图中可以看出罗丹明B的荧光强度与浓度 成线性关系。在芯片中加入罗丹明B溶液后，使在通道中扩散逐渐形成浓度梯度，0. 5h后， 在几个固定的位置点测量罗丹明B的荧光强度，根据荧光强度与罗丹明B的浓度关系，可以 确定浓度梯度的形成。在2. 5h和4. 5h小时后，测定相同位置的荧光强度，并得相应的罗丹 明B浓度，如图7,可以看出罗丹明B浓度变化不大，能够稳定形成浓度梯度。因此罗丹明B 在半个小时内在通道中形成一定浓度梯度，并且罗丹明B浓度与扩散距离成线性关系。测 量形同位置点在2. 5小时和4. 5小时后荧光强度，进而得出罗丹明B浓度与位置的关系，在 这段时间内罗丹明B的浓度变化不大，能够位置稳定至少4个小时。
[0070] (六）细胞存活率的测定
[0071] 将芯片放入紫外环境中紫外灭菌20min后，通道内注满多聚赖氨酸对芯片通道进 行修饰，使细胞更容易贴壁，放入细胞培养箱中静置过夜。用移液枪吸取充分吹散的心肌细 胞悬浮液，细胞密度为5 X IO6个/ml，缓缓注入芯片通道中。将芯片放到细胞培养箱中进行 培养，培养条件：温度为37°C，CO 2浓度为5%。2h细胞贴壁后，每隔12h观察，换液，记录。 本发明【具体实施方式】中，除特别标明细胞悬浮液细胞密度，所采用的细胞密度都为5X IO6 个/ml，所采取的计数方法都为血球计数板计数法。
[0072] 芯片中通入细胞，细胞贴壁后，向芯片主通道中加入含有抗癌药的1640培养液， 依据前述方法形成药物浓度梯度，同时向侧通道中通入邻苯三酚和氢氧化钠溶液，在主通 道内形成氧气浓度梯度。将芯片放入培养箱中，培养12小时，用活死双染试剂测定细胞的 存活率。然后分区域统计细胞的存活率，总结肿瘤细胞在不同氧气浓度不同药物浓度下的 响应，计算出半数抑制浓度IC 5(I。IC5tl是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物 浓度，是分析和比较药效及毒效的重要数值，可以用来测定药物安全性、比较效价等。半数 抑制浓度作为反映药效的定量指标，在肿瘤药物的筛选中广泛应用。
[0073] 同时使主通道的Hela细胞处于氧气浓度梯度和肿瘤药物顺钼的浓度梯度下，观 察细胞在主通道内不同区域的细胞存活率，如图8,从左往右为顺钼的浓度梯度，浓度从大 到小变化；从上到下为氧气的浓度梯度，浓度从大到小变化。从左往右，顺钼的浓度逐渐变 小，因此细胞存活率越来越高；从上到下，氧气的浓度越来越高，细胞的存活率也越来越高。 由于肿瘤细胞在低氧环境中有一定的抗药性，C、D区域的细胞存活率相对A、B较高。在双 浓度区域下，Hela细胞存活一般在B区域，可得IC 5tl为20 μ M。
[0074] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【权利要求】
1. 一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，包括侧通道、主通道以及位于侧通 道和主通道之间的一层PDMS膜，所述侧通道为化学吸氧反应通道，其两端分别为反应物入 口和出口，所述反应物入口和出口之间依次设有混合区和反应区域，所述主通道为细胞培 养通道，所述主通道的两端分别为入口和出口。
2. 如权利要求1所述的一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，所述反应物 入口为2个。
3. 如权利要求1所述的一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，所述混合区 为S型通道。
4. 如权利要求1所述的一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，所述反应区 域为槽状结构，其中，槽深60-80 ii m，宽400-500 ii m。
5. 如权利要求1所述的一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，所述PDMS膜 的厚度为60-80 ii m。
6. 如权利要求1所述的一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，所述侧通道 的反应物入口和出口均为球形，两者的半径均为200-300 ii m。
7. 如权利要求1所述的一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，所述主通道 的出、入口均为球形，两者的半径均为300-500 ii m。
8. 如权利要求1所述的一种单通道双浓度梯度微流控芯片，其特征在于，所述主通道 宽度为800-1000 ii m，侧通道宽度为100-120 ii m，高度均为80-100 ii m。
9. 权利要求1-8任一项所述的芯片的制备方法，其特征在于，是通过以下步骤完成的： (1)在设定厚度的SU-8负光胶的硅基片模板上形成微通道图案；（2)将PDMS预聚物和 交联剂混合均匀，浇注到水平放置的周围有围堰的SU-8模具上，空脱气后加热至固化后取 出、切割和剥离PDMS，然后分别在入口和出口处打孔；（3)再将打孔后的PDMS厚片与玻璃片 进行永久性键合，形成封闭微通道，即完成整个芯片的制作。
10. 权利要求1-8任一项所述的芯片的肿瘤细胞药物筛选的应用，其特征在于，是通过 以下步骤实现的： (1)先用多聚赖氨酸对芯片主通道进行修饰；（2)然后在主通道中通入肿瘤细胞，之后 向侧通道的两个反应物进口同时分别邻苯三酚和氢氧化钠；（3)从主通道左侧通入1640培 养基，然后在主通道两侧各加一个储液池，并向入口一侧的储液池中加入肿瘤细胞药物，向 出口一侧的储液池加入同体积的1640培养基；(4)将芯片放入培养箱中，测试氧气浓度、药 物浓度和细胞存活率指标。
【文档编号】C12Q1/02GK104498331SQ201510009968
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月8日 优先权日:2015年1月8日
【发明者】赵凯, 王宗花, 夏建飞, 张菲菲, 刘正晓 申请人:青岛大学