相关申请的交叉引用本申请要求2014年11月19日提交的题为“使用中链脂肪酸和精油作为缓和动物饲料和成分中沙门氏菌和猪流行性腹泻病毒(pedv)的方式”的美国临时申请序列号62/081,847的优先权，其通过引用全文纳入本文。发明背景发明领域本发明广泛涉及抑制动物饲料、饲料成分和宠物食品中的pedv和/或沙门氏菌的方法。现有技术说明猪流行性腹泻病毒(pedv)是一种冠状病毒，其在美国导致超过800万头猪死亡。虽然该病毒影响所有阶段的猪，但对于哺乳期的猪而言尤其严重，因为它们的消化道发育不足，无法在小肠中吸收营养。该病毒导致严重腹泻和呕吐。该病毒无法传播到其他物种，并且猪肉可安全食用。然而，动物的不佳健康和表现已经导致低的猪肉供应，其是对消费者而言创纪录的美国猪肉价格的原因。该病毒通过粪-口污染传播，但是流行病学和受控制的研究证据确定饲料或食材成分是传播的另一种载体。另外，食材成分的沙门氏菌交叉污染是饲料和精炼工业中的主要问题。首次记载的动物饲料中的沙门氏菌污染情况追溯到1948年。由于历史上在动物饲料中出现过沙门氏菌，美国食品药品监管局对美国基于动物的精炼厂的病原体污染进行调查。在1993年收集的101个基于动物的蛋白质样品中，56％测试为肠沙门氏菌(salmonellaenterica)阳性。作为跟踪调查，在1994年测试了来自饲料模仿和现场农场的精炼的饲料样品，并且fda报告89个测试的样品中25％是肠沙门氏菌阳性。在此之后，其他研究显示了相似的结果，包括这样一项研究，其中165个测试的样品中85％为革兰氏阴性菌阳性，并且10％为沙门氏菌阳性。虽然认为在动物饲料中的沙门氏菌是较低风险的，但是动物的沙门氏菌病已经与人类疾病相关联。此外，沙门氏菌已经成为宠物食品中日益增加的问题。在2007年，施瓦曾格隆得沙门氏菌(salmonellaschwarzengrund)爆发影响了21个国家的105种宠物食品品牌。虽然并不知晓该爆发是否导致宠物死亡，但有79例人类疾病并有1家宠物食品厂关闭。因此，宠物食品被评价为潜在“危险”，这使得宠物食品与牲畜饲料的规定不同。这强制推动工业界齐心协力增设人力以遵守预期的规定，针对沙门氏菌付出努力。这导致增加的分析频率(和成本)以及实施用于控制的“最佳猜测”策略。事实上，一些工厂将永远无法满足新的标准。虽然已经提出并测试了一些针对pedv和沙门氏菌的缓和策略，但之前的策略存在多种缺陷，包括容量有限的工厂，依赖于病毒颗粒和基因组大小的功效，和各种未知有效剂量以及对其他营养组分的负面影响。因此，需要新策略来抑制饲料和饲料成分中的pedv和沙门氏菌。技术实现要素：在本发明的实施方式中，提供了抑制动物饲料或动物饲料成分中猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus)的方法。该方法包括向饲料或饲料成分中引入化学缓和剂。化学缓和剂包含中链脂肪酸和/或精油，并且化学缓和剂以约0.01重量％至约5重量％的包含率引入饲料或饲料成分。在另一个实施方式中，提供了抑制动物饲料或动物饲料成分中沙门氏菌(salmonella)的方法。该方法包括向饲料或饲料成分中导入化学缓和剂。化学缓和剂包含中链脂肪酸、精油、和/或硫酸氢钠，并且化学缓和剂以约0.01重量％至约5重量％的包含率引入饲料或饲料成分。在另一个实施方式中，提供了包含约0.01重量％至约5重量％的中链脂肪酸和/或精油的动物饲料。在另一个实施方式中，提供了包含约0.1重量％至约2重量％的硫酸氢钠的宠物食品。优选实施方式的详细描述更具体地，本发明涉及在动物饲料、饲料成分和宠物食品中抑制pedv和/或沙门氏菌的方法。更具体地，本发明涉及使用化学缓和剂来抑制各种类型的动物和宠物食品成分，以及完全饲料餐和宠物食品产品中的pedv和/或沙门氏菌。本文所用的“抑制”或“阻遏”是指与未处理的对象相比，降低目标微生物(即，pedv或沙门氏菌)的可测量水平或降低微生物的生长速率。在某些实施方式中，本发明的方法使用有效量的化学缓和剂来抑制动物饲料或动物饲料成分中的pedv，例如，在通过rt-pcr检测的水平以下。在某些其他实施方式中，本发明的方法使用有效量的化学缓和剂来抑制动物饲料或动物饲料成分中的沙门氏菌。本文所用的“有效量”是指能够提供足以实现所需的性能改善的活性化合物(即，中链脂肪酸、精油、和/或硫酸氢钠)的生物可利用水平的量。在优选的实施方式中，本发明的方法有利地适用于动物饲料成分运输和储存。用于本发明的某些实施方式中的化学缓和剂(chemicalmitigant)可包括中链脂肪酸、精油、和/或硫酸氢钠。中链脂肪酸是具有6-12个碳原子的脂族尾的酸。在某些实施方式中，用于本发明的中链脂肪酸包括己酸、辛酸、癸酸、和/或月桂酸。因此，在某些实施方式中，化学缓和剂选自下组：己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、及其混合物。然而，在某些其他实施方式中，化学缓和剂不含月桂酸。因此，在这些实施方式中，化学缓和剂可选自下组：己酸、辛酸、癸酸、及其混合物。在某些实施方式中，可使用中链脂肪酸的掺混物。例如，在某些实施方式中，两种或更多种中链脂肪酸的掺混物可引入饲料或饲料成分。在某些实施方式中，己酸、辛酸、和癸酸的掺混物以约1∶1∶1(等份)的重量比引入饲料或饲料成分。然而，可以使用包含其他重量比的己酸、辛酸、和癸酸的掺混物，这在本发明的范围内。虽然可以使用任何有效量的化学缓和剂，在某些实施方式中，中链脂肪酸或掺混物可以约0.01重量％至约5重量％，更优选约0.5重量％至约3重量％，甚至更优选约1重量％至约2.5重量％，并且最优选约2重量％(饲料或饲料成分的总重量设为100重量％)的包含率引入动物饲料和/或动物饲料成分。精油是含有源自植物的挥发性芳香化合物的浓缩疏水性液体。在本发明的某些实施方式中可以使用许多不同的精油。这些精油的非排他性列表包括：琼脂油、印度藏茴香油、当归根油、茴香油、阿魏油、秘鲁香脂、罗勒油、月桂油、香柠檬油、黑胡椒油、布枯油、桦木油、樟脑油、大麻花香精油、蒿子油、豆蔻籽油、胡萝卜籽油、雪松油、洋甘菊油、菖蒲根油、肉桂油、岩蔷薇净油、香橼油、香茅油、快乐鼠尾草精油、丁香油、咖啡油、艾菊油(香菜油)、花生根油、蔓越莓籽油、荜澄茄油、孜然油/黑种子油、柏油、莎草油、咖喱叶油、印蒿油、莳萝油、土木香油、桉树油、茴香籽油、葫芦巴油、冷杉油、乳香油、高良姜油、甘草油、天竺葵油、姜油、黄花菜油、葡萄柚油、指甲花油、蜡菊油、山核桃油、辣根油、海索草油、爱达荷州艾菊油、茉莉花油、杜松子油、月桂油、薰衣草油、杜香油、柠檬油、柠檬香茅精油、白柠檬油、立德巴油、里哪油、橘皮油、马乔莲精油、美拉洛卡见茶树油、梅利莎油(柠檬香蜂草油)、薄荷油/亚洲薄荷油、莫宁加油、山茶油、艾蒿油、芥子油(精油)、没药油、桃金娘精油、苦楝油或楝树油、橙花精油、肉豆蔻油、橙油、牛至油、奥里斯油、厄瓜多秘鲁圣木精油、欧芹油、广藿香油、紫苏精油、甜薄荷油、薄荷油、苦橙叶精油、松油、罗文沙叶精油、红柏油、罗马洋甘菊油、玫瑰油、玫瑰果油、迷迭香油、玫瑰木油、鼠尾草油、檀香油、樟油、咸油、五味子油、薄荷油、甘松油、云杉油、八角茴香油、橘子油、塔拉贡油、茶树油、百里香油、铁杉油、姜黄油、缬草油、香根草油(须芒草油)、西红杉油、冬青精油、西洋耆草精油、依兰精油和莪术油。在某些实施方式中，化学缓和剂选自大蒜油树脂、姜黄油树脂、辣椒油树脂、迷迭香提取物、野生牛至精油及其混合物。在某些实施方式中，可以使用精油的掺混物。例如，在某些实施方式中，可将两种或更多种精油的掺混物引入饲料或饲料成分。在某些实施方式中，将含有等份大蒜油树脂、姜黄油树脂、辣椒油树脂、迷迭香提取物和野生牛至精油的精油掺混物引入饲料或饲料成分。然而，在本发明的范围内，可以使用包含大蒜油树脂，姜黄油树脂，辣椒油树脂，迷迭香提取物和野生牛至精油的其它重量比的共混物。在某些实施方式中，精油或掺混物可以以约0.01重量％至约5重量％，更优选约0.5重量％至约3重量％，甚至更优选约1重量％至约2.5重量％，最优选约2重量％的包含率引入到动物饲料和/或动物饲料成分中，基于饲料或饲料成分的总重量为100重量％。在某些实施方式中，可以使用包含一种或多种中链脂肪酸和一种或多种精油的掺混物。在某些实施方式中，包含一种或多种中链脂肪酸和一种或多种精油的掺混物可以约0.01重量％至约5重量％，更优选约0.5重量％至约3重量％，甚至更优选约1重量％至约2.5重量％，最优选约2重量％的包含率引入到动物饲料和/或动物饲料成分中，基于饲料或饲料成分的总重量为100重量％。在某些实施方式中，化学缓和剂是硫酸氢钠。硫酸氢钠是被fda认定为“公认安全的”(gras)和“天然产物”的酸性盐。在某些实施方式中，硫酸氢钠可以溶解在溶液中并施用于动物食品或食品成分的表面上，以防止或减少沙门氏菌的生长。在某些实施方式中，将硫酸氢钠溶液施用于干型宠物食品或宠物食品成分的表面。例如，该溶液可以施用于干型狗食品(粗粮)或干型猫食品的表面。在某些实施方式中，溶液可以施用于饲料或成分的表面，以便以约0.1重量％至约2重量％，更优选约0.15重量％至约1.5重量％，甚至更优选约0.2重量％至约1重量％的包含率提供硫酸氢钠，基于饲料或饲料成分的总重量为100重量％。根据本发明使用的化学缓和剂可用于处理多种动物饲料或动物饲料成分。然而，在某些实施方式中，根据本发明的方法特别适用于猪饲料和饲料成分。在这样的实施方式中，动物饲料或动物饲料成分可以选自完全猪饲料、血粉、猪肉和骨粉(mbm)、以及喷雾干燥的动物血浆。在某些实施方式中，动物饲料成分可以包含选自维生素d、赖氨酸盐酸盐、氯化胆碱和豆粕的成分。在其它实施方式中，化学缓和剂可以与宠物食品和宠物食品成分一起使用。在某些实施方式中，宠物食品和宠物食品成分包括干型狗食品(粗粮)和/或猫食。根据本发明的某些实施方式的方法可用于生产动物或宠物饲料。因此，在本发明的一个实施方式中，提供了一种动物饲料，其包含约0.01重量％至约5重量％，更优选约0.5重量％至约3重量％，甚至更优选约1重量％至约2.5重量％，最优选约2重量％的化学缓和剂或化学缓和剂的掺混物(如本文所述的化学缓和剂和掺混物)，基于饲料的总重量为100重量％。在其它实施方式中，提供了包含约0.1重量％至约2重量％，更优选约0.15重量％至约1.5重量％，甚至更优选约0.2重量％至约1重量％的硫酸氢钠的宠物食品，基于宠物食物的总重量为100重量％。本发明的实施方式特别适用于运输饲料和饲料成分。饲料或成分在加工过程中可能被pedv和/或沙门氏菌污染，并且已发现这些污染物可在海外运输和储存期间通常经历的条件下在饲料或成分中存活并生长数天或数周。有利地，本发明的实施方式特别适用于抑制或防止这些污染物的生长。因此，在某些实施方式中，根据本发明的方法包括在饲料或饲料成分加工之后将化学缓和剂引入所述饲料或饲料成分。化学缓和剂可以与饲料或饲料成分混合足够的时间以提供均匀的混合物。在某些实施方式中，根据本发明的方法可以在加工后至少约90天的运输和储存中，加工后至少约60天的运输和储存中，加工后至少约40天的运输和储存，或加工后至少约37天的运输和储存中预防或减少饲料和/或成分中的pedv病毒和/或沙门菌。本发明的实施方式有利地提供了一种在动物或宠物饲料和成分中防控或减少pedv和/或沙门氏菌的安全替代方法。使用有害化学物质的现有方法会对动物的蛋白质和氨基酸代谢产生负面影响。与现有方法不同，本发明以所发现实现pedv和沙门氏菌的有效缓和的剂量使用通常无危害的化学缓和剂。根据本发明使用的化学缓和剂是对工人或环境的安全性基本上没有风险的天然替代物。实施例以下例子列出了各种化学缓和策略对饲料和饲料成分加工后pedv和沙门氏菌污染的有效性。然而应理解，这些实施例通过举例的方式提供，其所含的任何内容都不应视作对本发明整体范围的限制。实施例1在第一项研究中，进行实验以使用10天龄的猪的生物测定法确定并确认饲料基质中pedv的最小感染剂量。通过连续10倍稀释，在组织培养基中制备各种浓度的pedv的剂量。在每个连续稀释之间用4.5kg未感染的饲料冲洗混合器。在混合5.6×104tcid50/g后检测到冲洗中唯一可检测的pedv，并且ct仅为38。这表明冲洗或测序可能降低交叉污染的风险。然而，值得注意的是，这表明检测到了交叉污染，并且推测这可能会导致受感染的猪。将稀释液加入到4.5kg完全饲料中并混合2.5分钟以使pedv病毒均质化和分散。这产生从5.6×104到5.6×10-4tcid50/g的饲料稀释。将混合的饲料加入到磷酸盐缓冲盐水(pbs)和上清液中，在40°f下冷冻过夜，然后收集用于生物测定。生物测定包括接种3头猪，每种剂量加设非接种对照。接种饲料的pcr分析表明，可以检测到5.6×10tcid50/g(ct≈37)。当与接种培养基相比，将剂量放于饲料中时，发生约10ct的损失。在接受pcr阳性接种饲料的所有猪中都存在pedv感染和pcr阳性粪便样品的可见迹象。这清楚表明了pedv感染。饲料基质中pedv的最小感染剂量(mid)似乎≈5.6×10tcid50/g。实施例2在第二项研究中，进行实验以确定造粒完全饲料的调节时间和温度的影响。加工以2×3×3阶乘组织，具有以下变量：pedv剂量(低和高)；调节时间(45秒，90秒和180秒)；和调节温度(155°f，175°f，195°f)。收集饲料用于pcr分析，并用于10天龄的猪生物测定。该研究的结果示于下表1和表2中。表1.低剂量pcrct值。低剂量饲料无加工＝31低剂量组织培养物＝20表2.高剂量pcrct值高剂量饲料无加工＝24高剂量组织培养物＝13实施例3在第三项研究中，进行了实验，以评估各种化学缓和策略对饲料和饲料组分中加工后pedv污染的有效性。处理以7×4阶乘排列，6种化学处理加上对照，4种饲料基质。6种化学处理包括：1)商业甲醛掺混物(termin-8)，2)硫酸氢钠，3)氯酸钠，4)有机酸掺混物，5)中链脂肪酸(掺混物包含大致等份的己酸、辛酸和癸酸)，和6)精油(包含大致等份的大蒜油树脂、姜黄油树脂、辣椒油树脂、迷迭香提取物和野生牛至精油的掺混物)。4种饲料基质包括：1)完全猪饲料(完全苗圃饲料)，2)血粉，3)猪肉和骨粉(mbm)，和4)喷雾干燥的动物血浆。4种饲料处理x6种化学处理(加上1种对照)等于28-1kg批次。首先对饲料基质进行化学处理，然后接种以代表加工后污染物。使用5.6×104tcid50/g的浓度接种的细胞培养中生长的pedv。在第0、1、3、7、14、21和42天采集样品。每个批次有3个分离的重复供于每天分析。所有样品在室温下储存。收集在第0天从4个饲料基质中的每一个的未处理的对照上清液，将其等分冷冻并用作随后分析天的对照。每天将这些样品用作实验室对照以评估测定间变异。通过rt-pcr分析样品的pedv。分析值表示检测前的循环时间或循环阈值(ct)。较低的ct值表示较大的核酸存在，但不一定是感染性。使用sas的glimmix程序分析数据，其具有化学处理、矩阵和时间的固定效应以及所有相互作用。研究结果如下表3-8所示。表3：用于评价测定间变异的对照样品的ct值.表4：在室温下储存的猪饲料中的处理后pedv污染。表5：室温下储存的血粉中的处理后pedv污染。表6：室温下储存的猪肉和骨粉中的处理后pedv污染。*第14天的未处理对照值是第7天和第21天的平均。表7：室温下储存的喷雾干燥的动物血浆中的处理后pedv污染。表8：室温下储存的未处理对照。实施例4在第四项研究中，进行了与上述实施例iii类似的姊妹研究，不同之处在于测试沙门菌细菌的化学缓和，而非pedv。材料和方法化学处理。六种化学处理应用于四种不同的饲料基质。化学处理包括：1)无化学添加的阳性鼠伤寒沙门氏菌，2)0.3％wt/wt商品甲醛产品(末端肽-8(termin-8)，佐治亚州劳伦斯维尔的安尼妥司公司(anitoxcorp))，3)2％wt/wt精油(eo)掺混物[1∶1比例的大蒜油树脂、姜黄油树脂、辣椒油树脂、迷迭香提取物和野生牛至精油]，4)3％wt/wtoa掺混物[1∶1比例的乳酸，丙酸，甲酸和苯甲酸]，5)2％wt/wtmcfa掺混物[1∶1比例的己酸、辛酸和癸酸]和6)1％硫酸氢钠(俄亥俄州沃尔布里奇的jones-hamilton公司)。4个基质包括：1)羽毛粉，2)禽血粉，3)猪肉和骨粉，和4)家禽副产品粉。基质先前没有用其他化学品处理。将1千克(kg)各饲料基质放入实验室规模的带式混合器中，其中液体化学物质被雾化成饲料，并将干粉处理直接混合到混合器中。接种物制备。总共100μl的肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌(salmonellaentericasubsp.entericaserovartyphimurium)(atcc14028)置于10ml胰蛋白酶大豆肉汤(tsb；difco，新泽西州富兰克林湖区的bd公司(beston，dickinsonandcompany))中，并在35℃下生长24小时。然后将培养物以5000×g离心。接下来，除去7mltsb上清液。然后将剩余的3ml上清液涡旋以从管侧除去细胞，然后用于接种。饲料成分接种。称量总共120克的各经化学处理的基质，并将其放入塑料容器中共24个容器进行接种。然后使用泵喷嘴将细胞分散在各基质上。首先使用乙醇清洗泵喷嘴，然后使用tsb冲洗泵。在清洁步骤之后，将喷嘴放入3ml的鼠伤寒沙门氏菌细胞中，然后将其施用于饲料处理。一旦添加接种物，将每个容器摇动以在整个基质中的接种物中混合。然后将每个接种的基质在贯穿42天的实验中在室温下储存于容器中。在每个分析日，容器在罩内打开以防止外部污染。微生物分析。在每个分析日，从每个容器中取出三个样品。将每个样品总共11g放入99mlbpw中并混合。然后将样品稀释至103、102和101，并铺板在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂(xld，difco，新泽西州富兰克林湖区的bd公司)上，采用低于100cfu/g饲料基质的检测限。在第0、1、3、7、14、21和42天重复操作，以评估随时间的化学效应。统计学分析。在用化学处理和饲料基质的固定效应与重复测量天数进行对数转换后，使用sas版本9.3(北卡罗来纳州卡里的sas统计公司(sasinst.inc.))的glimmix程序分析数据。每个采样日，每个化学处理×饲料基质组合重复3次。差异在p＜0.05时被认为有统计学意义。结果所有主要影响和相互作用均高度显著(p＜0.001)。总体而言，与对照相比，mcfa，商业甲醛产品，oa和eo处理各自具有较低浓度的鼠伤寒沙门氏菌(p＜0.05)。mcfa处理和商业甲醛产品在防止鼠伤寒沙门氏菌(分别为0.51和0.65cfu/g，表9)的交叉污染方面最成功，其比oa处理(1.20cfu/g)或eo处理更成功(2.10cfu/g)。硫酸氢钠处理与对照相似(p＝0.14；2.38对比2.56cfu/g)。表9.化学处理的沙门氏菌接种的饲料基质的化学手段的处理主要效果。ab没有相同上标字母的列中的值具有显著差异(p≤0.05)。1四饲料基质用6种不同化学处理处理并用肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌接种并涂板于xld上42天。2值由log10集落形成单位/克表示。在评估饲料基质的主要效果时也观察到差异(表10)。1.36cfu/g).禽血粉与猪肉和骨粉之间的值相似(p＝0.36；分别为1.73，1.82cfu/g)，但在防止鼠伤寒沙门氏菌的交叉污染方面不如羽毛粉或家禽副产品粉成功(p＜0.05；1.36对比1.36cfu/g)。表10.化学处理的沙门氏菌接种的饲料基质的饲料基质装置的处理主要效果。ab没有相同上标字母的列中的值具有显著差异(p≤0.05)。1四饲料基质用6种不同化学处理处理并用肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌接种并涂板于xld上42天。2值由log10集落形成单位/克表示。时间也对鼠伤寒沙门氏菌的降解起到重要作用。在42天的实验上，检测到的鼠伤寒沙门氏菌数量呈线性减少(p＜0.05；对于第0、1、3、7、14、21、和42天分别是4.50、2.65、1.75、0.95、0.49、0.50、和0.13cfu/g；表11)。除了第14和21天(p＝0.93)，每天检测到的鼠伤寒沙门氏菌的数量彼此不同(p＜0.05)。表11.化学处理的沙门氏菌接种的饲料基质的处理主要效果。ab没有相同上标字母的列中的值具有显著差异(p≤0.05)。1四饲料基质用6种不同化学处理处理并用肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌接种并涂板于xld上42天。2值由log10集落形成单位/克表示。mcfa混合物是禽血粉和羽毛粉中最有效的化学处理，其次是市售甲醛处理。市售甲醛处理是家禽副产品粉和肉骨粉中最成功的缓和剂，其次是mcfa和oa处理(p＜0.05；表12)。表12.化学处理的沙门氏菌接种饲料基质的化学品×饲料基质相互作用ab没有相同上标字母的列中的值具有显著差异(p≤0.05)。1四饲料基质用6种不同化学处理处理并用肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌接种并涂板于xld上42天。2值由log10集落形成单位/克表示。在随时间评估功效时，mcfa和市售甲醛处理在整个实验期间(p＜0.05；表13)，特别是在处理和接种后不久的几天内，最有效缓和了鼠伤寒沙门氏菌。oa处理在实验期间也有效缓和鼠伤寒沙门氏菌，但效果需要比mcfa或市售甲醛处理更多的时间(p＜0.05)。在42天的实验期间，eo和sbs处理类似于未处理的对照。表13.化学处理的沙门氏菌接种饲料基质的化学品×时间相互作用ab没有相同上标字母的列中的值具有显著差异(p≤0.05)。1und，未检测到(平均小于100cfu/g的计数具有如此报告的log)。2四饲料基质用6种不同化学处理处理并用肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌接种并涂板于xld上42天。3值由log10集落形成单位/克表示。饲料基质在42天的分析期间对鼠伤寒沙门氏菌浓度有显着影响。在接种后第0和1天，羽毛粉的鼠伤寒沙门氏菌浓度比其他饲料基质低(p＜0.05)。然而，接种后3-42天，家禽副产品粉的鼠伤寒沙门氏菌浓度比其他基质低(p＜0.05)(表14)。有趣的是，我们观察到，在42天的实验期结束时，血粉和肉骨粉仍然具有残留水平的鼠伤寒沙门氏菌，而血粉和羽毛粉基质随着时间的推移自动缓和。表14.化学处理的沙门氏菌接种饲料基质的饲料基质×时间相互作用。ab没有相同上标字母的列中的值具有显著差异(p≤0.05)。1und，未检测到(平均小于100cfu/g的计数具有如此报告的log)。2四饲料基质用6种不同化学处理处理并用肠沙门氏菌亚种鼠伤寒沙门氏菌接种并涂板于xld上42天。3值由log10集落形成单位/克表示。讨论该实验的目的是评估化学处理的类别是否可以防止处理后的鼠伤寒沙门氏菌污染，这是通过xld涂板存在的鼠伤寒沙门氏菌集落的浓度的定量来确定的。令人惊奇的是，mcfa混合物与市售甲醛产品(t8)表现相似。时间，mcfa，市售甲醛产品，oa和eo都减少了饲料成分中鼠伤寒沙门氏菌的存在，但是这些结果基于饲料成分而不同。禽血粉中鼠伤寒沙门氏菌浓度在42天内相对稳定，而其他三种饲料成分则为21天。mcfa和甲醛处理在防止处理后提供的蛋白质粉污染时最有效。实施例5在第五项研究中，硫酸氢钠溶液(sbs)以0％、0.2％和0.4％的水平施用于干型狗食品(粗粮)的表面，基于食物总重量％。基于食物总重量的百分比，sbs也以0％、0.6％和0.8％的水平施用于干型猫食品的表面。在第0、1、2、7和14天测试样品，并且基于集落形成单位/克(cfu/g)计算沙门氏菌水平。结果如下表15和16所示。表15.用2种不同水平的硫酸氢钠涂覆狗食品导致沙门氏菌随时间减少。表16.用2种不同水平的硫酸氢钠涂覆猫食品导致沙门氏菌随时间减少。实施例6背景：在第六项研究中，开发了一个模型来评估pedv-污染的猪饲料成分的跨界风险，并进行实验以评估在中国到美国的模拟运输事件期间两种缓和策略的效果。该研究是基于这样一个假设：虽然选择未处理的成分可以对pedv存活提供保护作用，但缓和会降低风险。样本规模该研究中使用总共360个饲料成分样品。方法：运输模型设计路线和时间表根据中国东部地区，即山东，吉林，河南，河北，辽宁省(www.alibaba.com)出口农产品饲料成分的设施优势，最初在美国检测到的pedv菌株非常类似于安徽省的一个变种，北京被指定为该模型的起点。这里假定选择成分的pedv污染将发生在制造工厂或加工后。为了确定pedv是否可以从北京运往美国主要猪肉生产地区，爱荷华州得梅因被选为最终目的地。根据这些假设，商业网站(searates.com)用于制定代表性的路线和时间表。具体来说，它被模拟为受污染的成分将从北京运往上海的锚定码头1天，在那里他们将存放7天准备运往美国。货物将在17天的时间内穿越太平洋并在旧金山港进入美国。经过7天的时间清关，然后通过80号州际公路运送两天到得梅因，在那里将停留3天，总共运输期限37天。环境数据汇编一旦37天的时间表成立，决定对2012年12月23日至2013年1月28日期间的运输事件进行建模。该决定是根据美国pedv初步检测的时间(2013年4月)以及汇总2012年12月31日至2011年1月16日期间从亚洲到美国的集装箱的温度和相对湿度(％rh)的数据的可用性。使用该信息，温度和％rh曲线针对该研究的海洋部分而设计。此外，访问了使用weatherunderground(www.wunderground.com)的模型的陆地部分的历史气象数据，其中包括2012年12月23日至30日，2013年1月17日至27日期间，与海洋运输期相匹配。为了模拟日常波动的影响，历史温度数据在每天4个指定时间(6am，12pm，6pm，12am)和每天3个指定时间(针对％rh)(8am，12pm，4pm)收集。然后将所有数据输入到在模型运输期间用于容纳样品的环境室的计算机。饲料成分的加工本次研究选择了一批已知从中国进口到美国的14种猪饲料成分，包括有机和常规大豆和大豆粉，赖氨酸盐酸盐，d-l甲硫氨酸，色氨酸，维生素a、d和e，氯化胆碱，双成分运载体(稻壳或玉米芯)和饲料级四环素。通过pcr筛选成分，以在研究开始之前确保pedv阴性状态。针对该研究选择的处理包括液体抗菌剂(la)(美国爱荷华州得梅因的建明工业公司(keminindustries))或中链脂肪酸掺混物(mcfa)。是37％甲醛水溶液的预混物(用于维持完全动物饲料或饲料成分沙门氏菌阴性持续长达21天)和丙酸(作为用于控制饲料或饲料成分中霉菌的化学防腐剂)。尽管可在21天内提供有效的沙门氏菌控制，但未经美国食品和药物管理局或美国农业部批准用于处理pedv。第二次处理，mcfa是2％定制的中链脂肪酸掺混物，以1∶1的比例混合了己酸、辛酸和癸酸。对照成分用无菌盐水处理。样品管理决定将所有样品分入4批相同的批次之一，分别代表37天运送期间的特定段。批次1(第1段)旨在代表污染的成分从北京制造厂运输至上海安装终端(第1天后污染物(dpc))。批次2是第1和第2段的汇编，模拟制造和运送到上海，以及安装终端等待装运(1-8dpc)的时间。批次3是在中国、穿过太平洋和在加利福尼亚州旧金山终端(1-27dpc)到达美国的时间的第1、2和3段的汇编。最后，批次4是第1-4段的汇编，从而代表了整个过程，包括运输到和存储在爱荷华州得梅因(1-37dpc)。在污染后的指定日子，将一批样品从环境室中取出并提交测试。具体来说，批次1在1dpc，批次2在8dpc，批次3在27dpc和批次4在37dpc。换而言之，相同的样品没有被重复打开和测试，而是在指定的日期提交了一批新的样品。这种样品管理方法将确保所有样品容器从接种到在实验室进行测试的时间上保持密封，最小化交叉污染的风险，并提高结果的重复性，因为多个段在批次间重复。最后，为了提高统计学检力，4批次中每批含有对照组中2个重复的各成分，各处理组中2个重复的各成分，各批次总共90个样品。样品污染过程研究的目标是将变异性限制至成分水平；因此，使用相同量的成分，相同的容器类型和相同的环境设置，并且样品被等同地污染。为了开始这个过程，将30g每种成分加入到食品储存容器(oxototbabyblocks，oxo国际公司，美国德克萨斯州的埃尔帕索(elpaso，tx，usa))中以模拟运输容器。未处理对照组中的成分用0.1ml无菌盐水处理。基于3kg/吨完全饲料的包含率，将la组中的成分用0.1ml产品处理。基于2％包含率，用0.6g产品处理mcfa组中的成分。使用单独的结核菌素注射器将单独的处理和盐水安慰剂加入到指定的样品中。为了促进适当的混合，使用每个成分的单独的木制施料棒，手动搅拌饲料10次顺时针旋转和10次逆时针旋转。混合后，每个单独的容器被手动剧烈摇晃(在10秒钟内50次)。然后将所有样品用2mlpedv(第18代，ct＝17.15，总剂量491,520ffu)接种并如上所述混合。根据来自pedv污染饲料的实际田间病例的数据，选择这一数量的pedv，以在混合后提供约25(范围＝19-30)的饲料成分中的最终平均ct值，已发表的研究中的挑战水平。对照出于阴性对照的目的，用无菌盐水接种30gpedv阴性完全饲料样品。在对照组和治疗组中，4批次中均包含重复的阴性对照。出于阳性对照的目的，在对照组和治疗组中的每批成分中的容器中包含在最小必需培养基(difco，美国密歇根州底特律)中的重复5ml样品的储备pedv。样品储存一旦准备好，将样品储存在环境室中。该仪器(型号9005l，sheldon制造公司，俄勒冈州科尼利厄斯)具有4-21℃的可编程温度范围和40-95％的rh范围。为了使成分暴露在室内的环境空气中，在每个塑料容器中钻出两个直径为0.318cm的孔。使用来自上述历史温度和％rh曲线的数据，如前所述，腔室计算机被编程为模拟随时间的波动。诊断过程所有诊断测试使用由南达科他州立大学(sdsu)动物疾病研究和诊断实验室(adrdl)开发和验证的方案进行。样品通过代码提交给实验室，因此人员对日期、处理和成分类型不知情。最初计划通过pcr和病毒分离(vi)测试所有样品，然后针对确定为pcr阳性但vi阴性的样品使用猪生物测定法。rna提取所述magmaxtm96病毒分离试剂盒(生命技术公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)被用于从样品中获得病毒rna，如在提供的说明书(1836m版本f)中所述。使用175μl体积的样品进行提取。磁珠提取在kingfisher96仪器(热科学公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)上完成。实时pcr本研究按照试剂盒说明书(tetracore，美国马里兰州罗克维尔)，使用市售的实时单管rt-pcr多重检测法检测pedv、猪德尔塔冠状病毒(pdcov)和传染性胃肠炎病毒(tgev)。简言之，将7μl提取的rna加入到18μl的主混合物中。一步实时rt-pcr扩增条件从48℃下15分钟开始，然后在95℃下2分钟。最后的循环由95℃下5秒和60℃下40秒(数据收集步骤)组成。该程序运行38个循环(循环时间)，pedv阳性结果显示≤38个循环。每次运行都包括阳性和阴性对照。所有放大在abi7500仪器(美国德克萨斯州奥斯汀)上完成。pedv储备病毒增殖对于pedv繁殖，将vero76细胞(atcccrl-1587)保持在mem加10％胎牛血清和抗生素中。在150cm2烧瓶中vero76细胞的三天龄汇合单层在接种之前用无血清最低必需培养基(mem)洗涤3次。在含有2ug/mltpck处理的胰蛋白酶的mem中，在约0.1moi的pedv下感染单层，在37℃下孵育约48小时，直到出现明显cpe。烧瓶在-80℃冷冻至需要时。病毒分离一旦通过pcr对饲料成分样品进行pedv测试，则测试残留样品的活病毒存在。将样品在含有2μg/mltpck处理的胰蛋白酶的mem中以1∶2的起始稀释，并连续两倍稀释。然后将稀释的样品加入到96孔板中洗涤的vero-76细胞的汇合单层中，并在37℃下孵育1小时。再次洗涤板，置换胰蛋白酶介质。在37℃下24小时后，用80％丙酮固定板，用fitc偶联的mabsd6-29染色，以使感染的细胞可视化。通过使用适用于pedv的先前发布的方法，以选定稀释度的孔中存在的荧光病灶数目计算ffu/ml来确定病毒浓度。阅读板的人员对样品类型和采样时间不知情。猪生物测定设备和动物来源猪生物测定的目的是确定在pcr上检测为阳性但在vi上阴性的任何饲料成分样品中是否存在活性pedv。这项研究是在南达科他州立大学动物资源部(arw)的生物安全级别2+室进行的。整个研究过程中涉及动物的所有过程都是在sdsu机构动物护理和使用委员会的指导和批准下进行的。动物(n＝24，5日龄仔猪)来自pedv初始群体，并通过在到达arw时从每头猪血液取样和直肠拭子收集进行测试。在动物到达之前，通过pcr监测所有房间(墙壁，天花板，地板和下水道)是否存在pedv。将仔猪饲养在6个不锈钢生物体单元之一，其尺寸为0.6mw×1.2ml×0.6mh。单元分成4个半隔离的住房单元，每单元饲养4头仔猪，安排单独喂养。地板由开放的编织橡胶垫组成，其在穿孔不锈钢格栅上上升10厘米，用于废物收集。每个单元都覆盖着一个充气的20密耳塑料盖子，并配有2对干燥箱手套，用于在顶盖内部进行喂养和程序。每个顶盖用带子和棘轮带固定并密封到单元上。通风由电风扇提供，保持顶盖内的足够的正压，以保持顶盖罩在单元上方。进入和排出每个单元的空气经hepa过滤。每个单元最初使用47％雾化福尔马林灭菌，并在引入动物之前使其消散2周。在研究期间所需的所有进入和传出的材料(例如，拭子，可注射药物，出血用品)通过气密的不锈钢端口，并在进入或离开口之前使用5％过乙酸灭菌。生物测定接种物的制备不锈钢单元作为实验单元；因此，每个单元中的所有4头仔猪都接受相同的成分。为了评估整个模型期间的pedv存活率，计划测试来自批次4的样品，包括处理和未处理的成分。关于未处理的样品，测试了批次4中的所有pcr阳性和vi阴性样品。关于la处理和mcfa处理的成分，计划再次从批次4样品中测试vi处理或猪生物测定阳性的未处理样品的处理当量。为了制备接种物，将60g各特定成分与50ml无菌pbs在250ml离心管中混合，倒置10次以混合并涡旋2分钟。然后将悬浮液在5200g下离心15分钟，将上清液倾倒并在仔猪接种之前通过pcr测试。单元中的每头猪通过注射器口服接受1ml的指定接种物并观察7天。为了最小化研究所需的动物数量，在7dpi后确认为阴性的猪将接种不同的成分。设计中包括阴性对照单元，这些猪接受无菌盐水po。仔猪测试接种后，监测各组仔猪的pedv状态。每天，从阴性对照单元开始，arw人员从每头猪身上检查动物的ped临床征象并收集直肠拭子(dacron拭子，飞世尔科技公司(fisherscientific)，美国新泽西州富兰克林湖)。进入房间后沐浴，并穿着特殊工作服、鞋、发罩、手套和p95面具(3m公司，美国明尼苏达州圣保罗)。此外，每个房间都是单独通风的，每个房间都有进入和离开空气的hepa过滤。如果观察到临床受影响的动物，则与每日直肠拭子一起收集腹泻和/或呕吐拭子。将拭子提交给sdsuadrdl并通过pcr进行测试。如果在特定单元中诊断到pedv，则将所有动物用拭子拭抹，用静脉注射戊巴比妥钠人工安乐死，小肠肠道进行pcr检测，单元按照所述进行清洁和消毒，根据需要重新放养新的仔猪。数据分析描述统计学、t-检验和anova用于分析数据。结果pcr所有饲料成分样品在本研究的第0天为pcr阴性。证实了成功的pedv接种，因为所有的第1天样品都是pcr阳性的。在1和37dpc上处理和未处理的成分的pcr测试结果总结在下表17中。在1dpc上la处理的样品的平均ct为24.5(sd＝2.4)，在37dpc上为32.5(sd＝3.9)(p＜0.0001)。mcfa处理的样品的平均ct在1dpc上为24.2(sd＝4.2)，在37dpc上为25.5(sd＝3.7)(p＝0.25)。在第1天，未处理的成分的平均ct值在第37天为22.9(sd＝2.4)和23.1(sd＝3.5)(p＝0.34)。在1dpc，所有3组(未处理，la处理和mcfa处理)的平均ct值没有显着差异(p＝0.14)；然而，在37dpc，la处理样品的平均ct显着高于mcfa-处理和未处理样品的平均ct(p＜0.0001)。表17：在研究的第1和37天处理的和未处理的组间的pcrct数据(平均/sd)的汇总。组第1天平均/sd第37天平均/sd对照成分22.9a/2.423.1a/3.5la-处理的成分24.5a/2.432.5b/3.9mcfa-处理的成分24.2a/4.225.5a/3.7具有不同上标(a/b)的值在p＜0.05处显著不同病毒分离vi数据的汇总在下表18中提供。所有4批未处理样品的常规sbm、赖氨酸和维生素d都中回收活性pedv，其中批次3代表在旧金山终端进入美国，批次4代表在德梅因的运输和存储。由于批次4中未经处理的有机大豆粉样品中的霉菌生长，vi是不可能的。没有其他样品存在超过批次2(北京和上海段)的活性病毒，包括pedv储存病毒对照。多个样品在1dpc上为vi阴性。所有阴性对照样品和所有la处理或mcfa处理的成分在所有批次中均为vi阴性。表18：所有4批未处理的成分间平均pcrct和ffu/ml的汇总。成分：2个30g重复/成分。平均ct/ffu效价：2个样品/成分间的平均ct值和ffu/ml。猪生物测定选择用于猪生物测定测试的样品由来自批次4的处理和未处理的成分组成。测试的未处理成分包括pcr阳性和vi阴性的成分，特别是维生素a和e，色氨酸，d-l甲硫氨酸，大豆(有机和常规)，氯化胆碱。在给予未处理的有机大豆粉和氯化胆碱样品的仔猪中检测到活性pedv(表19a)。受影响的动物显示轻度腹泻的证据，粪便中显示pedv，尸检小肠样品为pcr阳性。对于经处理的成分，测试la处理和mcfa处理的大豆粉(常规和有机)，赖氨酸，维生素d和氯化胆碱的样品。接种上述la处理或mcfa处理的成分的所有仔猪被确定为非传染性的，因为仔猪在整个测试期间保持临床正常，并且所有直肠拭子和小肠样品均通过pcr为阴性(表19b)。表19a：来自通过猪生物测定的批次4的pcr(+)/vi(-)未处理的对照饲料成分的结果的汇总。表19b：来自通过猪生物测定的批次4的pcr(+)/vi(-)la-处理或mcfa-处理的对照饲料成分的结果的汇总。＊基于在其未处理的等同样品中回收活性pedv选择成分。环境数据表20提供了整个37天研究期间在环境室中记录的平均日温度和％rh数据的汇总。为了进行统计分析，37天期间分为4个阶段：第1-8天，代表在中国的时间，第9-25天，代表跨越太平洋的时间，第26-32天，代表在旧金山终点度过的时间和第33-37天，在加州到爱荷华州的运输度过的时间和在得梅因的时间。总而言之，旧金山段期间记录的平均温度和平均％rh与在其他3段期间记录的显着不同(分别为p＝0.0004和p＝0.0025)。表20：37-天研究期间的4段中每个的温度和％rh数据的描述性汇总。讨论虽然la在研究过程中对pedvrna降解的影响与对mcfa的反应有显着差异，但两种产品似乎对病毒活力具有相等的效果。该结果支持化学缓和的有效性，作为减少饲料成分中pedv风险的手段，并提供治疗选项。当前第1页12