本发明涉及一种增加骨密度保健软胶囊及其制备工艺。
背景技术：
骨密度是指骨组织结合的紧密程度，通常指骨矿物含量，反映骨质疏松程度。骨质疏松症是因为骨密度下降，以骨量减少、骨质微观结构退化为特征致使骨脆性增加、驼背、变矮等，其严重并发症为骨质疏松性骨折(脆性骨折)。骨质疏松的发病机理主要是成熟后的骨骼仍处于破骨和成骨之中，以使骨骼不断地得到更新，这种过程即为骨再建。若破骨速度大于成骨速度，骨量就会减少，因而发生骨质疏松，其中破骨细胞具有重要作用。
引起中老年人骨质疏松的因素是十分复杂的，近年来研究认为与下列因素有很大的关系：①雄性激素和雌性激素分泌减少是导致骨质疏松的重要原因，尤其是妇女绝经后雌激素水平下降，使骨吸收增加骨形成减少。②随年龄的增长骨代谢紊乱使骨质中的钙溶出增加吸收减少，致使钙的运转平衡受到破坏，钙的流失加快。③老年人由于消化功能降低，进食少，造成营养缺乏，致使蛋白质、钙、磷、维生素及微量元素摄入不足。④随着年龄的增长，老年人体力的下降，室外运动就会相应减少也是老年人易患骨质疏松症的重要原因。⑤遗传：人体骨量峰值的高低与遗传有密切的关系，骨量峰值的80％是由遗传因素所决定。
随着人们生活水平的提高，加快了社会老龄化进程及人口寿命的增长。2010年全国第六次人口普查显示，我国60岁及以上人口占总人口的13.26％，其中65岁及以上人口占总人口8.87％，并且老年人每年以3.2％的速度增加。《中国老龄事业发展报告(2013)》指出，截至2012年底，我国老年人口数量达到1.94亿，比2011年增加891万，其中80岁及以上高龄老年人口达2273万人；2013年达到2.02亿，老龄化水平将达到14.8％。到2025年，老年人口总数将超过3亿，2033年超过4亿，平均每年增加1000万老年人口。因老年人口的逐年增加，所引起的慢性疾病如骨质疏松等问题亦愈来愈严重。
随着当代疾病谱的改变，世界卫生组织把骨质疏松症列为中老年三大疾病之一，在常见病中居第7位，严重影响了老年人的健康和生活质量。有报导在女性患者中乳腺癌、中风和发作心脏病三种疾病发生率加起来还不如骨质疏松性骨折的患者人数多；50岁以后，发生骨质疏松的女性在未来10年内出现髋部、脊柱、前臂或肱骨近端骨折的可能性高达45％，大于65岁老人在无意识跌倒时，有87％会造成骨质疏松性骨折。据统汁，我国60～69岁的老年女性的骨质疏松症发生率高达50％～70％，老年男性为30％。同样，我国骨质疏松性骨折的医疗费用也不容小视，北京每年仅50岁以上新发骨松性骨折病人数超过1.7万，每年因骨质疏松骨折增加医疗费用超过5.1亿。骨质疏松在其他国家同样也渐渐成为很大负担。WHO((骨质疏松症的预防与管理指南》中指出，仅欧洲、美国及日本就有7500万人有骨量减低，而每年在欧洲及北美因骨质疏松症骨折的人口达230百万。在英国>45岁的妇女中，与冠心病、糖尿病、COPD、肺癌等慢性病相比，骨折所致的平均院内卧床天数明显增高。几乎三分之一的股骨骨折患者需接受多年的家庭护理，而每5个股骨骨折的病人中就有1位在骨折发生后生活时间不到1年。有资料表明，每年用于骨质疏松性骨折的医疗费用，美国是200亿美元，欧盟是300亿美元。
由于目前各种治疗手段对于已经疏松的骨质尚不能完全恢复，且骨质疏松导致的骨折，尤其是髋部骨折能够给个人、家庭、社会造成巨大的负担，所以早期诊断、早期预防骨质疏松症显得十分重要，对患者、家庭和社会大有裨益。
目前，我国居民主要通过增强锻炼、加强饮食营养等方法来预防骨质疏松，但由于机体原因，均不能达到理想效果。有鉴于此，发明一种安全无副作用的可明显增加骨密度的保健食品势在必行。
目前现有技术如下：
(1)专利号CN102630946A公开了一种适用于女性的珍珠大豆钙软胶囊，软胶囊包括胶皮及封入胶皮中的内容物，构成胶皮组分为：明胶、增塑剂、水、色素，构成内容物组分为：大豆提取物、碳酸钙、珍珠粉、助悬剂、植物油。此发明通过补充异黄酮和钙，达到增加骨密度的功能。该发明仅能抑制钙流失，但钙吸收率不高，达不到理想增加骨密度效果。
(2)专利号CN 103083648A公开了一种以乳矿物盐为原料的增加骨密度的片剂，是由乳矿物盐、维生素D3、酪蛋白磷酸肽、全脂奶粉、甘露糖醇、羧甲基纤维素钠和硬脂酸镁制成。该发明具有乳矿物盐、维生素D3、酪蛋白磷酸肽和全脂奶粉的各种功效，可增加服用者的骨密度，口感较好，服用量较小且无依赖性。但该发明仅通过补充钙和促进钙吸收的物质增加骨密度，并不能解决钙流失及提高骨钙利用率问题。
(3)专利号CN101856128A公开了一种增加骨密度的保健食品及其制备方法，所述保健食品组成为：骨胶原、碳酸钙、D-氨基葡萄糖硫酸钾盐、维生素D3、淀粉、硬脂酸镁。该发明通过直接补充钙、促进钙吸收、抑制过高骨转换，实现增加骨密度的保健功能。但该发明同样存在不能解决钙流失及提高骨钙利用率问题。
技术实现要素：
本发明通过将碳酸钙、维生素D3、大豆提取物进行合理配伍，再添加适宜辅料，研制开发出一种安全性高的具有增加骨密度功能的保健软胶囊并提供其制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种增加骨密度保健软胶囊，其特征在于每1000粒内容物组分和用量如下：碳酸钙300～500g、维生素D30.075～0.25g、大豆提取物100～150g、大豆油320～550g、蜂蜡10～35g、大豆磷脂5～35g；
每1000粒胶皮组分和用量如下：明胶360～500g、甘油160～225g、纯化水360～500g、二氧化钛3～10g、焦糖色5～15g、辣椒红8～20g。
如上所述的一种增加骨密度保健软胶囊，其特征在于所述的维生素D3为油状液体，规格为100万IU/g。
如上所述的一种增加骨密度保健软胶囊，其特征在于所述的大豆提取物中大豆异黄酮(以大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素计)含量≥20％。
如上所述的一种增加骨密度保健软胶囊，其特征在于碳酸钙和大豆提取物均为固体粉末，维生素D3为油状液体，制成软胶囊剂型，选用大豆油作为基质。
一种增加骨密度保健软胶囊的制备方法，其特征在于经过下列工艺步骤制备而成：
(1)制胶：按权利要求1中配比关系，先将甘油、纯化水投入化胶罐，加热至60℃以上，投入明胶，并继续加热到65～75℃，溶胶，直至明胶全部溶解；再将二氧化钛、焦糖色、辣椒红加入纯化水，搅拌后经胶体磨分散均匀，80～120目过滤后投入化胶罐，开启真空泵抽真空，使真空度达到-0.06Mpa以上，得胶液混合物料；胶液混合物料再抽真空，保持真空度为-0.07～-0.08Mpa，抽真空至胶液黏度为1.5～3.0万mpa.s，将胶液过80～120目滤袋；过滤后胶液在50～60℃保温，静置，备用；
(2)制内容物：按权利要求1中配比关系，先将维生素D3与适量大豆油置于不锈钢桶中搅拌均匀，再加入少量大豆油搅拌5分钟左右至混合均匀，得维生素D3混合油，备用；将剩余大豆油与蜂蜡置于配料罐中，加热55～75℃，使蜂蜡完全溶解于大豆油中，搅拌混合均匀，然后降至室温，得油蜡混合物；将维生素D3混合油、大豆磷脂依次加入到油蜡混合物中，搅拌混合均匀，再加入大豆提取物和碳酸钙，搅拌混合均匀，得总混合物料；将总混合物料投入均质机中均质乳化，分散均匀，过80～120目滤袋，得软胶囊内容物，备用；
(3)压丸、定型、干燥：将内容物、胶液在软胶囊成型机中压成软胶囊，保持转速为2.0～4.0转/分钟，喷体温度保持37～45℃，胶皮厚度为0.60～0.85mm；压好的软胶囊定型2.5～5小时，通风干燥，至囊皮水分为5.0％～11.0％；
(4)灯检：将干燥后的软胶囊在灯检台上进行灯检，拣去异形丸、气泡丸、大小丸、漏油丸等不合格的软胶囊。
如上所述的一种增加骨密度保健软胶囊的制备方法，其特征在于在经过灯检步骤后，还要经过以下步骤：
(5)内包装：取灯检合格后的软胶囊，进行装瓶；
(6)外包装：按要求进行产品外包装，并进行质量检验，得成品；
(7)入库：成品置于阴凉干燥的仓库保存。
如上所述的一种增加骨密度保健软胶囊的制备方法，其特征在于在制胶步骤中，溶胶时间为40～60分钟，胶液混合物料抽真空时间为10～20分钟，过滤后胶液保温时间为2小时以上。
如上所述的一种增加骨密度保健软胶囊的制备方法，其特征在于所述软胶囊工艺从称量、制胶、制内容物、压丸、定型、干燥、灯检直至内包装步骤均在10万级的洁净区内完成。
本发明所用原料均为常规原料，其使用依据、质量标准和用量均符合国家相关规定，市场可购。
本发明中碳酸钙和大豆提取物均为固体粉末，维生素D3为油状液体，制成软胶囊剂型，选用大豆油作为基质。为了使碳酸钙和大豆异黄酮分散均匀，且和油相不出现分层现象，内容物中添加了大豆磷脂和蜂蜡。大豆磷脂是优良的乳化剂，有利于固油两相混合均匀，能增加混合内容物的流动性。本发明使用大豆磷脂作为乳化剂和助流剂。为了防止物料发生沉降分层，有必要加入混悬稳定剂，使内容物更加稳定，本发明选用了生产中常用的蜂蜡作为混悬稳定剂。
本发明中软胶囊胶皮中添加遮光剂二氧化钛和色素焦糖色、辣椒红，可防止维生素D3遇光分解变质，保证内容物中有效成分稳定。
本发明的有益效果是：
本发明通过将碳酸钙、维生素D3、大豆提取物进行合理配伍，再添加适宜辅料，研制开发出一种安全性高的具有增加骨密度功能的保健软胶囊。且增加骨密度功能主要通过直接补充人体所需钙质，促进钙吸收，延迟钙流失来实现，从而提高骨钙吸收率和利用率，具有明显的增加骨密度效果。
本发明针对易骨质疏松的中老年人群，每日服用1次，每次2粒。本发明选用骨矿化物碳酸钙、促进钙吸收的维生素D3和植物雌激素大豆提取物为主要原料，通过补钙、促进钙吸收、延迟钙流失的途径来达到增加骨密度的目的。
所选取的碳酸钙为优质钙源，碳酸钙含钙量高(40％)，在强化食品中的使用量少，副作用小，价格便宜，吸收率高，因此使用最为广泛。钙是构成人体骨骼的基本元素，与磷构成羟磷灰石结晶沉着于胶原组成的基础上，可维持骨骼的坚固性，可促进骨骼的新陈代谢，促进骨骼的钙化和新骨的形成。当人体缺乏钙元素时，构成骨的原材料减少，导致骨代谢的骨形成-骨溶解平衡向负方向移动；此外，钙浓度下降会增加整体水平上的骨吸收，使钙由骨组织中游离出来进入血液，导致单位体积的骨量减少，引起骨质疏松。多项研究资料显示，由于膳食结构、饮食习惯等原因，我国居民膳食中钙摄入普遍存在不足，膳食中的钙并不能完全满足机体需要，补充适量的钙对预防骨质疏松症有着积极的作用。
所选取的维生素D3在骨形成和骨吸收偶联机制中发挥着重要作用。维生素D促进肠钙吸收，提高血钙浓度，促进骨骼矿化，经过成骨细胞促进骨形成，抑制成骨细胞凋亡，促进破骨细胞的该前体细胞向成熟破骨细胞分化，促进骨吸收。维生素D对维持骨骼健康至关重要，但由于现代人户外活动少，接触阳光随之减少，易导致体内维生素D不足。在我国人群中维生素D缺乏极为普遍，补充维生素D预防骨质疏松及其骨折也极其重要。
所选取的大豆提取物中含有的大豆异黄酮，被认为是雌激素的天然替代品，也被称为植物雌激素。骨质疏松症是一种隐匿进展的全身性骨骼疾病。现代医学认为，其发生与激素调控、营养状态、遗传基因、物理因素、免疫功能、生活习惯等密切相关。绝经后由于体内的雌激素水平随着卵巢功能的下降而逐步下降，成骨细胞代谢减弱，骨代谢平衡失调，大量骨钙丢失，从而诱发骨质疏松症。有研究报道，外源性雌激素可以抑制骨吸收，阻止骨钙丢失。大豆异黄酮有类似雌激素的作用，阻止雌二醇DNA的激活和蛋白质结合，避免骨质疏松的发生。
本发明以骨质疏松发生机理和现代药理学研究为基础，选用碳酸钙、维生素D3、大豆提取物进行合理配伍。其中钙是构成人体骨骼的基本元素，可促进骨骼的新陈代谢，促进骨骼的钙化和新骨的形成。维生素D促进钙吸收，促进骨骼矿化，经过成骨细胞促进骨形成，抑制成骨细胞凋亡。大豆异黄酮可防止骨头中的钙溶出到血液中，延迟骨质流失，同时还能促进骨合成细胞的作用和钙的沉积，促进骨质的合成。有研究表明钙加维生素D在改善骨密度、抑制骨吸收和骨转换方面优于单纯补钙组。且有动物试验证实大豆异黄酮与钙联合应用增加骨密度的效果强于单独使用。因此本发明配伍合理，三种原料联合应用，产生协同作用，共奏增加骨密度之功效。
本发明经安全性试验证明安全无毒，可长期服用。另外本发明采用软胶囊剂型，具有生物利用度高、密封性好、含量准确、外形美观等优点，也有利于保证功效成分的稳定性。同时本发明工艺合理可行，已应用于大生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例一：
软胶囊内容物组分用量：碳酸钙375kg、维生素D30.1kg、大豆提取物150kg、大豆油440kg、蜂蜡20kg、大豆磷脂15kg。
胶皮组分用量：明胶450kg、甘油202.5kg、纯化水432kg、二氧化钛6.75kg、焦糖色9kg、辣椒红11.25kg。
实施例二：
软胶囊内容物组分用量：碳酸钙450kg、维生素D30.2kg、大豆提取物120kg、大豆油485kg、蜂蜡25kg、大豆磷脂20kg。
胶皮组分用量：明胶450kg、甘油180kg、纯化水405kg、二氧化钛4.5kg、焦糖色12.6kg、辣椒红15.75kg。
实施例三：
软胶囊内容物组分用量：碳酸钙500kg、维生素D30.22kg、大豆提取物135kg、大豆油510kg、蜂蜡30kg、大豆磷脂25kg。
胶皮组分用量：明胶441kg、甘油202.5kg、纯化水414kg、二氧化钛9kg、焦糖色7.2kg、辣椒红9.9kg。
实施例四：
软胶囊内容物组分用量：碳酸钙335kg、维生素D30.09kg、大豆提取物145kg、大豆油380kg、蜂蜡22kg、大豆磷脂18kg。
胶皮组分用量：明胶495kg、甘油225kg、纯化水450kg、二氧化钛9.9kg、焦糖色11.25kg、辣椒红13.5kg。
上述实施实例均通过如下工艺制备而成：
(1)制胶：按上述配方用量，先将甘油、纯化水，投入化胶罐，加热至60℃以上，投入明胶，并继续加热到65～75℃，溶胶40～60分钟，直至明胶全部溶解；再将二氧化钛、焦糖色、辣椒红加入纯化水，搅拌后经胶体磨分散均匀，80～120目过滤后投入化胶罐，开启真空泵抽真空，使真空度达到0.06Mpa以上，得胶液混合物料；胶液混合物料再抽真空，保持真空度为-0.07～-0.08Mpa，抽真空10～20分钟至胶液黏度1.5～3.0万mpa.s，将胶液过80～120目滤袋；胶液在50～60℃保温，静置2小时以上，备用。
(2)制内容物：按上述配方用量，先将维生素D3与适量大豆油置于不锈钢桶中搅拌均匀，再加入少量大豆油搅拌5分钟左右至混合均匀均匀，得维生素D3混合油，备用；将剩余大豆油与蜂蜡置于配料罐中，加热55～75℃，使蜂蜡完全溶解于大豆油中，搅拌混合均匀，然后降至室温，得油蜡混合物；将维生素D3混合油、大豆磷脂依次加入到油蜡混合物中，搅拌混合均匀，再加入大豆提取物和碳酸钙，搅拌混合均匀，得总混合物料；将总混合物料投入均质机中均质乳化，分散均匀，过80～120目滤袋，得软胶囊内容物，备用；
(3)压丸、定型、干燥：将内容物、胶液在软胶囊成型机中压成软胶囊，保持转速为2.0～4.0转/分钟，喷体温度保持37～45℃，胶皮厚度为0.60～0.85mm；压好的软胶囊定型2.5～5小时，通风干燥，至囊皮水分为5.0％～11.0％；
(4)灯检：将干燥后的软胶囊在灯检台上检去异形丸、气泡丸、大小丸、漏油丸等不合格的软胶囊。
(5)内包装：取灯检合格后的软胶囊，进行装瓶。
(6)外包装：按要求进行产品外包装，并进行质量检验，得成品。
(7)入库：成品置于阴凉干燥的仓库保存。
下面为本发明安全性评价报告：
一、小鼠经口急性毒性(LD50)试验、微核试验、精子畸形试验报告
1、材料
1.1试验材料：样品为实施例一制得的软胶囊，内容物为棕黄色油状物，推荐服用方法为每天2g，以60kg成人体重计，该样品推荐量为0.03333g/kg.bw。
1.2剂量设计与配样方法：
1.2.1急性毒性试验：采用最大耐受剂量(MTD)法，设受试物剂量为20.0g/kg.bw，试验时称取样品20.0g用纯净水稀释至40.0ml供试。
1.2.2微核试验和精子畸形试验：受试物设10.0、5.00、2.50g/kg.bw三个剂量组，试验时称取样品2.50、5.00、10.0g分别用纯净水稀释至20.0ml供试。
1.2.3阴性对照组和阳性对照组：微核试验和精子畸形试验另设阴性对照组和阳性对照组。阴性对照组给予等量的纯净水，阳性对照组选用受试剂量为40mg/kg.bw的环磷酰胺，配制方法为称取40mg环磷酰胺用纯净水稀释至20.0ml供试。
1.3实验动物：广东省医学实验动物中心提供的NIH种SPF级健康小白鼠(动物生产许可证号：SCXK(粤)2008-0002，质量合格证编号：NO.0078133、0078315、0077251)，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2008-0011。
2、方法与结果：
2.1小鼠急性毒性试验
采用最大耐受量(MTD)法进行试验。选用体重18～22g的健康NIH种小白鼠20只，雌雄各半。依据该样品的最大可灌胃浓度、灌胃容量和安全系数，设受试物剂量为20.0g/kg.bw，禁食不禁水16小时后，灌胃2次，间隔4小时，每次灌胃量为0.2ml/10g.bw，观察一周，记录小鼠中毒表现及死亡情况，结果见表1。
表1软胶囊急性毒性试验结果
结果：
未观察到动物出现不良反应，获得雌雄小鼠LD50＞20.0g/kg.bw，相当于受试物日推荐量的600倍，根据急性毒性分级，因此判定受试物软胶囊属无毒级物质。
2.2小鼠骨髓微核试验：
采用30小时给受试物法进行试验。选择NIH种小鼠50只，体重25～30g，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。根据急性毒性试验结果，设受试物最高剂量为10.0g/kg.bw，该剂量以下设5.00、2.50g/kg.bw两个剂量，阴性对照组给予等剂量的纯净水，阳性对照组选用40mg/kg.bw环磷酰胺(CP)。灌胃量均为0.2ml/10g.bw，24小时后以同样的剂量进行第二次染毒，6小时后，处死小鼠取胸骨骨髓材料制片、染色、油镜下每只小鼠观察1000个嗜多染红细胞(PCE)，计数含有微核的嗜多染红细胞数，计算各组微核发生率(‰)，同时计数200个PCE，求出嗜多染红细胞数与成熟红细胞比值(PCE/RBC)，按泊松分布的方法作统计学处理，结果见表2。
表2软胶囊小鼠骨髓微核试验
**与阴性对照组比较P＜0.01。
结果：经统计学分析，软胶囊各剂量组的微核率与阴性对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)，试验结果为阴性。
2.3小鼠精子畸形试验
选择NIH种雄性小鼠25只，体重25～35g，随机分成5组，每组5只，根据急性毒性试验结果，设受试物最高剂量为10.0g/kg.bw，该剂量以下设5.00、2.50g/kg.bw两个剂量，阴性对照组给予等量的纯净水，阳性对照组选用40mg/kg.bw环磷酰胺(CP)。每天灌胃一次，连续灌胃5天，灌胃量均为0.2ml/10g.bw，首次染毒后第35天处死动物取双侧副睾按常规制片、染色，高倍镜下镜检观察，每只小鼠计数1000条完整精子，每组共检查5000条精子，求出精子畸形发生率(‰)，按Wilcoson秩和检验方法作统计学处理，结果见表3。
表3软胶囊小鼠精子畸形试验结果
**与阴性对照组比较P＜0.01。
结果：
经统计学分析，软胶囊各剂量组的精子畸形率与阴性对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)，试验结果为阴性。
二、软胶囊鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验(Ames试验)报告
1、材料与方法
1.1试验菌株：经过鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102试验菌株
1.2代谢活化系统：多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆S9液(当代谢活化时加入)。
1.3剂量设计：根据受试物情况，本试验最高剂量设定为5000μg/皿，按5倍间隔，共设五个剂量组，分别为5000、1000、200、40、8μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性对照组。
1.4受试物处理：实验前称取样品5.00g，以无菌蒸馏水为溶剂，待样品溶解后，用无菌蒸馏水加至100.00ml，沸水浴30分钟后，制成5％的母液作为最高剂量后，以无菌蒸馏水对母液依次做5倍稀释至所需各剂量受试物溶液，振摇混匀，供试验用。
1.5试验方法(平板掺入法)：在顶层培养基中加入0.10ml试验菌株增菌液，0.10ml受试物溶液和0.50ml S9混合液(当代谢活化时加入)，混匀后倒入底层培养基平板上，每一剂量组均为三个皿，置37℃下培养48小时，记录各试验组每皿回变菌落数。当受试物组回变菌落数增加一倍以上(即回变菌落数等于或大于2乘以溶剂对照组数)，并有剂量-反应关系或至少某一测试点有可重复的并有统计学意义的阳性反应，即判定为该受试物Ames试验为阳性。
2、结果
由表4、表5可见软胶囊对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，在加及不加S9时，5000、1000、200、40、8μg/皿五个剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照菌落数2倍，亦无可重复的并有统计学意义的阳性反应的某一测试点。
3、结论
试验结果表明受试物软胶囊Ames试验阴性。
表4软胶囊对鼠伤寒沙门氏菌的回变结果(第1次)
表5软胶囊对鼠伤寒沙门氏菌的回变结果(第2次)
三、30天喂养试验报告
1、材料
1.1受试物：样品为实施例一制得的软胶囊，内容物为棕黄色油状物，推荐服用方法为每天2g，以成人体重60kg计，推荐量为0.0333g/kg.bw。
1.2剂量设计：设低、中、高三个剂量组，剂量分别为0.83、1.67、3.33g/kg.bw，相当于人体推荐量的25、50、100倍，另设阴性对照组。
1.3样品处理：实验时称取样品4.98、10.02、19.98g，分别用纯净水配制成30ml的样液，供低、中、高三个剂量组动物灌胃使用。
1.4实验动物和实验室：南方医科大学实验动物中心提供的SPF级SD种健康大白鼠，生产许可证号：SCXK(粤)2006-0015，质量合格证编号：0080889，雄性体重：70.2±6.4g，雌性体重：77.1±9.2g，颗粒饲料由广东省医学实验动物中心提供；动物实验室为SPF级，使用许可证号：SYXK(粤)2008-0011，室温22±2℃，湿度60～80％。
2、方法
2.1试验方法：80只大鼠在实验室条件下适应3天后，随机分成四组，分别为受试物低、中、高三个剂量组和阴性对照组，每组20只，雌雄各半，分笼饲养。给样方法为灌胃，灌胃量为每天0.5ml/100g.bw，阴性对照组每天灌胃给以0.5ml/100g.bw纯净水，依据每周体重调整受试物量，连续30天。每鼠保证有充足饮水和饲料供应。实验开始及实验期每周称一次体重和两次食物摄入量。
2.2观察指标
2.2.1大鼠一般生理体征、外观、行为、大小便、皮毛等。
2.2.2体重、脏器重量、脏/体比值和食物利用率。
2.2.3血液学和血液生化学指标：血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、肌酐和尿素氮。上述指标用日立7600全自动生化仪和雅培3700全自动血球计数仪检测，试剂由原仪器生产商供应。
2.2.4各组大鼠心、肝、脾、肾、胃及小肠、性腺器官的大体解剖检查；对照组与高剂量组大鼠的肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺的组织病理学检查。
2.3统计处理：数据用SPSS10.0软件包进行方差分析。
3、结果
3.1一般情况：大鼠生理体征、体重、外观、行为、大小便、皮毛等均无异常。
3.2体重和食物利用率的变化：从表1、表2、表3可见，各剂量组大鼠体重和食物利用率指标与对照组比较，差异均无显著性意义，表明本受试物对大鼠生长和食物利用率无明显影响。
表1软胶囊30天喂养试验大鼠体重变化情况(n＝10，)
表2软胶囊30天喂养试验大鼠各周饲料摄食量变化情况
表3软胶囊30天喂养试验大鼠各周食物利用率变化情况
表4软胶囊30天喂养试验大鼠终期食物利用率变化情况
3.3血液学指标：从表5、表6可见，白细胞分类雄性大鼠低剂量组单核细胞数，与对照组比较差异有显著性意义，但波动在我所历史检测参考值范围内。其余指标各剂量组与对照组比较，差异均无显著性意义，结果表明该受试样品30天喂养试验血液学指标无异常。(参考值范围：雄性单核细胞数0.66～7.53％)
表5软胶囊30天喂养试验终期血液学指标(n＝10，)
表6软胶囊30天喂养试验终期白细胞分类指标(n＝10，)
3.4血液生化学指标：从表7、表8可见，雌性大鼠高剂量组谷草转氨酶，低、中剂量组总蛋白，高剂量组血糖，与对照组比较差异有显著性，但波动在历史参考值范围内。其余生化指标各剂量组与对照组比较，差异均无显著性意义。结果表明受试样品30天喂养试验血液生化学指标无异常。(雌性参考值范围：谷草转氨酶54.9～134.1U/L，总蛋白53.9～64.2g/L，血糖4.12～6.91mmol/L)
表7软胶囊30天喂养试验终期血液生化学指标(n＝10，)
表8软胶囊30天喂养试验终期血液生化学指标(n＝10，)
3.5脏器重量、脏/体比值：从表9、表10可见，各剂量组各脏器指标与对照组比较，差异均无显著性意义，表明受试样品30天喂养试验脏器重量、脏/体比值指标正常。
表9软胶囊30天喂养试验大鼠脏器重量结果(n＝10，)
表10软胶囊30天喂养试验大鼠脏/体比值结果(n＝10，)
3.6病理学检查结果
3.6.1大体检查
各组大鼠心脏、肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺等器官的大体检查，未见异常情况。
3.6.2组织病理学检查
大体检查心脏、肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺等器官未见肉眼可见病变，故选择高剂量组和对照组动物的肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺进行组织病理学检查，结果如下：
肝脏：雄性高剂量组1例动物肝组织内可见少量肝细胞空泡变性；其余动物肝脏被膜完整，未见增厚，肝小叶结构完整。未见肝细胞明显水样变性、脂肪变性或坏死等病理改变。肝细胞内及胆管未见胆汁淤积。门管区无扩大，无渗出等异常表现。见表11。
表11软胶囊30天喂养试验大鼠肝脏组织病理学检查结果
注：每组动物n＝20，雌雄各半。
胃及小肠：镜下可见各层结构清晰，粘膜上皮完整，未见糜烂、出血、坏死或溃疡形成，腺体排列整齐，未见萎缩或增生；肌层未见肥厚或萎缩。
脾脏：脾脏被膜完整，未见增厚，脾红、白髓结构清晰。未见脾、小体萎缩、分离或消失、坏死，未见脾窦扩张充血、脾梗塞等病理改变。
性腺：雄性大鼠睾丸白膜完整，未见增厚，曲细精管结构正常，未见基底膜增厚、变性等改变；各级生精细胞依次排列有序，未见生精上皮细胞减少、变性或坏死等病理改变；未见间质水肿、出血。雌性大鼠卵巢表面上皮完整，各级卵泡结构正常，未见卵泡囊肿、黄体囊肿、卵巢萎缩、纤维化及肿瘤等病理学改变。
肾脏：雄性高剂量组1例动物肾皮质区部分肾小管内可见管型，其余动物肾脏皮髓质结构清晰，肾小球未见明显肿胀或萎缩、纤维化，也未见变性、坏死等病理改变。肾小管上皮细胞未见变性、坏死，集合管未见各类管型。间质未见炎症细胞浸润。见表12。
表12软胶囊30天喂养试验大鼠肾脏病理组织学检查结果
注：每组动物n＝20，雌雄各半。
综上，对照组与高剂量组大鼠的肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺组织病理学观察结果大致相同，未见与受试物有关的病理改变。
4、小结：对SPF级SD种健康大鼠每天给予0.83、1.67、3.33g/kg.bw增加骨密度保健软胶囊，相当于推荐量的25、50、100倍，试验时间共30天。结果表明：大鼠一般生理体征、行为、大小便、皮毛等均无异常，体重和食物利用率指标正常，血液学和血液生化指标在正常范围内，脏器重量、脏/体比值指标正常，心脏、肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺等器官的大体检查和肝脏、肾脏、胃及小肠、脾脏和性腺的组织病理学检查，未见与受试物有关的病理改变。
下面为本发明增加骨密度试验报告：
1、材料
1.1受试样品：样品为实施例一制得的软胶囊，样品推荐日服用量为2g/天。样品的人体推荐日服量为2.0g/60kg成人，即0.033g/kg.bw。
1.2剂量设计：按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中“增加骨密度功能检验方法”方法二，不以补钙为主产品设计，鉴于该样品还有大豆异黄酮，其中有效成分(异黄酮)的含量不低于1.45％。检测该批样品的钙含量为150mg/g，高剂量组的钙含量为150mg/kg.bw。本实验低、中、高三个剂量组，分别为人体推荐量的5、10、30倍；另设去卵巢对照组、假手术组、雌激素对照组和碳酸钙对照组(与高剂量钙相同)，每组10只动物，剂量如下：
1.3饲料配方及样品处理：参照AIN93饲料配方配制成半成品饲料，用适当的物质替换饲料来源于大豆成分，以避免大豆异黄酮等植物激素对实验结果的干扰。基础饲料配方如下：酪蛋白23％、DL-蛋氨酸0.3％，玉米淀粉32％，蔗糖30％，纤维5％，玉米油5％，混合矿物盐3.5％，混合维生素1％，二酒石酸胆碱0.2％。
每日分别称取1.0、2.0、6.0g受试样品，各用纯净水调配至60ml制成低、中、高剂量组受试物，每日按体重灌胃给予；假手术组和去卵巢对照组每日均灌胃给予纯净水；雌激素对照组每日给予β-雌二醇；称取2.25g碳酸钙于60ml纯净水中制成碳酸钙混悬液，供碳酸钙对照组灌胃，各组灌胃量均为1.0ml/100g.bw。
1.4实验动物和实验室：南方医科大学实验动物中心提供的SPF级SD种雌性健康大白鼠，合格证号：粤检证字SCXK(粤)2006-0015，合格证编号：NO0079906，体重：295.9±17.2g；颗粒饲料由广东省实验动物中心提供；动物实验室为SPF级，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2008-0011，室温22±2℃，湿度60％～80％。
2、方法
2.1试验方法：70只大鼠在实验室条件下适应三天后，根据体重随机分成7组。所有大鼠均用戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(30mg/kg.bw)，假手术组为单纯开腹组，其它6组在无菌条件下切除双侧卵巢，分别是低、中、高剂量组，雌激素对照组、碳酸钙对照组和去卵巢对照组，每组10只动物，分笼饲养。假手术组、去卵巢对照组、低、中、高剂量组术后5天开始每日按体重灌胃，雌激素对照组每日灌胃给予β-雌二醇，碳酸钙对照组每日灌胃给予碳酸钙溶液，灌胃量为1.0ml/100g.bw，每鼠自由摄食，保证有充足饮水，每周称量一次体重，连续三个月。
2.2观察指标
2.2.1体重：每周称量一次体重。
2.2.2股骨重量测定：实验结束动物处死后剥离右侧股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重。
2.2.3股骨骨密度测定：用骨矿物测量仪测量左侧股骨中点及远心端的骨密度。
2.2.4股骨骨钙含量测定：实验结束动物处死后剥离右侧股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重，移入坩埚内，置电炉上炭化至无烟为止。移入马弗炉，升温至500℃，恒温30min，再升温至700℃，恒温60min。样品灰化后，加入20％的盐酸完全溶解，移入50ml容量瓶中，用去离子水定容至刻度。采用原子吸收法测定，所采用的仪器为VARIAN SPECTRAA 220Z(220原子吸收光谱仪)。
2.3统计处理：数据用SPSS11.0软件包进行方差分析。
3、结果
3.1软胶囊对大鼠一般情况、体重的影响：实验期间，各组大鼠的存活情况良好，术后伤口愈合情况较好，无感染。从表1可见，实验开始时，各组体重无显著性差异(P＞0.05)；实验结束时，假手术组、雌激素对照组、低、高剂量组明显低于去卵巢对照组的体重P＜0.05)，中剂量组、碳酸钙对照组体重与去卵巢对照组比较，未见显著性差异(P＞0.05)。
表1软胶囊对大鼠体重的影响
注：与去卵巢对照组比较，*为P＜0.05。
3.2软胶囊对大鼠股骨骨密度和骨钙含量的影响：表2可见，去卵巢对照组大鼠股骨骨钙含量和远心点骨密度显著低于假手术组(P＜0.05)，表示造成大鼠骨密度低下模型；各剂量组、雌激素对照组和碳酸钙对照组大鼠的股骨骨钙含量与卵巢对照组比较增加，差异有显著性意义(P＜0.05)，各剂量组骨钙含量与碳酸钙对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；假手术组、中剂量组、雌激素对照组远心点骨密度与去卵巢对照组比较增加，差异有显著性意义(P＜0.05)，与碳酸钙对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；各组大鼠股骨中点骨密度无显著性差异(P＞0.05)。
表2软胶囊对大鼠股骨骨密度和骨钙含量的影响
注：与去卵巢对照组比较，*为P＜0.05。
4、小结
本实验设低、中、高三个剂量组，剂量分别为0.17、0.33、1.00g/kg.bw，为人体推荐量的5、10、30倍；另设去卵巢对照组、假手术组、雌激素对照组和碳酸钙对照组。各剂量组每日按体重灌胃给予样品；假手术组和去卵巢对照组每日均灌胃给予纯净水；雌激素对照组每日给予β-雌二醇，剂量为20.0μg/kg.bw，碳酸钙对照组剂量为0.375g/kg.bw，灌胃量均为1.0ml/100g.bw。试验时间共三个月。试验结果如下：
(1)去卵巢对照组大鼠股骨骨钙含量和远心点骨密度显著低于假手术组(P＜0.05)，表示造成大鼠骨密度低下模型；
(2)各剂量组、雌激素对照组和碳酸钙对照组大鼠的股骨骨钙含量与去卵巢对照组比较增加，差异有显著性意义(P＜0.05)，各剂量组骨钙含量与碳酸钙对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；
(3)假手术组、中剂量组和雌激素对照组远心点骨密度与去卵巢对照组比较增加，差异有显著性意义(P＜0.05)，与碳酸钙对照组比较无显著性差异(P＞0.05)；各组大鼠股骨中点骨密度无显著性差异(P＞0.05)。
根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中增加骨密度功能检验方法判定标准判断，该软胶囊具有增加骨密度功能。