本发明涉及一种富含中性蛋白酶的饲料级发酵大米粉及其制备方法，具体涉及富含中性蛋白酶的发酵大米蛋白饲料原料及其制作方法。
背景技术：
中国是稻米生产大国，具有丰富的大米资源。大米蛋白粉是稻米深加工的重要产物，根据其蛋白质含量及溶解性可分为饲料级大米蛋白粉、食用级大米蛋白粉和大米蛋白肽。在谷物蛋白中，大米蛋白的氨基酸组成平衡合理，且氨基酸含量高，是其它植物蛋白所无法比拟的。饲料级大米蛋白粉因其蛋白含量高、适口性好、消化利用率高、成本相对较低等优点，逐渐的在动物饲料中得到了初步应用，尤其是在蛋白质含量要求较高、对优质进口鱼粉依赖严重的特种水产饲料应用趋势更为明显。高档鱼虾等特种水产饲料中因蛋白质和氨基酸需求较高，常添加多种高蛋白的动物性和植物性饲料原料来提高蛋白质和氨基酸的含量，但存在以下问题：
1、大多水产动物自身分泌的中性蛋白酶数量有限，影响了饲料中蛋白质的消化率，不能充分利用饲料中的蛋白质，造成蛋白质资源的浪费；
2、普通大米蛋白粉水溶性差，限制了水产动物的吸收利用效率；
3、常规发酵大米蛋白粉多采用分离提纯技术，得到的产品不含有中性蛋白酶。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种富含中性蛋白酶的饲料级发酵大米粉及其制备方法，该发酵饲料原料富含中性蛋白酶，能够有效解决动物消化道内中性蛋白酶分泌不足的缺点，提高动物对饲料中蛋白的利用效率，降低养殖成本，节约饲料资源。
为了解决上述技术问题，本发明采用工业芽胞杆菌亚种as1.398为菌种，通过菌种的复活、复壮、扩大培养，得到数量可观的孢子悬浮液，然后采用固态发酵的方式得到富含中性蛋白酶的发酵大米蛋白粉。
本发明提供了一种饲料级发酵大米粉，其中性蛋白酶平均比活力为5500-8000u/g，以质量计粗蛋白含量为65-80％。经过固态发酵后的大米蛋白粉富含中性蛋白酶，作为饲料原料饲喂动物后能够有效缓解动物消化道内中性蛋白酶分泌不足的缺点，提高动物对饲料蛋白的利用效率，降低养殖成本，节约饲料资源。同时，以大米蛋白粉为原料，采用微生物发酵技术对大米蛋白粉进行固态发酵，得到富含中性蛋白酶的发酵大米蛋白产物用作饲料原料，提高动物对饲料中蛋白质的利用效率，有效节约蛋白资源，提高稻米附加值，以科技为支撑发展稻米深加工产业，促进我国粮食产业的发展的同时，提高畜牧业的经济效益。
其制备方法包括：采用固态发酵的方法，以芽胞杆菌as1.398为菌种，碳源包括水分含量为55-65％的大米蛋白粉，氮源包括水分含量为55-65％的大米蛋白粉和缓释尿素，辅料包括磷酸二氢钾和磷酸氢二钠，培养基的ph值调节剂为碳酸钠和碳酸钙；其制备方法，包括以下步骤：
a、培养基的制备：
液体培养基：氯化钠5.3g，牛肉膏10.2g，蛋白胨9.7g，琼脂21.0g，加入1.2l蒸馏水中，用碳酸钠和碳酸钙调整ph值至7.2，118℃灭菌30分钟，得液体培养基；
摇瓶培养基：每5000ml包括大米粉150g，乳糖50g，磷酸二氢钾10.0g，磷酸氢二钠20.0g，7水硫酸镁8g，牛肉膏7g，以体积计4％的豆浆，其余为灭菌水；用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.1-7.3，110℃灭菌30分钟，得摇瓶培养基；
b、种子菌液的制备：
取枯草杆菌as1.398斜面，转接于空白琼脂培养基斜面上，30℃培养36h；取3-5环菌种接于装有400ml液体培养基的1000ml的三角瓶中，30℃培养10小时；取三角瓶中的菌液30-80ml于5000ml装有摇瓶培养基的生物耗氧挡板摇瓶中，30℃、240r/min进行二次扩大培养10小时，得种子菌液；
c、固态发酵：
固态培养基的制备：以重量计，取占固态发酵培养基混合物总量为95％-99％的饲料级大米蛋白粉均匀摊放，用灭菌水均匀喷淋至水分含量为55-65％，以质量计添加缓释尿素0.5％-1.5％、磷酸二氢钾0.2％-0.4％、磷酸氢二钠0.3％-0.8％,用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.2-7.5，110℃高温蒸汽灭菌30分钟，得固态培养基；
发酵：待固态培养基温度冷却至28-32℃，取占固态培养基体积1‰的种子菌液，用灭菌后的喷雾器均匀喷洒在固态培养基上，每30分钟均匀翻动10次，30℃发酵48小时，得发酵后的产品；
d、发酵后产品的处理：
发酵后的产品在45-50℃下进行干燥，水份含量小于12％后冷却至常温，封装即可。
本发明提供了一种饲料级发酵大米粉在水产饲料中的用途。
本发明还提供了一种饲料级发酵大米粉的制备方法，其步骤包括：
a、培养基的制备：
液体培养基：氯化钠5.3g，牛肉膏10.2g，蛋白胨9.7g，琼脂21.0g，加入，1.2l蒸馏水中，用碳酸钠和碳酸钙调整ph值至7.2，118℃灭菌30分钟，得液体培养基；
摇瓶培养基：每5000ml包括大米粉150g，乳糖50g，磷酸二氢钾10.0g，磷酸氢二钠20.0g，7水硫酸镁8g，牛肉膏7g，以体积计4％的豆浆，其余为灭菌水；用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.1-7.3，110℃灭菌30分钟，得摇瓶培养基；
b、种子菌液的制备：
取枯草杆菌as1.398斜面，转接于空白琼脂培养基斜面上，30℃培养36h；取3-5环菌种接于装有400ml液体培养基的1000ml的三角瓶中，30℃培养10小时；取三角瓶中的菌液30-80ml于5000ml装有摇瓶培养基的生物耗氧挡板摇瓶中，30℃、240r/min进行二次扩大培养10小时，得种子菌液；
c、固态发酵：
固态发酵培养基的制备：以重量计，取占固态发酵培养基混合物总量为95％-99％的饲料级大米蛋白粉均匀摊放，用灭菌水均匀喷淋至水分含量为55-65％，添加缓释尿素0.5％-1.5％，添加辅料磷酸二氢钾0.2％-0.4％、磷酸氢二钠0.3％-0.8％,用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.2-7.5，110℃高温蒸汽灭菌30分钟，得固态发酵培养基；
发酵：待固态培养基温度冷却至28-32℃，取占固态培养基体积1‰的种子菌液，用灭菌后的喷雾器均匀喷洒在固态培养基上，每30分钟均匀翻动10次，30℃发酵48小时，得发酵后的产品；
d、发酵后产品的处理：
发酵后的产品在45-50℃下进行干燥，水份含量小于12％后冷却至常温，封装即可。
采用本方法生产富含中性蛋白酶的饲料级大米蛋白粉不需要进行提纯，过程简单，成本较低，有利于规模化的工业生产。本方法生产的大米蛋白粉水溶性得到了提高，比发酵前提高了20％以上。本方案生产的发酵大米蛋白粉作为饲料原料有利于节约饲料蛋白资源，提高动物对饲料蛋白质的利用效率，取得了良好的经济和社会效益。
具体实施方式
通过下面给出的具体实施例，可以进一步清楚的了解本发明，但他们不是对本发明的限定。
实施例1
a、培养基的制备：
液体培养基：氯化钠5.3g，牛肉膏10.2g，蛋白胨9.7g，琼脂21.0g，加入，1.2l蒸馏水中，用碳酸钠和碳酸钙调整ph值至7.2，118℃灭菌30分钟，得液体培养基；
摇瓶培养基：每5000ml包括大米粉150g，乳糖50g，磷酸二氢钾10.0g，磷酸氢二钠20.0g，7水硫酸镁8g，牛肉膏7g，以体积计4％的豆浆，其余为灭菌水；用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.1-7.3，110℃灭菌30分钟，得摇瓶培养基；
b、种子菌液的制备：
取枯草杆菌as1.398斜面，转接于空白琼脂培养基斜面上，30℃培养36h；取3-5环菌种接于装有400ml液体培养基的1000ml的三角瓶中，30℃培养10小时；取三角瓶中的菌液30ml于5000ml装有摇瓶培养基的生物耗氧挡板摇瓶中，30℃、240r/min进行二次扩大培养10小时，得种子菌液；
c、固态发酵：
固态发酵培养基的制备：以重量计，取占固态发酵培养基混合物总量为95％的饲料级大米蛋白粉均匀摊放，用灭菌水均匀喷淋至水分含量为55％，添加缓释尿素0.5％，添加辅料磷酸二氢钾0.2％、磷酸氢二钠0.3％,用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.2，110℃高温蒸汽灭菌30分钟，得固态发酵培养基；
发酵：待固态发酵培养基温度冷却至28℃，取占固态培养基体积1‰的种子菌液，用灭菌后的喷雾器均匀喷洒在固态培养基上，每30分钟均匀翻动10次，30℃发酵48小时，得发酵后产品；
d、发酵后产品的处理：
发酵后产品在45℃下进行干燥，水份含量小于12％后冷却至常温，封装即可。
实施例2
a、培养基的制备：
液体培养基：氯化钠5.3g，牛肉膏10.2g，蛋白胨9.7g，琼脂21.0g，加入，1.2l蒸馏水中，用碳酸钠和碳酸钙调整ph值至7.2，118℃灭菌30分钟，得液体培养基；
摇瓶培养基：每5000ml包括大米粉150g，乳糖50g，磷酸二氢钾10.0g，磷酸氢二钠20.0g，7水硫酸镁8g，牛肉膏7g，以体积计4％的豆浆，其余为灭菌水；用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.1-7.3，110℃灭菌30分钟，得摇瓶培养基；
b、种子菌液的制备：
取枯草杆菌as1.398斜面，转接于空白琼脂培养基斜面上，30℃培养36h；取3-5环菌种接于装有400ml液体培养基的1000ml的三角瓶中，30℃培养10小时；取三角瓶中的菌液50ml于5000ml装有摇瓶培养基的生物耗氧挡板摇瓶中，30℃、240r/min进行二次扩大培养10小时，得种子菌液；
c、固态发酵：
固态发酵培养基的制备：以重量计，取占固态发酵培养基混合物总量为99％的饲料级大米蛋白粉均匀摊放，用灭菌水均匀喷淋至水分含量为65％，添加缓释尿素1.0％，添加辅料磷酸二氢钾0.3％、磷酸氢二钠0.5％,用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.3，110℃高温蒸汽灭菌30分钟，得固态发酵培养基；
发酵：待固态发酵培养基温度冷却至30℃，取占固态培养基体积1‰的种子菌液，用灭菌后的喷雾器均匀喷洒在固态培养基上，每30分钟均匀翻动10次，30℃发酵48小时，得发酵后产品；
d、发酵后产品的处理：
发酵后产品在48℃下进行干燥，水份含量小于12％后冷却至常温，封装即可。
实施例3
a、培养基的制备：
液体培养基：氯化钠5.3g，牛肉膏10.2g，蛋白胨9.7g，琼脂21.0g，加入，1.2l蒸馏水中，用碳酸钠和碳酸钙调整ph值至7.2，118℃灭菌30分钟，得液体培养基；
摇瓶培养基：每5000ml包括大米粉150g，乳糖50g，磷酸二氢钾10.0g，磷酸氢二钠20.0g，7水硫酸镁8g，牛肉膏7g，以体积计4％的豆浆，其余为灭菌水；用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.1-7.3，110℃灭菌30分钟，得摇瓶培养基；
b、种子菌液的制备：
取枯草杆菌as1.398斜面，转接于空白琼脂培养基斜面上，30℃培养36h；取3-5环菌种接于装有400ml液体培养基的1000ml的三角瓶中，30℃培养10小时；取三角瓶中的菌液80ml于5000ml装有摇瓶培养基的生物耗氧挡板摇瓶中，30℃、240r/min进行二次扩大培养10小时，得种子菌液；
c、固态发酵：
固态发酵培养基的制备：以重量计，取占固态发酵培养基混合物总量为97％的饲料级大米蛋白粉均匀摊放，用灭菌水均匀喷淋至水分含量为60％，添加缓释尿素1.5％，添加辅料磷酸二氢钾0.4％、磷酸氢二钠0.8％,用碳酸钠和碳酸钙调整ph值为7.5，110℃高温蒸汽灭菌30分钟，得固态发酵培养基；
发酵：待固态发酵培养基温度冷却至32℃，取占固态培养基体积1‰的种子菌液，用灭菌后的喷雾器均匀喷洒在固态培养基上，每30分钟均匀翻动10次，30℃发酵48小时，得发酵后产品；
d、发酵后产品的处理：
发酵后产品在50℃下进行干燥，水份含量小于12％后冷却至常温，封装即可。
实施例4
采用国标sb/t10317方法检测产品的中性蛋白酶平均比活力，采用凯氏定氮法检测产品粗蛋白含量，采用溶水法计算产品的水中溶解度，结果见下:见表1：
表1：产品检测
结论：本发明方案提供的发酵大米蛋白粉中的中性蛋白酶平均比活力达到5500u/g以上，而市售大米蛋白产品的中性蛋白酶含量几乎为0；粗蛋白含量提高了3％以上，最高达到71.8％；采用本方法生产富含中性蛋白酶的饲料级大米蛋白粉不需要进行提纯，过程简单，成本较低，有利于规模化的工业生产。本方法生产的大米蛋白粉水溶性得到了提高，发酵前市售大米蛋白粉10样均值为16.2％，发酵后水中溶解度较发酵前提高60％以上，最高达到28.2％。本方案生产的发酵大米蛋白粉作为饲料原料有利于节约饲料蛋白资源，提高动物对饲料蛋白质的利用效率，取得了良好的经济和社会效益。