本发明涉及一种鱼子酱的制备，具体地说是一种河豚鱼子酱的生产工艺，属于鱼子酱的制备领域。
背景技术：
河鲀(Fugu)又名气泡鱼，英文名pufferfish，属硬骨鱼纲，鲀形目，鲀亚目，鲀科，它是一种具有江海洄游习性，生活在暖温性近海底层的鱼类。广义的河鲀指硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲈形总目、鲀形目中箱鲀亚目、鳞鲀亚目、翻车鲀亚目、鲀亚目中所有种类河鲀的统称，狭义的河鲀是指与我们的食用、文化、历史密切相关的一类带毒却又味道鲜美的经济鱼，主要集中在鲀亚目中的鲀科和刺鲀科，其中，鲀科具经济价值的有兔鲀属、刺腹鲀属和东方鲀属等。
河鲀鱼子营养丰富，但由于野生河鲀鱼子含有河鲀毒素为剧毒，所以在中国，河鲀鱼子大部分被无毒化处理后废弃，目前由于控毒人工养殖河鲀鱼技术的发展，养殖河鲀不仅味道鲜美，营养价值高而且控毒后使河鲀低毒或者无毒，再将低毒或无毒的河鲀卵巢丢弃已经不适应可持续发展的要求。中国河鲀养殖业的蓬勃发展、河鲀控毒技术的提高、河鲀安全加工体系制度的完善、中国法令法规的与时俱进以及人们对食品多样性和高品质的要求，将来在国内食用河鲀被解禁，河鲀销售、消费、流通自由化都将指日可待，开发新的河鲀产品，增加河鲀附加值具有重要意义，再将低毒或无毒的河鲀卵巢丢弃已经不适应可持续发展的要求。
名称为“河豚鱼鱼酱的生产方法”申请号为“201310013580.3”的中国发明专利公开了一种河豚鱼鱼酱的生产方法，具体为取清洗后的河豚鱼肉，经过打浆形成原酱泥，向原酱泥中接种酒糟，发酵后，再加入调配剂，最后灌装、灭菌。该发明属于鱼酱的生产，原料为河豚鱼肉，主要是通过在鱼酱中接种酒糟接种，发酵效果不理想。
技术实现要素：
本发明的目的在于，设计了一种河豚鱼子酱的生产工艺，生产出具有独特风味，高营养、高安全性，符合中国人饮食心理等特点的优质发酵鱼子，从而为河鲀产品加工业建立生物发酵的新加工技术体系提供理论基础和科学依据。
本发明的技术方案为：
河豚鱼子酱的生产工艺，包括以下步骤：
(1)鱼子解冻、定形脱血：盐水解冻，在10℃，盐溶液质量百分比浓度为4％-10％，定形30min，同时按照同一方向搅拌；
(2)脱囊衣：将步骤(1)解冻定形脱血的鱼卵手动脱囊衣；
(3)脱毒：将步骤(2)脱囊衣的鱼卵放于脱毒剂中脱毒，一直按照同一方向搅拌，使鱼卵均匀分布在脱毒剂中；所述脱毒剂为碳酸钠，占鱼卵的重量分数为2％；
(4)脱碱脱腥：选择柠檬酸和半胱氨酸的混合液脱碱脱腥同时抗氧化，在上述步骤(3)脱毒后的溶液中加入柠檬酸和半胱氨酸混合液，柠檬酸占鱼卵的重量分数为5％，半胱氨酸占鱼卵的重量分数为3％，按照一个方向搅拌，使鱼卵均匀分布在液体中；
调节固液比为1∶3，温度15℃下处理3h-5h，不仅使鱼子达到无毒水平，并且感官评分最高。
本发明采用碳酸钠作为主要脱毒剂，半胱氨酸作为辅助脱毒剂兼抗氧化剂，柠檬酸作为脱碱剂，中和碱液。在不破坏河鲀鱼子营养价值的基础上对河鲀鱼子进行脱毒处理，但Na2CO3用量过大，会有碱味影响产品的风味，所以选用柠檬酸进行脱碱，中和碳酸钠，Na2CO3残存的碱性金属离子会催化油脂氧化，而柠檬酸和半胱氨酸都有抗氧化的作用，可以抑制脂肪的氧化。本发明脱毒处理不仅降解了毒素而且减少了鱼子令人不愉快的腥味。
(5)减菌漂洗：将步骤(4)脱碱脱腥后的溶液用臭氧水漂洗2次后，用清水再快速漂洗两次，沥水；
(6)接菌发酵：将筛选的发酵菌液加入到处理好的鱼子中，搅拌均匀，发酵；
(7)真空包装：将发酵成熟的鱼子放入耐高温的包装袋中，真空包装；
(8)灭菌：121℃，20min；毒素在这个温度下不稳定，灭菌同时还能破坏可能存在的极微量河鲀毒素。
本发明利用从传统发酵制品中分离出来的优势微生物作为发酵剂，其优势在于：可缩短生产周期，改善制品的风味品质和安全性。另外，发酵剂可以使发酵鱼子pH值在36h内降至5.0以下，从而提高产品的可贮性和食用安全性；其氨基酸态氮含量在36h～72h一直高于传统发酵，风味分值在48h之后高于传统发酵。
其中，所述步骤(6)发酵菌液为自然发酵筛选后得到的菌液。
进一步地，所述步骤(6)发酵菌液的组成为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)，所述的植物乳杆菌、汉逊德巴利酵母、木糖葡萄球菌的重量比为1∶2∶2；
进一步地，所述步骤(6)的接种量为13％-15％、发酵温度为34℃-37℃、发酵时间为60h-72h，加盐量为0-1.5％；优选地，接种量为14％、发酵温度为35℃、发酵时间为65h，此时河鲀发酵鱼子的品质最好，亚硝酸盐含量为0.331mg/kg，氨基酸态氮含量为0.711g/100g，感官评分为93.5分，鱼子酱品质最佳，这表明理论值和实际值之间具有良好的拟合性，优化模型可靠。
进一步地，上述自然发酵筛选菌液的方法为：
(1)鱼子解冻、定形脱血：盐水解冻，在10℃，盐溶液浓度依次4％-10％，定形30min，同时不断的按照同一方向轻轻搅拌；
(2)脱囊衣：手动脱囊衣；
(3)漂洗：流水洗涤；
(4)盐渍：漂洗沥干后，将其放在占原料鲜重14％-16％的细盐里滚动；
(5)沥干水分后置于阴凉处自然晾干发酵，得到自然发酵河鲀制品；
(6)对上述步骤(1)-(5)的原料鱼子和发酵过程中的鱼子进行微生物动态分析；然后，进行微生物的富集培养、分离纯化和初步鉴定；再进行备选发酵菌株的初筛，根据备选菌株发挥的不同作用，参照传统发酵河鲀鱼子生产的发酵剂必须具备的特征，建立相应初筛选体系；然后，对初筛菌株进行复筛；再进行备选菌株发酵性能测定；
其中，备选菌株性能测定：包括备选菌株不同温度下的生长情况、备选菌株不同食盐浓度下的生长情况、备选菌株不同初始pH值下的生长情况测定、单菌株30h生长曲线的测定、多菌株共培养条件下共生与拮抗的关系；
(7)利用多种选择性培养基反复多次分离纯化菌株，经初步鉴定得到乳酸菌菌株，葡萄球菌菌株、微球菌菌株，酵母菌株，霉菌菌株；经过初筛得到不产黏液、不产过氧化氢、发酵葡萄糖不产气、水解精氨酸不产氨、不产H2S、不产生物胺等基本要求的乳酸菌菌株、葡萄球菌菌株、微球菌和酵母菌株以及霉菌菌株；再经过复筛得到符合要求的乳酸菌菌株(Lactobacillus plantarum)、葡萄球菌菌株(Staphylococcus xylosus)，以及酵母菌株(Debaryomyces hansenii)。
自然介质筛选发酵菌株更能适应河鲀制品生境。我国地域辽阔，全国各地有很多品种风味独特的发酵产品，这其中蕴含的大量优良的发酵菌株，很多接种发酵研究直接使用实验室现有的微生物菌株，这种做法看似简单实则是有缺陷的。尽管在筛选时是根据它们的工艺活性如发酵活力、蛋白水解能力、脂肪酶活性等指标进行，但是它们不一定能适应河鲀制品的实际生产，不适应河鲀鱼子这个发酵介质，环境因素如温度、相对湿度、pH、原料肉、其他原料等相互作用可能会限制发酵菌株的数量增殖，而使它们不能成为优势菌，发挥不了本身的发酵特性，可能会使期望的风味特征得不到体现。自然发酵河鲀制品中保持着大量的河鲀制品发酵菌种资源，从中分离筛选的菌株往往更适用于河鲀鱼子的发酵环境。本发明按照传统方法生产了腌河鲀鱼子，一方面通过对自然发酵河鲀鱼子生产过程中的微生物变化进行动态分析，能够更好地了解发酵河鲀鱼子中微生物规律；另一方面将河鲀制品发酵过程中优势微生物进行分离纯化筛选，得到适合发酵河鲀鱼子的优良菌株。
本发明的优点在于：生产出具有独特风味，高营养、高安全性，符合中国人饮食心理等特点的优质发酵鱼子，从而为河鲀产品加工业建立生物发酵的新加工技术体系提供理论基础和科学依据。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指溶液100ml中含有溶质若干克；液体之间的百分比，是指20℃时容量的比例。
实施例1
一种河豚鱼子酱的生产工艺，包括以下步骤：
(1)河鲀发酵鱼子菌种的筛选
1、自然发酵河鲀制品的制备
制备流程为：冷冻河鲀鱼子解冻→挑拣→定形脱血→脱囊衣→漂洗→盐渍→沥水→晾干→发酵；
具体操作方法如下：
(1)鱼子解冻、定形脱血：盐水解冻，在10℃，盐溶液浓度依次4％-10％，定形30min，同时不断的按照同一方向轻轻搅拌；
(2)脱囊衣：手动脱囊衣；
(3)漂洗：流水洗涤；
(4)盐渍：漂洗沥干后，将其放在占原料鲜重14％-16％的细盐里滚动；
(5)沥干水分后置于阴凉处自然晾干发酵。
2、自然发酵河鲀鱼子微生物分析
首先，对上述步骤得到的原料鱼子和发酵过程中鱼子进行微生物动态分析，发酵期为30d，每5天取样一次；然后，进行微生物的富集培养、分离纯化和初步鉴定，包括过氧化氢酶活性检测、凝乳试验、产乳酸试验、呋喃唑酮的检测、新生霉素抗性检测、O/F试验；然后，进行备选发酵菌株的初筛，根据备选菌株发挥的不同作用，参照传统发酵河鲀鱼子生产的发酵剂必须具备的特征，建立相应初筛选体系；包括安全性试验，溶血试验、凝固酶活性试验、耐热核酸酶试验、动物安全试验，初步认为无毒，非产生物、葡萄糖非产气、非产氨、非产硫化氢、非产过氧化氢、非产黏、耐盐试验，得到符合发酵条件的初筛菌株；然后，对初筛菌株进行复筛，包括初筛乳酸菌的产酸特性试验、凝乳特性试验、抑菌特性试验、降解亚硝酸盐试验，葡萄球菌微球菌的耐酸性试验、产色素试验、硝酸盐还原酶检测、蛋白酶活性检测、脂肪酶活性检测、产香性检测，酵母菌霉菌的蛋白酶活性检测、脂肪酶活性检测、产香性检测；在进行备选菌株发酵性能测定(包括备选菌株不同温度下的生长情况测定、备选菌株不同食盐浓度下的生长情况测定、备选菌株不同初始pH值下的生长情况测定、备选菌株30h生长曲线的测定)；鱼子发酵过程中，微生物此消彼长，呈一种动态平衡，其中，乳酸菌、微球菌、葡萄球菌、酵母是鱼子发酵过程中的优势菌株；备选菌株性能测定：包括备选菌株不同温度下的生长情况、备选菌株不同食盐浓度下的生长情况、备选菌株不同初始pH值下的生长情况测定、单菌株30h生长曲线的测定、多菌株共培养条件下共生与拮抗的关系；共培养条件下菌株相关性分析：包括单一发酵剂和混合发酵剂对发酵河鲀鱼子pH的影响、单一发酵剂和混合发酵剂对发酵河鲀鱼子氨基酸态氮的影响、单一发酵剂和混合发酵剂对发酵河鲀鱼子风味的影响。
本发明首先利用多种选择性培养基反复多次分离纯化菌株，经初步鉴定得到乳酸菌菌株，葡萄球菌菌株、微球菌菌株，酵母菌株，霉菌菌株；经过初筛得到不产黏液、不产过氧化氢、发酵葡萄糖不产气、水解精氨酸不产氨、不产H2S、不产生物胺等基本要求的乳酸菌菌株、葡萄球菌菌株、微球菌和酵母菌株以及霉菌菌株；再经过复筛得到产酸性能好并且具有抑菌活性、降解亚硝酸盐的乳酸菌菌株，具有耐酸性、硝酸盐还原酶活性、蛋白酶活性、脂肪酶活性并具有不产色素、良好产香性的葡萄球菌菌株，以及具有蛋白酶活性、脂肪酶活性并具有良好产香性的酵母菌株。
发酵菌株必须对人体无害，无致病性，本发明通过溶血性实验、凝固酶实验、耐热核酸酶、动物实验，多个安全检测实验确保菌株无致病性。本发明用蛋白酶活性、脂肪酶活性、产香性、降解硝酸盐指标来筛选出优良的发酵乳酸菌、酵母、葡萄球菌。
多菌种混合发酵可以弥补单菌种发酵的单调性，使产品风味物质更丰富，质量更好。还可增加产品的多样性，扩大市场消费。很多风味独特品质优良的传统发酵产品是多菌种混合发酵。大量研究表明，乳酸菌主要是分解碳水化合物，进而降低产品的pH值，有效地抑制腐败菌、致病菌，低pH也促进亚硝酸盐的分解。葡萄球菌具有酯酶、过氧化氢酶和蛋白酶的活性，对产品良好的风味起关键作用。酵母菌在发酵过程中消耗环境中的空气，抑制酸败，同时赋予产品特殊的酵母香气。多菌株混合发酵在于彼此之间不仅没有抑制反而相互促进弥补单一菌株的不足和缺陷。乳酸菌对噬菌体敏感，使用单菌株有被噬菌体分解丧失产酸能力的危险，混合发酵剂可抵抗噬菌体的侵袭。
采用混合发酵剂发酵的鱼子，可以使pH在36h内降低至pH值5以下，从而提高产品的可贮性和食用安全性。混合发酵组的氨基酸态氮在36h～72h的时候一直高于其他组，混合发酵组的风味评分在48h之后一直高于其他组，在60h时感官评分达到最高。
微生物发酵剂的选择是决定发酵制品质量好坏的关键因素之一。发酵菌种必须对人体无害，具体内容包括：必须是革兰氏阳性菌，无致病性；不产生生物胺，有些细菌具有氨基酸脱羧能力，能够代谢氨基酸生成生物胺，组胺可能会引起过敏性反应，腐胺、尸胺造成产品的腐败变质，影响风味和感官品质；乳酸菌要能够快速产生乳酸，降低pH，抑制TVBN的升高和腐败微生物的生长及产毒；降低亚硝酸盐残留，减少亚硝胺生成；能产生H2O2还原酶，把生成的H2O2分解成H2O和O2，防止微生物可能形成的H2O2导致产品变灰发暗，使用单菌种发酵时，此菌必须为接触酶阳性菌株；若为复配菌种发酵，其中必须有接触酶阳性菌株存在；发酵副产物不产生异味、不得有大量气体产生，若在发酵过程中产生气体会影响到产品的结构致密性，也影响到产品的贮藏，过氧化氢、氨等还会影响产品的感官和风味；发酵剂不得有粘液生成。某些菌类的代谢产物中有粘液状物质，同样也会损坏产品组织状态；可分解脂肪和蛋白质释放出脂肪酸、脂肪酸和肽类，改善产品的品质、提高产品营养；优良发酵剂要能与其他发酵菌种共存或与其它菌种产生协同效果。
选育优良的微生物菌种作为发酵剂是发酵工艺的关键，从传统发酵食品中筛选微生物发酵剂，接种发酵生产传统产品，不仅在风味上保持了传统产品的特色，而且更适合现代化工业生产，提高了终产品的营养价值、安全性和质量稳定性。发酵微生物种类包括乳酸菌、微球菌、葡萄球菌、霉菌、酵母，从传统发酵制品中分离出来很多微生物发酵剂。它们对发酵制品的风味品质和安全性发挥了各自独特的作用。目前，纯微生物发酵剂已广泛应用于水产发酵制品中，通过发酵剂的优良特性来提高产品的食用品质，或提高制品的安全性。
乳酸菌、酵母菌、葡萄球菌在发酵河鲀鱼子中所发挥的作用不同，它们所产生的酶系也不同，复合发酵中菌种不同配比对鱼子品质以及风味的形成有重要的影响。乳酸菌能分解碳水化合物成乳酸，降低pH值，抑制腐败菌和致病菌的生长繁殖，对产品的质量稳定性起决定作用，酵母菌、葡萄球菌具有分解蛋白质和脂肪以及产生过氧化氢酶的能力，对产品的色泽和风味起决定作用，乳酸菌数量较多时，产生乳酸较多，pH值下降迅速，抑制酵母菌和葡萄球菌的生长，使鱼子蛋白质和脂肪分解不足，鱼子风味不佳，若乳酸菌相对数量不足，腐败菌得不到有效抑制，并且酵母菌产生的酒精会降低乳酸菌的活性。
(3)河鲀鱼子发酵
选择1∶2∶2菌种配比作为混合发酵菌株；1∶2∶2菌种配比的OD值最大感官评分最高，亚硝酸盐含量低，氨基酸态氮含量高；选择13％-15％接种量，氨基酸态氮含量高，感官评分高，亚硝酸盐含量少；温度可以选择34℃-37℃，氨基酸态氮含量高，感官评分高，亚硝酸盐含量低；选择60h-72h的发酵时间，氨基酸态氮含量高，感官评定分值高，亚硝酸盐含量低；选择加盐量为0％-1.5％，1.5％的加盐量氨基酸态氮、感官评分最高，0％的加盐量亚硝酸盐含量最低。
制作流程为：鱼子解冻、定形脱血→脱囊衣→脱毒→脱碱脱腥→减菌漂洗→沥水→接菌发酵→真空包装→灭菌；
具体操作方法如下：
(1)鱼子解冻、定形脱血：盐水解冻，在10℃，盐溶液浓度依次4％，6％，10％，定形30min，同时不断的按照同一方向轻轻搅拌；
(2)脱囊衣：将步骤(1)解冻定形脱血的鱼卵手动脱囊衣；
(3)脱毒：将步骤(2)脱囊衣的鱼卵放于脱毒剂中脱毒，一直按照同一方向搅拌，使鱼卵均匀分布在脱毒剂中；所述脱毒剂为碳酸钠，占鱼卵的重量分数为2％；
(4)脱碱脱腥：选择柠檬酸和半胱氨酸的混合液脱碱脱腥同时抗氧化，在上述步骤(3)脱毒后的溶液中加入柠檬酸和半胱氨酸混合液，柠檬酸占鱼卵的重量分数为5％，半胱氨酸占鱼卵的重量分数为3％，按照一个方向搅拌，使鱼卵均匀分布在液体中；
调节固液比为1∶3，温度15℃下处理3h-5h，不仅使鱼子达到无毒水平，并且感官评分最高。
(5)减菌漂洗：将步骤(4)脱碱脱腥后的溶液用臭氧水漂洗2次后，用清水再快速漂洗两次，沥水；
(6)接菌发酵：将筛选的发酵菌液加入到处理好的鱼子中，搅拌均匀，发酵；
(7)真空包装：将发酵成熟的鱼子放入耐高温的包装袋中，真空包装；
(8)灭菌：121℃，20min；毒素在这个温度下不稳定，灭菌同时还能破坏可能存在的极微量河鲀毒素。
优选地，所述步骤(6)的接种量为14％、发酵温度为35℃、发酵时间为65h，此时河鲀发酵鱼子的品质最好，亚硝酸盐含量为0.331mg/kg，氨基酸态氮含量为0.711g/100g，感官评分为93.5分，鱼子酱品质最佳，这表明理论值和实际值之间具有良好的拟合性，优化模型可靠。
水产品蛋白质丰富，蛋白质在发酵过程降解生成多肽或者形成氨基酸等，氨基酸是多官能团的分子能与多种味觉受体作用，味感丰富。游离氨基酸还是很多风味物质的前体，对挥发性芳香成分的构成也有贡献。它的提高可以改善产品的整体风味，支链氨基酸可产生香甜味、麦芽味和果香味；芳香族氨基酸可产生花香味和苦味；含硫氨基酸可产生发酵味、马铃薯味和大蒜味；苯丙氨酸可产生焦糖味；天门冬氨酸可产生黄油味；半胱氨酸可产生麦粉味；赖氨酸可产生烤马铃薯味，不同的氨基酸组成形成复杂味道赋予产品特殊的风味。天然蛋白质中的氨基酸都属L型，L型氨基酸及其盐大多具有甜味或苦味，少数几种具有鲜味或酸味。游离氨基酸不仅是重要滋味物质，其在发酵过程中后继参加的化学反应产生香味物质赋予产品独特的风味。
本发明首先按照自然发酵方法制作河鲀样品，对发酵过程中微生物菌相变化进行动态分析，同时按照优良发酵剂的标准从中筛得入选微生物菌株，对这些菌株的发酵性能进行检测和比较，确定河鲀鱼子发酵用菌株，优化接菌发酵工艺条件，研究河鲀发酵鱼子游离氨基酸、游离脂肪酸以及挥发性风味的变化，从而研制出了具有独特风味，高营养、高安全性，符合中国人饮食心理等特点的优质发酵鱼子。
鱼子中混合菌种的加入量尤为重要，一定范围内，接种量多，可以缩短发酵剂在鱼子中达到稳定期的时间，产物合成提前，蛋白酶、脂肪酶产量增多，pH值可以较快下降，能有效缩短鱼子发酵过程，充分发酵鱼子并且迅速成为鱼子中的优势菌群，抑制杂菌生长；反之，接种量少，会延缓发酵进程，但是，接种量过大，菌种生长过快，也会影响产品的感官品质。食盐不是鱼子中的营养物质，一定浓度的食盐亦能有效抑制发酵中的杂菌。此外，盐浓度的高低也间接影响蛋白酶的活力，食盐能够和氨基酸共同作用赋予产品良好的鲜味，盐含量的变化对脂类物质的水解和氧化也产生一定的影响。发酵温度的高低不仅影响酶活力，也间接的影响着发酵菌株的生长性能和产品风味品质的形成。发酵时间对产品的品质影响也较大，发酵过长易产酸过多，酸味过重，甚至过度发酵导致变质，影响口感、质地和安全品质；发酵过短则使微生物发酵剂无法充分作用于产品，不能有效分解蛋白质和脂肪等物质，导致风味欠佳。
1∶2∶2菌种配比的混合发酵剂OD值最高，并且氨基酸态氮含量高、感官评分高、亚硝酸盐含量低，作为混合发酵菌株最佳比例。
单因素分析时，最佳接种范围是13％-15％，最佳发酵温度范围是34℃-37℃，最佳发酵时间范围是60h-72h，1.5％的加盐量氨基酸态氮、感官评分最高，0％的加盐量亚硝酸盐含量最低。接种量、发酵温度、发酵时间对氨基酸态氮含量、感官评分、亚硝酸盐含量相关性显著可作为响应面分析的因素。
通过响应面分析最佳结果是接种量14％、发酵温度35℃、发酵时间65h，河鲀发酵鱼子的品质最好，亚硝酸盐含量为0.331mg/kg，氨基酸态氮含量为0.711g/100g，感官评分为93.5分，鱼子酱品质最佳。
本发明中所用原料均为本领域生产中常用原料，均可从市场中得到，且对于生产结果不会产生影响；本发明中所采用的各种设备，均为本领域生产工艺中使用的常规设备，且各设备的操作、参数等均按照常规操作进行，并无特别之处。