本发明涉及水产微生态制剂，具体是涉及植物乳酸杆菌在对虾养殖中的应用及应用方法。
背景技术：
：植物乳酸杆菌，革兰氏阳性细菌，是乳酸菌的一种。菌种为圆端直杆状，不产芽孢，兼性厌氧，常作为活菌饲料添加剂。目前植物乳酸杆作为活菌饲料添加剂，在对虾养殖中的使用方式多为菌液直接拌入对虾配合饲料中，再经4℃阴干后投喂对虾。由于对虾与鱼类等其他水产动物相比，肠道较短，代谢较快，植物乳酸杆菌还没有来得及定植在肠道发挥作用，即被排到体外，难以发挥功效，亦造成浪费。另外，菌液还必需4℃冷藏保存，造成了生产成本较高和运输不方便，限制了植物乳酸杆菌活菌饲料添加剂的应用。技术实现要素：本发明克服了现有技术中植物乳酸杆菌活菌饲料添加剂在对虾养殖中的使用方法不足以及菌液冷藏保存导致的生产成本较高和运输不方便的缺陷，提出了一种有效提高植物乳酸杆菌在对虾养殖中的使用方法。本发明采用植物乳酸杆菌破碎物的使用方式，有利于植物乳酸杆菌饲料添加剂在对虾养殖的应用和普及。同时本发明发现植物乳酸杆菌的破碎物在对虾养殖中的一种使用方式能够有效提高对虾饲料的利用率，显著提高了对虾消化酶活性，增强免疫力，增大对虾肠上皮细胞厚度，促进对虾生长与成活，其效果更优于植物乳酸杆菌活菌。本发明的目的在于提供植物乳酸杆菌在对虾养殖中的应用及应用方法。本发明所采取的技术方案是：一种对虾饲料添加剂的制备方法，将植物乳酸杆菌菌体超声粉碎，即可获得对虾饲料添加剂。一种对虾饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：1)将植物乳酸杆菌菌液离心，分离得到植物乳酸杆菌菌体沉淀；2)离心得到的菌体沉淀用灭菌生理盐水迅速洗涤干净，离心去上清，再用与菌体沉淀相同体积的灭菌生理盐水重悬植物乳酸杆菌菌体沉淀，即为菌悬液；3)菌悬液灭活和破碎：将菌悬液经过60～70℃水浴处理25～35min后，用超声波破碎仪超声粉碎至没有完整的存活的菌体，得植物乳酸杆菌破碎物制剂，即对虾饲料添加剂。进一步的，步骤1)所述离心的转速为3800～4200r/min，离心时间为18～22min。进一步的，步骤2)所述灭菌生理盐水浓度为0.85％w/v。进一步的，步骤3)所述水浴温度为65℃，水浴处理时间为30min。进一步的，步骤3)所述超声波破碎仪超声粉碎时的条件参数为：在2kHz条件下，每处理2min，间隔1min，共超声粉碎30min。一种对虾养殖饲料，将上述制备的对虾饲料添加剂按体积质量比(0.5～1)mL：100g拌入现有对虾饲料中，即得对虾养殖饲料。一种植物乳酸杆菌在对虾养殖中的使用方法，包括以下步骤：1)将植物乳酸杆菌菌液离心，分离得到植物乳酸杆菌菌体沉淀；2)离心得到的菌体沉淀用灭菌生理盐水迅速洗涤干净，离心去上清，再用与菌体沉淀相同体积的灭菌生理盐水重悬植物乳酸杆菌菌体沉淀，即为菌悬液；3)菌悬液灭活和破碎：将菌悬液经过60～70℃水浴处理25～35min后，用超声波破碎仪超声粉碎至没有完整的存活的菌体，得植物乳酸杆菌破碎物制剂；4)将上述植物乳酸杆菌破碎物制剂直接拌入现有对虾饲料中，植物乳酸杆菌破碎物制剂与对虾饲料的用量比为(0.5～1)mL：100g，将拌有植物乳酸杆菌破碎物制剂的对虾饲料按常规的饲喂方法对对虾进行饲喂，即可。进一步的，步骤2)所述灭菌生理盐水浓度为0.85％w/v。进一步的，步骤3)所述超声波破碎仪超声粉碎时的条件参数为：在2kHz条件下，每处理2min，间隔1min，共超声粉碎30min本发明的有益效果是：本发明提供一种植物乳酸杆菌在对虾养殖中的使用方法，经本发明方式处理后制备的植物乳酸杆菌破碎物制剂，无需4℃冷藏，常温保存即可，方便运输和使用。将其作为饲料添加剂拌料投喂，能显著降低饲料系数，显著提高对虾消化酶活性、增大对虾肠上皮细胞厚度、促进对虾的生长与成活，且其效果更优于植物乳酸杆菌活菌。附图说明图1为投喂不同饲料对凡纳滨对虾肠道组织形态结构的影响，SCE：肠上皮细胞；标尺＝25μm。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1一种对虾饲料添加剂的制备方法1)将植物乳酸杆菌菌液(浓度109CFUmL-1，欣海利生生物科技有限公司)进行4000r/min离心20分钟，分离得到植物乳酸杆菌菌体沉淀。2)离心得到的菌体沉淀用浓度为0.85％w/v灭菌的生理盐水迅速洗涤两次，离心去上清，再用与菌体沉淀相同体积的生理盐水重悬植物乳酸杆菌菌体沉淀，即为菌悬液。3)菌悬液经过水浴锅65℃处理30min后，用超声波破碎仪在2kHz条件下，每处理2min，间隔1min，超声粉碎30min，并在显微镜下检查没有完整的存活的菌体，即为植物乳酸杆菌破碎物制剂，即对虾饲料添加剂。实施例2一种对虾饲料添加剂的制备方法1)将植物乳酸杆菌菌液(浓度109CFUmL-1，欣海利生生物科技有限公司)进行3800r/min离心18分钟，分离得到植物乳酸杆菌菌体沉淀。2)离心得到的菌体沉淀用浓度为0.85％w/v灭菌的生理盐水迅速洗涤两次，离心去上清，再用与菌体沉淀相同体积的生理盐水重悬植物乳酸杆菌菌体沉淀，即为菌悬液。3)菌悬液经过水浴锅60℃处理35min后，用超声波破碎仪在2kHz条件下，每处理2min，间隔1min，超声粉碎30min，并在显微镜下检查没有完整的存活的菌体，即为植物乳酸杆菌破碎物制剂，即对虾饲料添加剂。实施例3一种对虾饲料添加剂的制备方法1)将植物乳酸杆菌菌液(浓度109CFUmL-1，欣海利生生物科技有限公司)进行4200r/min离心22分钟，分离得到植物乳酸杆菌菌体沉淀。2)离心得到的菌体沉淀用浓度为0.85％w/v灭菌的生理盐水迅速洗涤两次，离心去上清，再用与菌体沉淀相同体积的生理盐水重悬植物乳酸杆菌菌体沉淀，即为菌悬液。3)菌悬液经过水浴锅70℃处理35min后，用超声波破碎仪在2kHz条件下，每处理2min，间隔1min，超声粉碎30min，并在显微镜下检查没有完整的存活的菌体，即为植物乳酸杆菌破碎物制剂，即对虾饲料添加剂。实施例4一种对虾养殖饲料将上述实施例1制备的对虾饲料添加剂按体积质量比(0.5～1)mL：100g拌入现有对虾饲料中，即得对虾养殖饲料。实施例5一种植物乳酸杆菌在对虾养殖中的使用方法1)将植物乳酸杆菌菌液(浓度109CFUmL-1，欣海利生生物科技有限公司)进行4000r/min离心20分钟，分离得到植物乳酸杆菌菌体沉淀。2)离心得到的菌体沉淀用浓度为0.85％w/v灭菌的生理盐水迅速洗涤两次，离心去上清，再用与菌体沉淀相同体积的生理盐水重悬植物乳酸杆菌菌体沉淀，即为菌悬液。3)菌悬液经过水浴锅65℃处理30min后，用超声波破碎仪在2kHz条件下，每处理2min，间隔1min，超声粉碎30min，并在显微镜下检查没有完整的存活的菌体，即为植物乳酸杆菌破碎物制剂。4)将上述植物乳酸杆菌破碎物制剂直接拌入现有对虾饲料中，植物乳酸杆菌破碎物制剂与对虾饲料的用量比为(0.5～1)mL：100g，将拌有植物乳酸杆菌破碎物制剂的对虾饲料按常规的饲喂方法对对虾进行饲喂，即可。下面对含有本发明植物乳酸杆菌破碎物制剂的对虾饲料作进一步的效果检测。实验方法：实验结果数据均以平均值±标准误表示，应用SPSS22.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，进行Duncan多重比较分析组间差异，P＜0.05表示差异显著。配制以下三种对虾饲料：饲料CG：对虾配合饲料；饲料LB：在配合饲料中拌入1％v/w植物乳酸杆菌菌液(浓度109CFUmL-1，欣海利生生物科技有限公司)；即每100g配合饲料中加入1mL植物乳酸杆菌菌液。饲料CE：在配合饲料中拌入1％v/w实施例1制备的植物乳酸杆菌破碎物制剂(即对虾饲料添加剂)。以上述的对虾配制饲料，喂养初始体质量为7.0-8.0g的凡纳滨对虾15天。于室内玻璃纤维桶(800L)中分组进行，每个桶里100尾虾，每组饲料3个平行。饲料投喂量为对虾体质量4％。养殖过程中根据对虾吃食情况适当调整饲料用量，以饱食为准，及时清除残饵和粪便。养殖实验持续15天。实验期间盐度30-32；水温23-27℃；溶解氧6.8-7.0mg/L；NH4–N0.3-0.4mg/L；每天换水10％，全天气石充气。实验结果：(1)生长性状检测结果养殖效果见表1。与对照组(饲料CG)相比，饲料中拌入植物乳酸杆菌的菌液和破碎物，都能促进对虾的生长。特别地，拌入植物乳酸杆菌破碎物制剂(饲料CE)显著高于其他组，与对照组(饲料CG)和菌液组(LB)相比，增重率分别提高了49.81％、19.68％。上述结果说明在饲料中加入本发明制备的植物乳酸杆菌破碎物制剂(即对虾饲料添加剂)，比植物乳酸杆菌菌液更有利于提高对虾的生长率、增重率。表1投喂不同饲料的凡纳滨对虾养殖效果同行数据(平均值±标准误)上标字母不同者之间表示存在显著性差异(P＜0.05)。(2)消化酶活性检测结果养殖实验结束时，每个桶随机取5尾虾，分别取肝胰腺和肠道组织，液氮冷冻处理后保存于-80℃直至消化酶分析。淀粉酶：组织中每mg蛋白在37℃与底物作用30min，水解10mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位；脂肪酶：37℃条件下，每g组织蛋白与底物反应1min，每消耗1μmol底物为1个脂肪酶活力单位；胃蛋白酶：每mg组织蛋白37℃每min分解蛋白生成1μg氨基酸相当于1个胃蛋白酶活力单位；组织蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法。消化酶活性和组织总蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。肝胰腺和肠道的消化酶活性分析分别见表2和表3。饲料LB组和CE组的对虾肝胰腺和肠道淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，从总体上看，以饲料CE组对虾的肝胰腺和肠道的消化酶活性效果最为明显，其消化酶活性比饲料LB组的更高。上述结果说明在饲料中加入本发明制备的植物乳酸杆菌破碎物制剂(即对虾饲料添加剂)，比植物乳酸杆菌菌液更有利于提高对虾肝胰腺和肠道的消化酶活性。表2投喂不同饲料的凡纳滨凡纳滨对虾肝胰腺消化酶活性(U/mgprot)的变化同行数据(平均值±标准误)上标字母不同者之间表示存在显著性差异(P＜0.05)。表3投喂不同饲料的凡纳滨凡纳滨对虾肠道消化酶活性(U/mgprot)的变化同行数据(平均值±标准误)上标字母不同者之间表示存在显著性差异(P＜0.05)。(3)肠道黏膜的组织学观察养殖实验结束时，每个桶随机取3尾虾的中肠，Bouin液固定后，用于肠道黏膜的组织学观察。取经Bouin液固定后的对虾中肠样品，流水冲洗，梯度乙醇逐步脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5μm，HE染色，封片后自然风干。ZEISSAxioScope.A1型光学显微镜观察和拍照，每个重复组随机选取5张400倍下的组织切片，使用ImageProPlus6.0软件对图片进行校准，测量肠上皮细胞厚度，肠上皮细胞厚度测定从柱状上皮细胞的顶部到基部的垂直距离。凡纳滨对虾肠道的组织切片和肠上皮厚度分别见图1和表4。从图1中可以看出，饲料CE组对虾肠道形态较其他两组完整，肠壁由内向外分层清晰，依次为单层柱状上皮细胞、结缔组织、肌层和结缔组织；肠上皮细胞紧密连接，未见明显的上皮细胞脱落，细胞游离面的微绒毛排列整齐、致密。细胞间紧密连接具有重要的机械屏障作用，既保持了机体的选择性吸收的机制，又可防止病原菌等进入肠腔。从表4中可以看出，投喂饲料CE组对虾的肠上皮细胞厚度均显著高于对照组和饲料LB组，(P＜0.05)。肠上皮细胞是肠道内主要的功能性细胞，参与肠道食物的消化、吸收和内外分泌。肠上皮细胞增厚，增加了食物接触的时间，提高了机体对食物的消化吸收，从而促进了机体的生长。表4投喂不同饲料对凡纳滨对虾肠上皮细胞厚度的影响组别CGLBCE肠上皮厚度17.71±0.46a19.44±0.54a25.67±0.81b同行数据(平均值±标准误)上标字母不同者之间表示存在显著性差异(P＜0.05)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3