本发明涉及食品加工领域，特别涉及一种具有降血糖和通便功能的桑椹微生物复合制剂的制备方法。
背景技术：
桑椹是桑树的成熟果实，果肉多汁、滋味甘美，是水果中的珍品。自古以来就作为水果和中药材应用，药食兼用，营养丰富，被誉为“第三代水果”，现已被国家卫生部列入“既是食品又是药品”的名单。传统中医认为，桑椹味甘，性寒，入肝、脾、肾三经，具有生津止渴、补肝益肾、滋阴补血、明目安神、利五脏、去风湿、解酒等功效，可用于消渴、水肿胀满、血虚肠燥、便秘、失眠健忘等，长期食用桑椹可以延年益寿。
桑椹中的多羟基生物碱和酚类物质已证实是良好的降血糖功能因子，但是桑椹属浆果类水果，其含有较高含量的碳水化合物，从而限制了其在糖尿病食品中的广泛应用。
到目前为止，还未发现有将酵母和益生菌结合发酵，从而能将桑椹中的碳水化合物完全降解，且能实现通便功能的桑椹微生物复合制剂，并将该复合制剂用作降血糖和具有通便功能食品的基料的相关报道。
技术实现要素：
为了克服现有技术中存在的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种具有降血糖和通便功能的桑椹微生物复合制剂的制备方法。
本发明采用以下技术方案来实现本发明的目的：
一种具有降血糖和通便功能的桑椹微生物复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
a）取新鲜桑椹，进行胶体磨湿法超微粉碎，灭菌后，得到桑椹全浆；
b）将得到的桑椹全浆接种益生菌进行发酵，得到益生菌活菌数为107~108CFU/mL的桑椹发酵原液；
c）将得到的桑椹发酵原液再接种酵母菌，同时进行酵母和益生菌发酵，得到益生菌活菌数为108~109CFU/mL的桑椹发酵液；
d）将得到的桑椹发酵液进行喷雾冷冻干燥，益生菌活菌数达到106~107CFU/g的低糖型桑椹微生物复合制剂。
其中，步骤a）中，所述胶体磨湿法超微粉碎的工艺为：胶体磨缝隙大小为5~25μm，研磨2~5次，单位处理量3000~5000g/min。
其中，步骤a）中，所述灭菌的工艺为：在温度121℃，高压蒸汽灭菌30min。
其中，步骤b）中，所述益生菌为肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，所述发酵的工艺为：益生菌的接种量为2~5×106CFU/mL，发酵时间72~96h，发酵温度25~35℃，发酵pH5.5~6.5。
其中，步骤c）中，所述酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae；所述益生菌为肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides；所述发酵的工艺为：酵母的接种量为105~106CFU/mL，发酵时间10~15h，发酵温度30~35℃，发酵pH5.5~6.5。
其中，步骤d）中，所述喷雾冷冻干燥的工艺为：干燥温度为-40~-30℃，干燥时间为15~20h。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1）本发明通过采用特定的酵母和特定的益生菌进行结合发酵，能将桑椹中的碳水化合物完全降解并对其降血糖功能因子进行富集，从而适宜作为降血糖食品基料进行开发；同时结合益生菌对维持人体肠道、生殖系统微生态平衡所产生的健康功效和发挥有益作用的活性，利用益生菌的摄入改善人体肠胃功能、治疗消化功能紊乱，肠吸收不良及感染性疾病等，从而增强桑椹微生物复合制剂的通便功能。
2）本发明采用胶体磨湿法超微粉碎制备得到桑椹全浆，能够达到充分破碎，从而保证后期进行微生物发酵能够完全降解桑椹全浆中的葡萄糖和果糖。
3）本发明的桑椹微生物复合制剂，采用喷雾冷冻干燥，能够有效保留益生菌的存活率、并有效地避免了桑椹中降血糖功能因子的变化，保障了产品的营养品质，将其应用到预防糖尿病的食品或保健食品中，能够起到明显降血糖功效。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
各项性能测试标准或方法：
脱氧野尻霉素的测试方法：
桑椹全浆和0.05 mol/L盐酸溶液以1:1（体积比）混合均匀，超声30 min，8000 r/min离心10 min，取上清液，备用，进行衍生化处理。
脱氧野尻霉素衍生化操作过程如下：取上清液140 μL于2 mL离心管中，加入0.4 mol/L硼酸钾缓冲液（pH 8.5）169 μL，再加入5 mmol/L的衍生化试剂FMOC-Cl(溶于乙腈中)250 μL，混匀，25 ℃下恒温反应20 min，加入1 mol/L甘氨酸25 μL中和剩余的FMOC-Cl以终止反应，再加1%（v/v）的醋酸66 μL，用超纯水加至707 μL，最后于0.22 μm滤膜过滤，用于HPLC分析。
色谱条件为： ZORBAX SB-C18色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.1 %醋酸，流动相C为乙腈（40:60，v/v），等度洗脱25 min，进样量20 μL，流速1 mL/min，检测器为DAD紫外检测器，检测波长254 nm，柱温30 ℃。
多酚的测试方法：
采用福林酚比色法进行测定。准确称取适量样品，用60 %乙醇（pH 5.5）超声提取27 min，离心，去上清液，重复提取三次，合并上清液，用60 %乙醇（pH 5.5）定容到50 mL，摇匀，4 ℃保存备测。将提取液用蒸馏水稀释到适宜浓度，在10 mL试管中分别加入1 mL稀释样品液，1 mL Folin-Ciocalteau试剂和2 mL 10 %碳酸钠溶液，混匀，于25 ℃下避光反应60 min后，测定OD（765 nm）值。以焦性没食子酸（5、10、20、30、45mg/L）作为标准样品，采用外标法测定多酚含量。
单糖（葡萄糖和果糖）降解率的测试方法：
将待测桑椹样品用适量无水乙醇超声提取30 min，8000 r/min下离心10 min，0.22 μm滤膜过滤后用于HPLC分析。色谱条件为：Shodex Asahipak NH2P-504E色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃；蒸发光检测器进行检测，ELSD漂移管温度为40 ℃；流动相为75%乙腈，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。以葡萄糖（1、5、10、15、20、25 mg/mL）和果糖（1、5、10、15、20、25mg/mL）作为标准品，采用外标法定量分析单糖（葡萄糖和果糖）的含量。葡萄糖和果糖降解率计算公式如下：
益生菌活菌数的测试方法：
采用稀释倒平板法，参考GB 4789.35-2010中乳酸菌菌落总数的测定方法。
实施例1
一种具有降血糖和通便功能的桑椹微生物复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
a）取新鲜桑椹，进行胶体磨湿法超微粉碎，所述胶体磨湿法超微粉碎的工艺为：胶体磨缝隙大小为15μm，研磨4次，单位处理量4000g/min，在温度121℃，高压蒸汽灭菌30min后，得到桑椹全浆；
b）将得到的桑椹全浆接种肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides在接种量为4×106CFU/mL，发酵温度30℃，发酵pH6.0进行发酵84h，得到益生菌活菌数为8.2×107CFU/mL的桑椹发酵原液；
c）将得到的桑椹发酵原液再接种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，同时进行酵母和肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides发酵，在酵母的接种量为106CFU/mL，发酵温度32℃，发酵pH6.0进行发酵13h，得到益生菌活菌数为8.5×108CFU/mL的桑椹发酵液；
d）将得到的桑椹发酵液在干燥温度为-35℃进行喷雾冷冻干燥17h，得到益生菌活菌数达到7.7×106CFU/g的桑椹微生物复合制剂。
实施例2
一种具有降血糖和通便功能的桑椹微生物复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
a）取新鲜桑椹，进行胶体磨湿法超微粉碎，所述胶体磨湿法超微粉碎的工艺为：胶体磨缝隙大小为5μm，研磨5次，单位处理量5000g/min，在温度121℃，高压蒸汽灭菌30min后，得到桑椹全浆；
b）将得到的桑椹全浆接种肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides在接种量为2×106CFU/mL，发酵温度35℃，发酵pH6.5进行发酵72h，得到益生菌活菌数为1.5×107CFU/mL的桑椹发酵原液；
c）将得到的桑椹发酵原液再接种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，同时进行酵母和肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides发酵，在酵母的接种量为105CFU/mL，发酵温度35℃，发酵pH6.5进行发酵10h，得到益生菌活菌数为1.7×108CFU/mL的桑椹发酵液；
d）将得到的桑椹发酵液在干燥温度为-40℃进行喷雾冷冻干燥15h，得到益生菌活菌数达到2.1×106CFU/g的桑椹微生物复合制剂。
实施例3
一种具有降血糖和通便功能的桑椹微生物复合制剂的制备方法，包括以下步骤：
a）取新鲜桑椹，进行胶体磨湿法超微粉碎，所述胶体磨湿法超微粉碎的工艺为：胶体磨缝隙大小为25μm，研磨2次，单位处理量3000g/min，在温度121℃，高压蒸汽灭菌30min后，得到桑椹全浆；
b）将得到的桑椹全浆接种肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides在接种量为5×106CFU/mL，发酵温度25℃，发酵pH5.5进行发酵96h，得到益生菌活菌数为108CFU/mL的桑椹发酵原液；
c）将得到的桑椹发酵原液再接种酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，同时进行酵母和肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides发酵，在酵母的接种量为105CFU/mL，发酵温度30℃，发酵pH5.5进行发酵15h，得到益生菌活菌数为109CFU/mL的桑椹发酵液；
d）将得到的桑椹发酵液在干燥温度为-30℃进行喷雾冷冻干燥20h，得到益生菌活菌数达到8.5×106CFU/g的桑椹微生物复合制剂。
对比例1：
步骤a）：采用现有方法的榨汁机机械破碎得到桑椹全浆；
其它同实施例1。
对比例2：
无步骤c），其它同实施例1。
对比例3：
步骤d），采用现有方法的热泵干燥进行干燥；
其它同实施例1。
表1 实施例1-3及对比例1-3制备得到的桑椹微生物复合制剂的性能指标测试结果
评价实施例1-3及对比例1-3的桑椹微生物复合制剂的降血糖活性和通便功能
一、通过DM（diabetes mellitus，糖尿病）小鼠体内试验评价制备得到实施例1-3及对比例1-3的桑椹微生物复合制剂的降血糖活性
通过对DM小鼠30天内血糖变化观察发现，与模型组相比，前10天，各组DM小鼠血糖值均无明显差异（P >0.05）；第20天时，桑椹微生物复合制剂各组和拜糖平组小鼠的血糖值均显著降低（P <0.05），明显低于模型组；第30 天实验结束时，各给药组小鼠血糖水平均显著低于模型组（P <0.05），其中，实施例1-3小鼠血糖水平下降要好于对比例1-3，但差异不显著（P >0.05）。
实验结果表明，通过本发明所述方法制备得到的桑椹微生物复合制剂对链脲佐菌素（STZ）诱异的DM小鼠具有良好的降血糖作用。
表2
注:表中不同小写字母表示两者之间在0.05水平上有显著差异。
二、通过小鼠排便试验评价制备得到实施例1-3及对比例1-3桑椹微生物复合制剂的通便功能。
（1）试验分组 试验分空白对照组、模型对照组、阳性对照组（酚酞片，剂量为2.5 mg/(kg·bw)）、实施例1-3及对比例1-3（剂量为1g/(kg·bw)），每组10只小鼠。
（2）模型建立 每天灌胃1次，连续7d。第7天在禁食16 h后除空白对照组给蒸馏水外，每只小鼠灌胃给予模型剂复方地芬诺酯10 mg /(kg·bw)。
（3）指标测定 给予模型剂30min后，空白对照组和模型对照组给予墨汁糊20mL/(kg·bw)；实施例1-3及对比例1-3组给予用墨汁糊稀释的桑椹微生物复合制剂。小鼠单笼放置，恢复饮食、饮水。给予墨汁糊后开始计时，连续6 h，记录每只小鼠第一粒黑便排出时间、6 h排黑便粒数和黑便总重量。
表 3
通过对小鼠排便试验观察发现，与模型组相比，实施例1-3及对比例1-3桑椹微生物复合制剂组和阳性对照组小鼠的第一粒黑便排出时间延长及黑便总重量减轻明显，差异显著(P <0.05) ；与空白组和阳性对照组相比，实施例1-3及对比例1-3桑椹微生物复合制剂组小鼠的第一粒黑便排出时间延长及黑便总重量减轻不明显 ( P >0.05)，说明桑椹微生物复合制剂排便功效与酚酞片相当，且能显著改善便秘模型组小鼠的通便情况，同时实施例1-3通便效果要好于对比例1-3桑椹微生物复合制剂组，但差异不显著（P >0.05）。
实验结果表明，通过本发明所述方法制备得到的桑椹微生物复合制剂具有通便功能。