本发明属于功能食品加工领域，特别涉及一种具有肝脏保护作用的活性成分及其提取方法和应用。
背景技术：
肝脏是机体的一项重要器官，具有合成、分泌、排泄、解毒、免疫和生物转化等多种生理功能。肝损伤是临床上一类常见的危害人类健康的疾病，肝损伤的常见病因有病毒感染、饮酒过多、脂肪堆积、环境污染，可以分为免疫性肝损伤、酒精性肝损伤和药物性肝损伤等。免疫性肝损伤主要与机体免疫应答有关，是先天性免疫和获得性免疫失衡的结果，是肝纤维化、肝硬化乃至肝脏肿瘤等终端病变发生的重要因素。目前，对免疫性肝损伤的治疗手段主要有1、免疫调节剂如地塞米松；2、护肝降酶类药物如联苯双酯等；3、中草药和生物活性成分，如黄酮、皂苷类。
胎盘是哺乳类胎生动物在妊娠过程中，胎儿与母体之间进行物质交换以保证胚胎生长的特殊器官，在分娩时排出体外。研究表明胎盘是一种营养丰富且具备多种生物活性的优质资源。哺乳动物胎盘中具有的活性成分主要有生物活性多肽、氨基酸、细胞因子、胶原蛋白、激素、免疫球蛋白、酶、微量元素、维生素等，在我国，人胎盘作为一种传统中药“紫河车”使用，已经具有近千年的历史。目前关于胎盘提取物功能的报导主要有护肝作用、免疫调节作用、促进组织伤口愈合、抗氧化、抗炎症等，广泛应用于医药、功能性食品和化妆品领域。
在日本，人胎盘提取物作为一种治疗肝脏疾病的药物已经有40多年的历史。但人胎盘来源有限，而羊胎盘来源广泛，目前有许多具有免疫调节作用的羊胎盘保健品，表明其具有明确的免疫调节功能，但关于羊胎盘与肝脏保护的作用尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有肝脏保护作用的活性成分及其提取方法和应用，所述活性成分提取自羊胎盘，可有效阻止刀豆蛋白a引起肝脏指数的升高，可降低血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平和乳酸脱氢酶的升高，同时减缓肝脏病理改变，对于肝损伤具有保护作用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种具有肝脏保护作用的活性成分，所述活性成分提取自羊胎盘，为羊胎盘水溶性成分。
进一步的，所述活性成分的成分组成包括水分、蛋白质、脂肪、灰分和总碳水化合物，各成分的重量分数比为：
所述的具有肝脏保护作用的活性成分的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜羊胎盘，去除多余的结缔组织和脂肪，在水中彻底清洗干净，沥干水分，剪成小块；
2)将步骤1)得到的羊胎盘小块置于缓冲液中，低温提取1～2h，离心处理后取上清液；
3)将步骤2)得到的上清液经透析处理，去除上清液中的缓冲液残留，得到提取液；
4)将步骤3)得到的提取液经真空冷冻干燥处理，收集冻干粉，即得到所述的具有肝脏保护作用的活性成分。
进一步的，步骤2)中所述的缓冲液为0.01m的pbs缓冲液，其ph值为7.4。
进一步的，步骤2)中所述离心处理的条件为：5000r/min离心15min。
进一步的，步骤3)中所述透析处理的条件为：1000da的透析袋，在4℃条件下搅拌透析24h，每隔2h换水一次。
进一步的，所述活性成分可应用于治疗肝脏疾病药物的制备。
进一步的，所述活性成分可应用于保肝护肝类保健食品的制备。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明所述的具有肝脏保护作用的活性成分，提取自羊胎盘，相比于人胎盘，羊胎盘的来源更加广泛，价格低廉，大大降低了原料成本；
2、通过多方面实验验证，本发明所述的具有肝脏保护作用的活性成分，可有效阻止肝脏指数的升高，可降低血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平和乳酸脱氢酶的升高，同时，对于肝损伤具有保护作用。
3、本发明所述的具有肝脏保护作用的活性成分，能够作为病毒性肝炎、自身性免疫肝病等病人的辅助治疗食品或药品的一种来源，起到辅助治疗疾病的目的。
附图说明
图1为肝脏指数检测结果示意图；
图2为谷草转氨酶检测结果示意图；
图3为谷丙转氨酶检测结果示意图；
图4为乳酸脱氢酶检测结果示意图；
图5为肝脏病理切片示意图。
具体实施方式
本实施例提供了羊胎盘水溶性成分的提取方法，包括以下步骤：
1)取新鲜羊胎盘，去除多余的结缔组织和脂肪，在蒸馏水中彻底清洗干净，沥干水分，剪成约1cm2的小块；
2)将步骤1)得到的羊胎盘小块按照料液比1∶2.5加入0.01m的pbs缓冲液(ph＝7.4)中，4℃低温提取1h，5000r/min离心15min，取上清液；
3)将步骤2)得到的上清液用1000da的透析袋，在4℃条件下透析处理24h，每隔2h换水依次，去除上清液中的缓冲液残留，得到提取液；
4)将步骤3)得到的提取液经真空冷冻干燥处理，收集冻干粉，即得到所述的具有肝脏保护作用的活性成分。
按相应国标对上述提取得到的活性成分进行成分分析，具体成分组成如下标所示。
羊胎盘活性物质的成分组成
为检测上述提取得到的活性成分的功能特性，进行了以下实验：
动物实验：spf级6周龄balb/c雌性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号scxk(京)2012-0001)，小鼠的饲养环境温度维持22±2℃，相对湿度维持在50±10％，12h昼夜交替照明，小鼠自由饮食和饮水，饲料用标准的动物维持饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司)，饮用水为去离子水。小鼠经适应性饲养1周后，随机分组(n＝12)，分别为正常对照组(normal组)、模型处理组(model组)、羊胎盘水溶性提取物5mg/kgbw剂量组(spe(l)组)、10mg/kgbw剂量组(spe(m)组)、50mg/kgbw剂量组(spe(h)组)、阳性对照组(ddb组)。cona注射前持续灌胃3天，cona注射后8h通过眼眶取血，立即断颈处死小鼠，进行脏器收集。具体如下：灌胃处理：各组小鼠灌胃体积为0.2ml，每天灌胃1次，共3天。正常对照组、模型处理组的小鼠灌胃0.2ml生理盐水，羊胎盘水溶性提取物低、中、高剂量组分别按照每1kg小鼠体重灌胃5、10、50mg提取物，阳性对照组的小鼠按照每1kg小鼠体重灌胃150mg的联苯双酯。灌胃结束1h后，除正常对照组尾静脉注射0.2ml外，其他各组小鼠均按每1kg体重尾静脉注射15mg的刀豆蛋白a。
测定指标：肝脏指数、血清转氨酶水平、乳酸脱氢酶水平、肝脏病理切片
肝脏指数：小鼠称重，经眼眶取血后立即断颈处死，经75％酒精浸泡后无菌打开腹腔，摘取肝脏，经0.85％生理盐水浸泡去除多余血渍后，用滤纸吸干除去多余水分，分析天平上称重，记录数值并按如下公式计算肝脏指数(单位为g/kg)：肝脏指数＝肝脏重量(g)/小鼠体重(kg)×100％。
刀豆蛋白a造成肝细胞凋亡坏死的早期特征是肝细胞水肿变性，并最终造成肝脏的病理改变。脏器指数是脏器重量与其体重的比值，在一定程度上反映药物对脏器的影响以及初步的毒性判断。由图1显示的数据可知，与正常组相比，cona模型组小鼠肝脏指数显著升高(p＜0.05)，是正常组的1.29倍，提前灌胃羊胎盘水溶性提取物可以阻止肝脏指数的升高，10mg/kg和50mg/kg剂量组相比模型组差异显著(p＜0.05)，分别下降11.22％和8.24％。
血清转氨酶水平、乳酸脱氢酶水平：血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平和乳酸脱氢酶水平在临床上一直被当作是肝功能的指征。
在cona注射8h后，经眼眶采集小鼠全血，室温静置2h后，在4℃，4000r/min离心条件下离心15min，上清即为血清。血清中天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸转氨酶(alt)、乳酸脱氢酶(ldh)的测定采用南京建成生物有限公司的试剂盒，操作严格按照说明书进行。
由图2-图4可以看出，经cona刺激8h后，cona模型组小鼠血清的谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平和乳酸脱氢酶水平显著高于正常对照组(p＜0.05)，分别达43.78、195.02、5.61倍。10mg/kg和50mg/kg剂量的羊胎盘水溶性提取物预防性给药显著降低了这几种酶的升高，高剂量组对三种酶的抑制率分别为65.39％、52.52％、25.26％。
肝脏病理切片：在cona注射8h后处死小鼠，经75％酒精浸泡后打开腹腔，摘取肝脏，在肝脏最大叶上切取约0.5cm的肝组织，置于10％中性福尔马林固定液中浸泡24h，之后送至北京谷歌生物公司作石蜡包埋、切片和h&e染色处理，切片厚度为5μm。切片在显微镜下200倍放大观察及拍照。
组织病理学观察是检测组织病变最直观的检测指标，从图5可以看出，正常组小鼠肝组织结构正常，肝细胞未见明显病变，汇管区无扩大。而模型组小鼠肝组织失去原有的正常组织形态，肝细胞排列紊乱，中央静脉和汇管区充血严重，部分细胞核被深染，说明肝细胞发生变性。羊胎盘水溶性提取物10mg/kg和50mg/kg剂量组小鼠的肝细胞肿胀程度比cona模型组明显减轻，汇管区和中央静脉充血明显减缓，肝细胞损伤程度减轻，50mg/kg剂量组效果更好。