本发明涉及动物饲料技术领域，特别是一种绵羊单宁酸型饲料配方及其消化代谢测定方法。
背景技术：
单宁酸(tannicacid)又称鞣酸，是一种多酚类化合物，存在于柿子、茶叶、咖啡、石榴、高粱籽粒等植物组织中，在植物尚未成熟时形成水溶性单宁，随着籽实的成熟有水溶性转为凝结性。单宁酸的结构非常复杂，属于多羟基酚类化合物。食品、饲料中的涩味，通常与单宁酸有关。而且，单宁酸能够与蛋白质、生物碱、果胶等相结合形成沉淀，因此一直被认为是饲料中的抗营养因子。然而，由于反刍动物特殊的生理结构和消化特点，饲粮中适量的单宁酸对反刍动物的蛋白质消化利用与环境保护具有一定的积极作用，一方面是当瘤胃ph为5～7时，单宁可与植物性饲料中的蛋白质形成复合物，降低蛋白质在瘤胃中的溶解度和表面活性，避免被瘤胃微生物迅速降解，增加过瘤胃蛋白数量，从而提高蛋白质利用效率。
但柿子、茶叶、咖啡、石榴、高粱籽粒等植物组织中单宁酸含量有限，单一通过植物组织摄入单宁酸无法实现反刍动物的批量化喂服工作，同时摄入大量柿子、茶叶、咖啡、石榴、高粱籽粒等植物组织容易造成营养不均衡，现有技术中没有将单宁酸批量化喂服的相关报道。
技术实现要素：
本发明解决一种可批量化生产、用量精准的绵羊单宁酸型饲料配方及其消化代谢测定方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种绵羊单宁酸型饲料配方，包括基础饲料和单宁酸，基础饲料内拌入单宁酸，单宁酸添加量为0.1-20g·kg-1，基础饲料按如下重量比配料制得：玉米35-40份、大豆粕5-10份、苜蓿干草10-15份、玉米秸秆25-30份、大麦秸秆15-20份、磷酸氢钙0.1-0.2份、石灰石粉0.3-0.4份、食盐0.5-1份和预混料0.1-0.2份。
所述基础饲料按如下重量比配料制得：玉米37.85份、大豆粕6份、苜蓿干草12份、玉米秸秆27份、大麦秸秆16份、磷酸氢钙0.17份、石灰石粉0.33份、食盐0.5份和预混料0.15份。
所述预混料中按如下重量比微量元素制得：锌zn60份、铁fe60份、锰mn40份、铜cu12份、碘i1份、硒se0.2份、钴co0.3份。
所述单宁酸添加量为3.40g·kg-1。
一种绵羊单宁酸型饲料配方的消化代谢测定方法，其特征在于包括如下步骤：
a、前期准备
给试验羊安装瘤胃瘘管，常规饲料和绵羊单宁酸型饲料混合喂食，并逐渐增加绵羊单宁酸型饲料剂量，直至完全喂食绵羊单宁酸型饲料，试验羊喂食绵羊单宁酸型饲料配方一周后开始取样，日投喂量为体重的3％，试验羊自由取水饮用；
b、消化代谢样品
收取全粪和全尿进行消化代谢试验，收集期为5天，逐日收集粪尿排出量并观察饲料投料量和剩料量，全粪便收集后进行混匀、烘干和粉碎后，观察干物质、有机物质与纤维物质的消化情况，并监测记录钙ca、磷p、氮n含量；
c、瘤胃液样品
分时段收集瘤胃液样品，分别在食前1h、食后1h、食后3h、食后5h、食后7h从腹囊中抽取瘤胃液50ml，用测定ph值，用4层纱布过滤，收集滤液，滤液加入饱和hgcl2溶液，在﹣20℃保存，检测瘤胃液中总氮、氨氮nh3-n的含量；
d、血浆样品
在进食后2h，采集羊颈静脉血10ml，加入肝素摇匀，以5000r/min离心处理10min制取血浆，在﹣20℃保存，检测血浆中尿素氮含量。
所述步骤b中全粪便混匀后在65℃下烘干至恒重，加入质量浓度10％的h2so4溶液浸没粪样，在﹣20℃下冷藏，全尿液中加h2so4溶液，全尿液ph值降低至3以下，在4℃下冷藏，检测记录全粪便和全尿液中钙ca、磷p、氮n含量。
本发明中加入单宁酸后，形成单宁酸蛋白质复合物，在真胃(ph为2.5)和小肠(ph为8～9)时，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶分解，形成易于吸收的小分子物质，从而达到过瘤胃蛋白保护的作用。可提高奶制品中蛋白含量，由此推断单宁酸可以提高饲料蛋白在奶牛体内的消化吸收。研究发现，饲粮中单宁酸含量为3.40g·kg-1时对饲粮蛋白质的保护效果最好。目前，茶叶、高粱籽粒、灌木叶等富含单宁酸的物质对反刍动物过瘤胃蛋白质的保护效果，国内外已有大量研究报道；而本案直接使用化学纯品单宁酸(c76h52o64)进行饲养和测试，进而得出添加配比进行批量化生产。本试验以绵羊为动物模型，旨在研究饲粮中添加分析纯单宁酸(c76h52o64)对反刍动物营养物质消化利用和氮代谢的影响，探讨分析纯单宁酸在饲粮中的适宜添加量，为纯品单宁酸作为反刍动物保护过瘤胃蛋白的一种新型饲料添加剂加以开发利用并为生产实践提供理论依据。
具体实施方式
一种绵羊单宁酸型饲料配方，包括基础饲料和单宁酸，基础饲料内拌入单宁酸，单宁酸添加量为0.1-20g·kg-1，基础饲料按如下重量比配料制得：玉米35-40份、大豆粕5-10份、苜蓿干草10-15份、玉米秸秆25-30份、大麦秸秆15-20份、磷酸氢钙0.1-0.2份、石灰石粉0.3-0.4份、食盐0.5-1份和预混料0.1-0.2份。
所述基础饲料按如下重量比配料制得：玉米37.85份、大豆粕6份、苜蓿干草12份、玉米秸秆27份、大麦秸秆16份、磷酸氢钙0.17份、石灰石粉0.33份、食盐0.5份和预混料0.15份。所述预混料中按如下重量比微量元素制得：锌zn60份、铁fe60份、锰mn40份、铜cu12份、碘i1份、硒se0.2份、钴co0.3份。优选的所述单宁酸添加量为3.40g·kg-1。
一种绵羊单宁酸型饲料配方的消化代谢测定方法，其特征在于包括如下步骤：
a、前期准备
给试验羊安装瘤胃瘘管，常规饲料和绵羊单宁酸型饲料混合喂食，并逐渐增加绵羊单宁酸型饲料剂量，直至完全喂食绵羊单宁酸型饲料，试验羊喂食绵羊单宁酸型饲料配方一周后开始取样，日投喂量为体重的3％，试验羊自由取水饮用；
b、消化代谢样品
收取全粪和全尿进行消化代谢试验，收集期为5天，逐日收集粪尿排出量并观察饲料投料量和剩料量，全粪便收集后进行混匀、烘干和粉碎后，观察干物质、有机物质与纤维物质的消化情况，并监测记录钙ca、磷p、氮n含量；所述步骤b中全粪便混匀后在65℃下烘干至恒重，加入质量浓度10％的h2so4溶液浸没粪样，在﹣20℃下冷藏，全尿液中加h2so4溶液，全尿液ph值降低至3以下，在4℃下冷藏，检测记录全粪便和全尿液中钙ca、磷p、氮n含量；
c、瘤胃液样品
分时段收集瘤胃液样品，分别在食前1h、食后1h、食后3h、食后5h、食后7h从腹囊中抽取瘤胃液50ml，用测定ph值，用4层纱布过滤，收集滤液，滤液加入饱和hgcl2溶液，在﹣20℃保存，检测瘤胃液中总氮、氨氮nh3-n的含量；
d、血浆样品
在进食后2h，采集羊颈静脉血10ml，加入肝素摇匀，以5000r/min离心处理10min制取血浆，在﹣20℃保存，检测血浆中尿素氮含量。
上述检测数据采用spss20.0软件进行拉丁方方差分析，差异显著时均用turkey法做多重比较，试验结果表示为mean±sd。
对比试验
1.1试验设计
本试验采用4×4拉丁方设计，选用4只安装永久性瘤胃瘘管的羯绵羊，2岁，平均体重为35±2.15kg，饲粮循环周期为16d，预试期10d，正试期6d，全期共64d。根据前期预试验结果，影响绵羊采食量的单宁酸最大添加剂量≤20g·kg-1，本试验分为a、b、c和d组，依次在基础饲粮中添加纯品单宁酸0、10、15、20g·kg-1dm。
1.2试验饲粮与动物管理
试验饲粮参照中国美利奴绵羊饲养标准，按日增重50g/d育成公羊消化能(de)、粗蛋白质(cp)推荐量的1.5倍配制(表1)。分析纯单宁酸(鞣酸)购自天津市凯通化学试剂有限公司。
表1试验饲粮的组成及营养水平
预混料给每千克日粮提供的元素百分比如下：zn60，fe60，mn40，cu12，i1，se0.2，co0.3。
安装瘤胃瘘管前，对试验羊进行免疫，试验前与试验期间保持羊舍及用具清洁，并定期消毒。将试验羊置于个体消化代谢笼中饲养，试验前一周逐渐过渡为试验饲粮，精料和粗料均粉碎后，按日粮配方制备成全混合日粮进行饲喂，日投喂量约为体重的3％(平均1.0kgdm)，分3次等量饲喂(07:00、14:00、21:00)，自由饮水。
1.3样品采集与测定方法
b、消化代谢样品
收取全粪和全尿进行消化代谢试验，收集期为5天，逐日收集粪尿排出量并观察饲料投料量和剩料量，全粪便收集后进行混匀、烘干和粉碎后，观察干物质、有机物质与纤维物质的消化情况，并监测记录钙ca、磷p、氮n含量；所述步骤b中全粪便混匀后在65℃下烘干至恒重，加入质量浓度10％的h2so4溶液浸没粪样，在﹣20℃下冷藏，全尿液中加h2so4溶液，全尿液ph值降低至3以下，在4℃下冷藏，检测记录全粪便和全尿液中钙ca、磷p、氮n含量；
c、瘤胃液样品
分时段收集瘤胃液样品，分别在食前1h、食后1h、食后3h、食后5h、食后7h从腹囊中抽取瘤胃液50ml，用测定ph值，用4层纱布过滤，收集滤液，滤液加入饱和hgcl2溶液，在﹣20℃保存，检测瘤胃液中总氮、氨氮nh3-n的含量；
d、血浆样品
在进食后2h，采集羊颈静脉血10ml，加入肝素摇匀，以5000r/min离心处理10min制取血浆，在﹣20℃保存，检测血浆中尿素氮含量。
2结果与分析
2.1饲粮中单宁酸含量对绵羊养分消化与氮利用的影响
2.1.1干物质、有机物质与纤维物质的表观消化率
表2显示，a、b、c处理的dm与om采食量、消化量极显著高于d(p﹤0.01)；各处理dm与om的粪中排出量、消化率差异均不显著(p﹥0.05)，但a、b、c处理的dm消化率、om消化率呈现高于d的趋势。还可看出，a、b的ndf与adf食入量、消化量极显著高于c、d(p﹤0.01)，c的ndf与adf食入量、消化量也极显著高于d(p﹤0.01)；处理间ndf与adf的粪排出量、消化率差异均不显著(p﹥0.05)。
表2处理对dm、om、ndf和adf表观消化的影响
同一列数字肩标有不同大写字母表示差异极显著(p﹤0.01)，有不同小写字母表示差异显著(p﹤0.05)，有相同大或小写字母表示差异不显著(p﹥0.05)，以下同
2.1.2氮的表观消化和存留
表3显示，处理a、b、c的n食入量与n消化量极显著高于d(p﹤0.01)；处理间尿n排出量与n的消化率间差异不显著(p﹥0.05)；粪n排出量随单宁酸比例的增大而下降，处理a显著高于处理c、d，处理b显著高于处理d；处理c的n存留量显著高于a、d(p﹤0.01)；n存留率随单宁酸比例的增大呈上升的趋势，仅c处理显著高于a(p﹤0.01)，其它处理间的差异不显著(p﹥0.05)。
表3试验处理对n表观消化和存留的影响
2.1.3钙、磷的表观消化
由表4看出，处理a的ca食入量与b差异不显著，但显著高于c、d(p﹤0.01)；c的ca食入量也极显著高于d(p﹤0.01)；处理a、b、c的粪ca排出量极显著高于d(p﹤0.01)；各处理组间ca消化量、消化率无显著差异(p﹥0.05)。处理a、b、c的p食入量极显著高于d(p﹤0.01)，各处理组间p粪排出量、消化量、消化率的差异均不显著(p﹥0.05)。
表4试验处理对ca、p表观消化的影响
2.2饲料中单宁酸含量对瘤胃代谢参数的影响
由表5看出，各处理单宁酸含量对瘤胃液ph和总n量均值无显著影响(p﹥0.05)；而随单宁酸的增加，瘤胃液nh3-n均值和血浆尿素氮呈线性下降，a的nh3-n显著高于d(p﹤0.05)，而其血浆bun高于c、d(p﹤0.01)。
表5瘤胃氮代谢参数与血浆尿素氮
3讨论
3.1饲粮单宁酸水平对绵羊dm、om和纤维物质消化的影响
低浓度单宁酸含量不影响绵羊的采食量，高浓度单宁酸(20g·kg-1dm)，明显影响饲粮的适口性，从而降低绵羊的采食量，进而影响绵羊对dm、om、ndf与adf的摄入量。随着单宁酸浓度的增加，绵羊对dm、om、ndf与adf的消化率并无显著影响，研究表明，羯山羊采食富含单宁的饲料，与采食不含单宁的饲料相比，其dm、om、ndf与adf消化率都显著提高。
3.2饲粮单宁酸水平对氮代谢参数及消化利用的影响
单宁酸在瘤胃中可和蛋白质结合成单宁-蛋白质复合物，成为过瘤胃蛋白，当到达真胃和小肠后复合物可释放出蛋白，这样增加了小肠对氨基酸的吸收，或增加了瘤胃的氨基酸外流速度；另外还提出，在瘤胃蛋白质和单宁结合可以预防脱氨基作用，新鲜牧草含有大量的可溶性蛋白，采食后降解快，单宁能有效地阻止蛋白质的快速降解，客观上增加了过瘤胃蛋白的数量。鞣酸(水解单宁)具有保护蛋白质免在瘤胃内降解、改善氮沉积的作用。反刍动物采食单宁含量低的饲草后，降低了可溶性蛋白质在瘤胃内的降解率，使过瘤胃蛋白数量增加，从而提高家畜利用蛋白质的效率。本研究表明，在单宁酸低浓度时，随着饲粮单宁酸浓度的增大，氮的存留量、存留率显著提高；瘤胃液中cp降解率的降低，导致瘤胃中nh3-n浓度的下降，血浆尿素氮的变化趋势与瘤胃液nh3-n相一致，且二者存在很高的相关性(r＝0.999，p＝0.001)，表明血浆尿素氮主要受瘤胃液nh3-n制约。饲粮单宁酸浓度主要通过降低尿氮排出量而提高了氮的存留率，粪氮排出量基本未受影响。
影响单宁酸对蛋白质作用的主要因素是单宁酸与蛋白质的结合能力，氮消化率与单宁对蛋白质结合能力呈反比。单宁—蛋白质复合物的结合强度取决于单宁和蛋白质的特性，即分子量、三级结构、等电点和结合位置的相容性，单宁水平为3.40g·kg-1dm饲粮的尿氮排出量显著低于其他处理组，而氮存留率极显著高于其他各处理组。
3.3饲粮单宁酸水平对钙、磷消化的影响
本研究表明，各处理组间ca、p消化量和消化率差异不显著。单宁降低硫在瘤胃中的降解和吸收，提高了磷与锌的消化吸收，而对钠、钙、镁、铁、锰等的消化吸收影响不显著[22]。loque等单宁酸(水解单宁)与细胞内或组织外的钙离子结合，可拮抗平滑肌和心肌钙诱导收缩，降低血压[23]。而本试验中单宁酸浓度对ca、p表观消化吸收也无显著影响，基本与前人报道一致。
4结论
本研究表明，单宁酸具有提高蛋白质体内消化吸收的功效；饲粮中单宁酸含量小于15g·kg-1dm时，对绵羊采食影响很小，而显著提高氮存留率，对蛋白质消化吸收的效果较好；而当饲粮中单宁酸含量为15～20g·kg-1dm时，显著影响绵羊的采食量；故单宁酸在饲粮中的添加量不应该超过15g·kg-1dm。目前，蛋白质饲料资源相对缺乏，单宁含量高的饲料原料可以与其他饲料合理搭配，以提高饲料营养物质的生物学价值，也可以考虑添加适量的单宁酸作为饲料添加剂使用。