一种饲料防霉剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及饲料及畜禽养殖领域，具体地涉及一种新型饲料防霉剂脱氢醋酸钠预混剂的研制及其防霉应用。

背景技术：

脱氢醋酸钠又称脱氢乙酸钠(sodiumdehydroacetate，简称na-dha)，化学名为6-甲基-3-乙酰基-2，4-吡喃二酮钠，casno.4418-26-2，分子式为c8h7nao4.h2o。脱氢醋酸钠对细菌、酵母菌、霉菌等多种微生物具有广谱的抗菌抑菌作用^[1]，是继苯甲酸钠、尼泊金酯、和山梨酸钾之后的一种替代型化学防腐剂。脱氢醋酸钠是联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)下食品联合专家委员会(jecfa)许可在食品中使用的一种新型安全防腐保鲜添加剂。目前被广泛应用于食品、饲料及保健品等相关领域。我国《食品添加剂使用标准》(gb2760-2011)规定脱氢醋酸及其钠盐在黄油和浓缩黄油、腌渍的蔬菜、腌渍的食用菌和藻类、发酵豆制品及果蔬汁(浆)中的最大使用量为0.3g/kg；淀粉制品的最大使用量为1.0g/kg；在面包、糕点、焙烤食品馅料及表面用挂浆、预制肉制品、熟肉制品、复合调味料中的最大使用量为0.5g/kg。在日本，脱氢醋酸钠作为食品防腐剂，在奶酪、黄油及人造黄油中的添加浓度为0.5g/kg。fda允许脱氢醋酸钠作为防霉剂用于破损或剥皮食品的涂抹，根据规定脱氢醋酸钠在处理食品中的残留不得超过65mg/kg(21cfr172.130)。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种饲料防霉剂及其制备方法与应用，本发明可有效地防止饲料霉变、防霉期达2月以上；经过高温、高湿、强光和长期试验，制剂稳定性良好。

本发明的第一个目的是提供一种饲料防霉剂，包括以下重量百分比的各组分：脱氢醋酸钠10％，轻质碳酸钙90％。

本发明的第二个目的是提供一种饲料防霉剂的制备方法，其特征是，将所述重量百分比的脱氢醋酸钠、轻质碳酸钙充分搅拌混匀，制得10％脱氢醋酸钠预混剂。

优选的，所述搅拌混匀时间为10min/2kg。

本发明的第三个目的是提供一种饲料防霉剂的应用，将所述饲料防霉剂添加于饲料中，饲料防霉剂的有效添加量为0.02～0.08％脱氢醋酸钠。

优选的，所述饲料防霉剂的推荐添加量为0.02％脱氢醋酸钠。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

第一，本发明研制了一种饲料防霉剂―10％脱氢醋酸钠预混剂，处方如下：脱氢醋酸钠100g，轻质碳酸钙900g。经充分搅拌混匀后，制得10％脱氢醋酸钠预混剂。经产品质量考察、防霉有效性、制剂稳定性试验，表明本发明的预混剂质量可靠、制剂性质稳定，具有较好的防霉作用和对动物的安全性。

第二，本发明通过比较基质的流动性、容重、粒度、吸湿性及价格筛选预混剂的基质，选择轻质碳酸钙为基质，确定了10％脱氢醋酸钠预混剂的处方。通过建立脱氢醋酸钠分光光度法含量测定方法，比较搅拌速度、搅拌时间及含量均匀度，确定预混剂生产的基本工艺。通过防霉推荐量试验、防霉常规试验、强化防霉试验等评价制剂的防霉有效性、防霉期时间和制剂的稳定性。

第三，本发明的10％脱氢醋酸钠预混剂，以0.2％(相当于0.02％脱氢醋酸钠)添加于饲料中，可有效地防止饲料霉变、防霉期达2月以上；经过高温、高湿、强光和长期试验，制剂稳定性良好。

第四，脱氢醋酸钠的抗菌防腐作用除了广泛应用于食品、农产品等保鲜、防腐外，添加于饲料或青贮饲料中对多种微生物如真菌属、葡萄菌属、念珠菌属、青霉属和黄曲霉菌属等均有较好的抑制作用。在饲料中添加0.08％脱氢醋酸钠时，对霉菌具有良好的抑菌效果。在青贮饲料中0.2％脱氢醋酸钠可降低病原菌的生长。脱氢醋酸钠在弱酸性条件下，对从霉变的鸡饲料中分离出的6种霉菌表现出最佳的防霉效果，中性条件下次之，碱性条件下最差。当ph＝4.5时，脱氢醋酸钠对饲料中6种混合霉菌、黄曲霉菌、烟曲霉菌的最低抑菌浓度为70mg/kg，对枯青霉菌、岛青霉菌、串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌为80mg/kg；当ph＝5.5时，脱氢醋酸钠的mic为80mg/kg；当ph＝7.0时，其mic为130mg/kg；但ph＝7.5时，其mic为140mg/kg。较苯甲酸钠(ph≤4)和山梨酸钾(ph≤7)的有效ph范围广。而且经过121℃高温处理30min，其防霉效果也未发生变化，可应用于颗粒饲料的生产。

附图说明

图1是紫外分光光度法测定脱氢醋酸钠的标准曲线图；

图2是脱氢醋酸钠预混剂常规防霉试验结果图；

图3是脱氢醋酸钠预混剂强化防霉试验结果图；

图4是脱氢醋酸钠预混剂防霉期试验结果图。

具体实施方式

1、预混剂的处方及工艺筛选

1.1基质的选择

主要以基质的流动性、容重、粒度、吸湿性为评价指标进行基质的筛选。

1.1.1流动性

休止角是表示粉体学流动性的最常用的方法之一。本试验采用固定圆锥底法，将颗粒放置在固定于表面皿的中心位置的三个串联漏斗内，使其自由下流，直至颗粒堆积到不再下流为止，测定颗粒堆积高度(h)，及锥体地面半径(r)，tanθ＝h/r，θ即为休止角。适度的流动性(又称流散性)以静止角在40°～60°为宜。

1.1.2容重

容重是指单位容积内物料的重量，本试验中釆取的测量方法如下：

首先取一个500ml的量杯，称重，记为m0。将预混料载体样品混合均匀后采用四分法取样，轻且仔细地装入500ml量杯中，直到装满为止，以直尺为刮板调整容积，使得样品与量杯口平齐，再称量并记录量杯和样品的总质量，如此反复进行三次得到m1、m2、m3，取均值。

将量杯洗净瞭干，装入蒸馏水，直到液面与量杯口平齐为止，称量并记录量杯和水的总质量，如此反复进行三次，得到三个质量mw1、mw2，mw3取均值为mw。

预混料载体容重：

载体容重与脱氢乙酸钠容重的差值：

r差＝|rdha-s-r|

1.1.3粒度

采用双筛分法，取不能通过小号筛(100目)和能通过大号筛(65目)的颗粒及粉末，称定重量，以收率反映其所占比例(％)。

1.1.4基质的吸湿性

基质的水分宜控制在合适的水平。基质的吸湿性测定如下：取供试品，按《中国兽药典》2010版附录中干燥失重测定法检查，在105℃干燥至衡重，减失重量无机基质不得超过3.0％，有机基质不得超过8.0％。

1.1.5处方筛选结果

基质的流动性、粒度及吸湿性数据见表1。由表可看出，载体流动性均良好，依次为豆粕、麦麸、轻质碳酸钙、碳酸钙、淀粉。脱氢乙酸钠可全部通过四号筛，能通过六号筛的不超过10％，收率为94％±1.32％。轻质碳酸钙与脱氢乙酸钠粒度相近。含水量检测中无机基质(轻质碳酸钙、碳酸钙)未超过3.0％，有机基质(麦麸、豆粕、淀粉)均超过8.0％；载体成本大小依次为：碳酸钙、麦麸、轻质碳酸钙、淀粉、豆粕。

表1不同基质的流动性、水分及成本估算(n＝3,)

表2为不同载体的容重数据。可以看出，载体容重大小依次为：碳酸钙、豆粕、轻质碳酸钙、淀粉、麦麸；脱氢醋酸钠的容重与淀粉较接近，其次是轻质碳酸钙、豆粕与麦麸。

综合考虑基质的流动性、粒度、水分、容重和价格，选择基质材料为轻质碳酸钙。

表2不同基质的容重

1.2混合

1.2.1仪器与材料

vh10型实验混合机(广州市旭朗机械设备有限公司)；最佳装量2kg；最大装量3kg；混合转速24r/min。

uv-2600型紫外-可见光分光光度计、bp110s电子分析天平，德国赛多利斯天平公司。

脱氢醋酸钠(纯度为99.8％)，由江苏天成动物保健品公司提供。

1.2.2试验方案

采用单因子分组试验，取脱氢醋酸钠与轻质碳酸钙按照1：9分别制成1kg、2kg和3kg装量的预混料进行混合。混合时间分4个处理组(5、10、15、20min)，每个处理分别做3组重复。每批预混料按不同位置及深度取6个样品，取样的时候充分考虑各方位、深度，取样时不允许有任何翻动或混合。每个样品的采样数量约为5g，取出的样品装入密封袋内，并编号。样品及时进行含量测定，以每个处理的6个样品含量测定的变异系数评价混合的均匀度。

1.2.3混合工艺筛选结果

v型混合机不同混合时间及装量混合时，含量测定的变异系数及显著性差异见表3。可以看出，v型混合时间为10min时，对不同装量及同一装量时的混合均匀度为最好。

表3v型混合器混合时间、装量对混合均匀性的影响

注：同列中不同字母表示差异显著，p<0.05；相同字母差异不显著，p﹥0.05。

2脱氢醋酸钠预混剂的质量研究

预混剂应混合均匀、色泽一致、流动性好、干燥松散、易与饲料混合。除另有要求外，预混剂应进行以下检查。

2.1外观均匀度、水分及装量差异

分别参照《中华人民共和国兽药典》2010年版一部附录外观均匀度检查、水分测定法及最低装量检查法进行检查。本品三个批次检查结果见表4。

表4脱氢醋酸钠预混剂的外观均匀度、水分和装量检查结果

2.2含量测定

脱氢醋酸钠预混剂含量测定方法采用紫外分光光度法。

2.2.1材料和仪器

uv-2600型紫外-可见光分光光度计，上海精密仪器有限公司。

脱氢乙酸钠标准储备液(1.00mg/ml)：准确称取0.1010g脱氢乙酸钠(99.0％)，用纯水溶解后转移至100ml容量瓶中，并定容至刻度。

脱氢乙酸钠标准使用液(0.10mg/ml)：准确移取标准储备液10.00ml于100ml容量瓶中，用水定容至刻度。

2.2.2脱氢乙酸钠标准曲线的建立

取标准使用液适量，稀释为浓度为0.00，0.20，0.50，2.00，5.00，10.00，20mg/l的标准系列，293nm波长处测定吸光值。以脱氢乙酸钠浓度(mg/l)为自变量(c)，相应各浓度水平的吸光度为应变量(a)，作线性回归，得出标准曲线的回归方程和相关系数，并绘制标准曲线。

图1为分光光度法测定脱氢醋酸钠的标准曲线，在0.00，0.20，0.50，2.00，5.00，10.00，20mg/l系列浓度范围内线性关系良好，相关系数为r²＝0.9999，拟合曲线方程为y＝0.08822x-0.0017，y为od，x为脱氢乙酸钠浓度mg/l。

2.2.3回收率与精密度

以轻质碳酸钙为基质，分别制得含脱氢醋酸钠0.625％，6.25％，25％的三个空白添加预混剂样品。以轻质碳酸钙为空白对照样品。

取空白添加样品各0.4g，用适量纯水使其溶解，转移至500ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；过滤后精密量取2.5ml，置25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；分别制得0.5、5.0、25mg/l的溶液。以水为对照，在293nm处测定吸光度，根据标准曲线计算含量和回收率。每个浓度5个重复，分别在同一天或连续三天进行批内、批间精密度试验。

式中：c为从标准曲线中计算而得测定吸光度时溶液中脱氢醋酸钠的浓度，mg/l；w为样品量，g。

表5为分光光度法测定脱氢醋酸钠的回收率与精密度。回收率在101.99～102.05％，批内批间精密度均小于3％。

表5分光光度法测定预混剂中脱氢醋酸钠的回收率与精密度

2.2.4样品含量测定

取脱氢醋酸钠预混剂样品0.4g，用适量水溶解后，转移至500ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；过滤后精密量取2.5ml，置25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。以水为对照，在293nm处测定吸光度，根据标准曲线计算含量，标示量计算公式如下：

本品三个批次，测定结果为标示量的100.21％～101.46％，见表6。三个批次预混剂产品含量均符合要求。

表6脱氢醋酸钠预混剂含量测定结果

2.3含量均匀度

在每一批次预混料的上、中、下层分别选取4个点，共取样12个，进行含量测定，每一样品重复三次。含量测定方法同2.2.4，在293nm处测定吸光度。表7为均匀度分析数据，从中可见三个批次预混剂均匀度符合要求。

表7脱氢醋酸钠预混剂的含量均匀度检查

3防霉有效性

3.1材料与仪器

0.85％生理盐水：称取分析纯nacl8.5g，定容至1000ml，121℃高温、高压灭菌30min，作为稀释液。

高盐察氏培养基：硝酸钠2g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁(mgs04·7h20)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、氯化钠60g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。加热溶解，分装后，121℃高压灭菌30min。必要时，可酌量增加琼脂。

试验用饲料采用自配料，70％玉米和30％豆粕。

仪器设备：霉菌培养箱、电子天平、高压灭菌锅、试管、无菌工作台、ph计等。

3.2防霉推荐量试验

试验分为6个组，每组3个重复。饲料中添加适量脱氢醋酸钠预混剂并混匀，添加终浓度含脱氢醋酸钠分别为0、0.01％、0.02％、0.03％、0.06％、0.08％，分别为ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ和ⅵ组。

称取试验所需的饲料量，提高饲料水分至16％～18％，将饲料置于灭菌的三角瓶中，用牛皮纸封口并置于霉菌培养箱中(温度35～38℃，相对湿度95％以上)培养。分别于0d、3d、5d、15d、20d检测霉菌数。饲料中霉菌总数测定方法按“gb13092-2006”进行。

防霉推荐量试验结果见表8。可以看出，脱氢醋酸钠预混剂在饲料中的添加终浓度在0.02～0.08％，在添加后的3～20d内对饲料可以起到有效防霉作用。

表8饲料中添加脱氢醋酸钠后不同时间的霉菌总数(cfu/g)

注：同列中不同肩标字母表示差异显著(p＜0.05)；相同字母表示差异不显著(p＞0.05)。

3.3常规防霉试验

试验分4个组，每个组3个重复。对照组饲料中不添加脱氢醋酸钠预混剂，160111、160112、160113三个批次脱氢乙酸钠预混剂在饲料中的添加量均为0.02％。以正常饲料(水分11.0％～12.5％)在自然环境下存放1w、2w、3w、4w、6w、8w后，按gb13092-2006抽样进行霉菌数检测。

常规试验结果见图2。与空白对照组比较，脱氢醋酸钠预混剂添加于饲料后，在6w内对饲料有明显的防霉作用。

3.3强化防霉试验

试验分4个组，每个组3个重复。对照组饲料中不添加脱氢醋酸钠预混剂，160111、160112、160113三个批次脱氢乙酸钠预混剂在饲料中的添加量均为0.02％。提高饲料水分至16％～18％，置培养箱(温度35～38℃，相对湿度95％以上)培养，分别于3d、5d、15d、20d取样，按gb13092-2006抽样检测饲料中的霉菌数。

强化防霉试验结果见图3。与空白对照组比较，在温度35～38℃，相对湿度95％以上条件下，脱氢醋酸钠预混剂添加于饲料后于20d内对饲料有明显的防霉作用。

3.4防霉期的试验

试验分4个组，每个组3个重复。基础饲料高温灭菌处理，对照组饲料中不添加脱氢醋酸钠预混剂，160111、160112、160113三个批次脱氢乙酸钠预混剂在饲料中的添加量均为0.02％。调整饲料水分至13.0％，置温度25±1.0℃，相对湿度60±2.0％的培养箱中培养，每隔15日取样检验霉菌总数，试验期60天。

脱氢醋酸钠预混剂防霉期试验结果见图4。从中可以看出，与对照组比较，在60天的防霉期试验时间内，试验组霉菌数极显著低于对照组。脱氢醋酸钠至少在60天内可以有效地防止饲料霉变。

4制剂稳定性

为了脱氢醋酸钠预混剂的生产、包装、贮存、运输条件，及确立该产品的有效期提供科学依据，根据《中华人民共和国兽药典》2010年版一部《兽药稳定性试验指导原则》进行了制剂的稳定性试验。

4.1影响因素试验

取脱氢醋酸钠预混剂(160112)除去外包装，置培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，进行以下试验。

4.1.1高温试验

供试品置60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，与0天测定结果相比较。检验结果见表7。

结果：脱氢醋酸钠预混剂在60℃温度下放置10天，于第5天和第10天分别取样，按稳定性重点考察项目进行检测，与0天测定结果相比较。脱氢醋酸钠预混剂在60℃温度下放置10天，外观性状、颜色、含量无明显变化。

4.1.2高湿度试验

供试品置恒湿密闭容器中，分别在25℃、相对湿度90％±5％和25℃、相对湿度75％±5％条件下放置10天，分别于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目要求检测，检验结果见表9。

供试品在25℃、相对湿度90％±5％高湿的环境下外观、颜色、含量均无明显变化。

恒湿条件：干燥器下部放置kno3饱和溶液。

结果：供试品在高湿的环境下外观、颜色、含量均无明显变化。

4.1.3强光照射试验

供试品在照度为4500lx±500lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目要求检测，与0天测定结果相比较。检测结果脱氢醋酸钠预混剂在4500lx±500lx的条件下放置10天，外观与内在质量无变化，检测结果见表10。

结果：本预混剂在高湿、高温、高湿及强光照射的影响因素下性状、外观及含量均无明显变化。

4.2加速试验

取本品三批，按市售包装，在温度40±2℃，相对湿度75±5％的条件下放置六个月。分别于第1、2、3、6个月末分别取样一次，按稳定性重点考察项目检测，检验结果见表11。

表10脱氢醋酸钠预混剂(160112)影响因素试验结果

结果：模拟市售包装条件下，本品于温度40±2℃，相对湿度75±5％环境中考察6个月，各项指标与0月相比无明显变化，说明本品在此包装条件下比较稳定。

4.3长期试验

长期试验是在接近兽药的实际贮存条件下进行的，其目的是为制订兽药的有效期提供依据。取本品三批，模拟市售包装，在温度25±2℃，相对湿度60±10％条件下放置12个月。分别于0、3、6、9、12个月取样，按稳定性重点考察项目进行检测，长期试验结果见表12。

结果：本品采用市售包装条件于长期试验条件下考察至12个月，结果各项指标与0天相比无明显变化，说明脱氢醋酸钠预混剂长期储存12个月性质稳定。

4.4结论

本产品在高温60±2℃、高湿90±5％、强光照射下放置10天，外观性状、颜色、含量均无明显变化。

本产品在温度40±2℃，相对湿度75±5％的条件下放置六个月，性状、颜色、外观均匀度、含量均无明显变化；在温度25±2℃，相对湿度60±10％的条件下放置12个月，各项指标均符合规定，本品的有效期可暂定为2年。

贮藏条件：常温密封保存。

表11脱氢醋酸钠预混剂加速试验结果

表12脱氢醋酸钠预混剂长期试验结果