本发明涉及一种鸡胚egf分离提取制备动物肠黏膜营养修复剂的方法及应用。
背景技术：
动物肠道不仅是营养物质消化吸收的场所，也是重要的免疫器官，维护正常的肠道机能对动物生长发育至关重要。动物在营养素缺乏、感染、应激及病理等情况下，均可导致肠道结构和功能损伤、细菌和内毒素移位以及肠道黏膜屏障功能障碍等，严重影响动物健康和生产性能，给养殖生产带来重大的经济损失。表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，egf)属于促生长因子家族成员，具有广泛的生物活性，具有促进胃肠组织生长和发育、修复受损的黏膜组织、调节肠道各种酶活性、提高营养物质消化吸收等重要作用。外源供给egf是改善动物肠道结构和功能、修复损伤肠道、促进动物健康生长的重要途径，egf作为新型动物肠黏膜营养调控剂在畜牧业生产上有十分广阔的应用前景。
egf是一条由53个氨基酸组成的单链多肽，二级结构为致密的球状结构，特殊空间结构使egf具有较高稳定性，对酸、热具有耐受性，能抵抗胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶的消化。egf具有许多生物学作用，可促进细胞内dna、rna和蛋白质合成；刺激多种组织细胞分裂、增殖和分化；抑制胃酸分泌，促进溃疡愈合及上皮组织再生；增加体内物质转运和代谢；促进细胞外基质以及机体一些物质(果酸、前列腺素)合成，具有调节精子、卵巢发育和生殖功能的作用，egf是促进新生动物胃、肠道发育的重要生长因子，但是egf有限的来源、昂贵的价格制约着其在畜牧领域的广泛应用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鸡胚egf分离提取制备动物肠黏膜营养修复剂的方法，其特征在于其步骤如下：
1)取15-20日龄孵化鸡胚，去壳，添加0.05mol/l乙酸溶液高速匀浆10-30分钟，1500转/分钟，其中去壳鸡胚与乙酸溶液质量比为1：5-10，离心20-30分钟，取上清液；
2)沉淀继续加0.05mol/l乙酸溶液匀浆，1500转/分钟离心，其中沉淀与乙酸溶液质量比为1：5-10，离心20-30分钟，合并两次上清液，去除上清液表面脂肪，
3)上清液加苯甲酸钠，充分搅拌，使其全部溶解，用3mol/l的nh4oh溶液调ph至5.5-6.5，搅拌半小时，静置，经减压过滤，取出沉淀；
4)待沉淀干燥后，加预冷丙酮，搅拌形成悬浊液，4℃下静置4-12h，则有蛋白样絮状沉淀，减压过滤；将沉淀再用丙酮洗涤，加入沸石粉，洗涤后沉淀与沸石粉的质量比为1：5-10，搅拌混合10-20分钟，50℃干燥粉碎即制成动物肠黏膜egf营养修复剂。
优选的，所述的鸡胚是指15-20日龄的健康发育的白羽aa鸡或三黄鸡鸡胚。
本发明所述的egf为一条由53个氨基酸组成的单链多肽，二级结构为致密的球状结构。
优选的，所述的步骤1)和步骤2)中的乙酸溶液的浓度为0.05mol/l，温度为4℃。
优选的，所述的苯甲酸钠加入量为每升上清液加入20-30g。
优选的，所述步骤4)中加入预冷丙酮后，沉淀在预冷丙酮溶液中的质量浓度为0.04-0.1g/ml，预冷丙酮温度为4℃。
优选的，所述的沸石粉ph在7-7.5之间，含水量3.0-8.0％，吸氨量为120-140毫摩尔/100g，目数为30-60目。
本发明还公开了一种所述方法制备的动物肠黏膜egf营养修复剂在畜禽全价饲料中的应用，具体为：每吨畜禽全价饲料中添加0.05-0.3公斤所述动物肠黏膜egf营养修复剂。
进一步的，21-28日龄断奶仔猪每吨全价饲料中添加0.1-0.3公斤所述动物肠黏膜egf营养修复剂，母猪每吨全价饲料中添加0.05-0.2公斤所述动物肠黏膜egf营养修复剂，肉鸡每吨全价饲料中添加0.05-0.1公斤所述动物肠黏膜egf营养修复剂。
本发明之动物肠黏膜egf营养修复剂制备方法，由于采用了通过调节溶液ph值使鸡胚匀浆egf带阳电荷，利用不溶于水的苯甲酸吸附egf，使其从上清夜中分离出来，再利用丙酮不溶解egf的性质，将egf从苯甲酸上解析出来的原理，可使鸡胚egf分离提取得产率大于85％，egf粗粉得率为0.1-0.2mg/g鸡胚，它有效地解决了现有饲料工业中egf来源有限、价格昂贵的问题。
本发明的动物肠黏膜egf营养修复剂，可使仔猪平均日增重提高30％-40％，料重比降低10％-20％，腹泻率下降80％-85％，空肠绒毛高度提高70％-90％，隐窝深度下降20％-30％，十二指肠肠激酶活性提高50％-55％，空肠黏膜乳糖酶的活性提高35％-40％，蔗糖酶活性提高40％-60％；使试验组肉鸡日增重提高8-12％，采食量提高6-10％，十二指肠绒毛长度提高10-20％，十二指肠绒毛长度/隐窝深度提高20-30％；回肠绒毛长度/隐窝深度提高10-18％，十二指肠胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和总蛋白水解酶活性分别提高了40-55％、80-100％、30-45％和25-35％。本发明的动物肠黏膜egf营养修复剂，具有保护和促进黏膜上皮细胞生长的作用，提高畜禽采食量和生长性能，显著降低仔猪断奶后腹泻率的作用。
具体实施方式
本发明结合以下实例作进一步的说明。
实施例1
取100个15日龄孵化健康鸡胚，去壳，称重，按1：6(g/g)的比例加入0.05mol/l乙酸(4℃)，高速匀浆30分钟，1500转/分钟离心20分钟，取上清液；沉淀继续加0.05mol/l的乙酸(4℃)匀浆15分钟，1500转/分钟离心20分钟，取上清液，合并两次上清液，去除上清液表面脂肪，上清液中加入苯甲酸钠(25g/l)，充分搅拌，使其全部溶解，加3mol/l的nh4oh调ph至6.0，搅拌半小时，静置，减压过滤，取出沉淀，沉淀干燥后，加预冷丙酮(0.05g/ml丙酮4℃)，搅拌形成悬浊液，4℃下静置12h，出现蛋白样絮状沉淀，减压过滤，将沉淀再用丙酮洗涤3次，留下的沉淀以1：5的比例加入沸石粉(30目)，搅拌混合10分钟，50℃干燥粉碎制成动物肠黏膜egf营养修复剂。
实施例2
25日龄仔猪断奶开始，对照组饲喂对照日粮(配方见表1)。试验组全价饲料在每吨对照组日粮基础上添加动物肠黏膜egf营养修复剂200克，饲喂上述饲料至46日龄，测定仔猪生长性能。
表1试验饲粮组成和营养指标
试验结果表明，与对照组相比，试验组仔猪平均日增重提高31％(p<0.05)，料重比降低12％(p<0.05)，腹泻率下降85％(p<0.05)，空肠绒毛高度提高72％(p<0.05)，隐窝深度下降21％(p<0.05)，十二指肠肠激酶活性提高58％(p<0.05)，空肠粘膜乳糖酶的活性提高39％(p<0.05)，蔗糖酶活性提高42％(p<0.05)。
实施例3
21日龄健康aa肉鸡，对照组饲喂对照日粮(配方见表2)，试验组全价饲料在每吨对照组日粮基础上添加动物肠黏膜egf营养修复剂100克，饲喂上述饲料至35日龄，测定肉鸡生长性能。
表2试验饲粮组成和营养指标
试验结果表明，与对照组相比，试验组肉鸡日增重和采食量分别提高了9.17％(p<0.05)和7.74％(p<0.05)，十二指肠绒毛长度提高14.20％(p<0.05)，十二指肠绒毛长度/隐窝深度提高25.53％(p<0.01)；回肠绒毛长度/隐窝深度提高13.63％(p<0.05)，十二指肠胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和总蛋白水解酶活性分别提高了44.61％(p<0.05)、98.34％(p<0.01)、36.47％(p<0.05)和28.36％(p<0.05)。