一种利用菌种发酵制备合浦珠母贝肉调味基料的加工方法与流程

本发明属于调味基料技术领域，具体涉及一种利用菌种发酵制备合浦珠母贝肉调味基料的加工方法。

背景技术：

合浦珠母贝(pinctadafucata)，又名马氏珍珠贝，马氏珠母贝，属于软体动物门双壳纲珍珠贝目珍珠科，合浦珠母贝主要分布在热带、亚热带海域，在我国合浦珠母贝主要分布在广东、广西和海南沿海一带，是我国主要的海水养殖及生产珍珠的贝类。上世纪60年代我国就已成为合浦珠母贝养殖珍珠的出口国，现在随着珍珠需求量的增加和养殖技术的发展合浦珠母贝的养殖规模也随之增加。

而珍珠贝肉是合浦珠母贝采摘完珍珠后的加工副产物，因此其随着养殖、采珠规模的增加，产量也逐年增多。近几年广东、广西、海南三省采珠后的贝肉就约有4000t/年。

合浦珠母贝肉作为采珠后所得的副产物，但其本身也像其它水产品一样富含多种营养物质。合浦珠母贝肉含有丰富的蛋白质、糖原、核苷酸等物质，而且在酶解的过程中蛋白质被水解成短肽或氨基酸，比如水解产生更多的谷氨酸、精氨酸、甘氨酸等呈现鲜甜味的氨基酸，这样不仅使得人体更容易吸收利用，还可以增加合浦珠母贝肉的呈味物质的含量，因此可将其作为制备海鲜调味料的原始材料。但目前还未有人进行过这个方面的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用菌种发酵制备合浦珠母贝肉调味基料的加工方法，该方法采用米曲霉和鲁氏酵母菌两种菌种协同发酵，加工成的合浦珠母贝肉调味基料为淡黄色粉末、营养丰富、风味良好，食用与携带方便。

为达到上述目的，本发明提供的一种利用菌种发酵制备合浦珠母贝肉调味基料的加工方法，包括以下步骤：将合浦珠母贝肉经匀浆，添加复合蛋白酶进行水解，酶解液接种发酵菌种进行发酵和喷雾干燥，获得调味基料产品。

本发明采用米曲霉和鲁氏酵母菌两种菌种协同发酵，以发酵液风味值及游离氨基态氮含量为判定指标，优化酶解液的发酵工艺。通过试验，确定了适宜生产的各工艺条件的最适参数。

具体的，本发明提供的一种利用菌种发酵制备合浦珠母贝肉调味基料的加工方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：选取合浦珠母贝肉加入水进行匀浆处理，得合浦珠母贝肉匀浆液；

(2)酶解液制备：在合浦珠母贝肉匀浆液中加入复合蛋白酶进行酶解，酶解结束后将酶解液冷却，离心，取上清液备用；

(3)酶解液发酵：将上清液接种发酵菌种采用两段式发酵方式进行发酵，先添加米曲霉进行发酵，再添加鲁氏酵母菌进行发酵，得合浦珠母贝肉发酵液；

(4)喷雾干燥：在合浦珠母贝肉发酵液中添加助干剂，进行喷雾干燥，获得合浦珠母贝肉调味基料。

在上述利用菌种发酵制备合浦珠母贝肉调味基料的加工方法中：

步骤(1)中所述合浦珠母贝肉与水的质量份配比优选为1:1～3。

合浦珠母贝肉与水不同料液比对水解效果的影响如图1所示，由图1可知，随着液料比的增加贝肉酶解液的水解度也逐渐增大，但在合浦珠母贝肉与水的质量份配比达到1:3后，酶解液的水解度却随着液料比的增加而逐渐降低，且料液比对水解效果的整体影响较为显著(p<0.05)。

步骤(2)中所述复合蛋白酶的用量为每克合浦珠母贝肉匀浆液中优选添加3000u～6000u，酶解时间优选为3h～6h，酶解温度优选为30℃～50℃，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶，二者的质量份配比为1:1。

不同加酶量对水解度值的影响如图2中所示，由图2可知合浦珠母贝肉的水解度前期随加酶量的增加呈现先快速上升但达到接近6000u/g时增幅逐渐平稳。在加酶量为5000u/g时水解度值达到37％，与加酶量为5700u/g时的水解度值之间差异性不显著(p>0.05)，但在加酶量达到5000u/g前增加蛋白酶量可使水解度值快速增长。

不同酶解时间对酶解效果的影响如图3所示，由图3可知，随着酶解时间的增加酶解液的水解度值呈现出先快速增加后逐渐平缓的趋势，在酶解时间达到6h后，酶解液的水解度的增幅不再随着时间的增加而大幅增长，且在酶解时间未达到6h前时间的变化对水解效果的影响较为显著(p<0.05)。

不同酶解温度对酶解效果的影响如图4所示，由图4可知，随着酶解温度的增加水解度呈现先快速增加后逐渐下降的趋势，在酶解温度达到50℃后，酶解液的水解度的增幅不再随着时间的延长而增大，而是呈逐渐降低的趋势。

步骤(2)中离心时离心机的转速优选为6000r/min～9000r/min，离心时间优选为10min～30min。

步骤(3)中所述米曲霉和鲁氏酵母菌的接种量优选为酶解液总质量的2％～5％，二者的质量份配比优选为1:1～3，其中米曲霉和鲁氏酵母菌的浓度优选为1×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g。

米曲霉是一种可分泌复合酶的菌种，可缩短发酵时间及提高氨基酸等的转化率；鲁氏酵母是发酵期重要的增香酵母，可产生醇、呋喃等多种风味物质。本发明方法采用米曲霉和鲁氏酵母菌两种菌种协同发酵，先加入米曲霉有氧发酵一段时间后再加入鲁氏酵母进行无氧发酵，二者协同发酵，起到缩短发酵时间、提高氨基酸转化率、增香作用。

菌种接种量对发酵液风味值及游离氨基态氮含量的影响如图5所示，由图5可知，随着总接种量的增大，合浦珠母贝肉酶解液的风味值和游离氨基态氮含量都呈现先增加后降低的趋势。在接种量为5％时，贝肉酶解液的风味值达到最高值，但在增加或降低菌种添加量时，风味值都会降低；在接种量为4％时，贝肉酶解液的游离氨基态氮含量达到最高值，但在增加或降低接种量时，游离氨基态氮含量都将会降低。

菌种比例对发酵液风味值及游离氨基态氮含量的影响如图6所示，由图6可知，随着鲁氏酵母菌添加比例的增大，合浦珠母贝肉酶解液的风味值和游离氨基态氮含量都呈现先增加后降低的趋势。在米曲霉：鲁氏酵母菌＝1：2(质量份配比)时，贝肉酶解液的风味值达到最高值，但在增加或降低鲁氏酵母菌的添加比例时，风味值都会降低，这可能是因为菌种比例的变化，导致微生物代谢产物中风味物质的变化进而影响发酵液的口感，风味值随之降低。在米曲霉：鲁氏酵母＝1：1时(质量份配比)，贝肉酶解液的游离氨基态氮含量达到最高值，但在增加或降低鲁氏酵母菌的添加比例时，游离氨基态氮含量都将会降低。

步骤(3)中米曲霉进行有氧发酵的时间优选为24h～48h，鲁氏酵母菌进行无氧发酵的时间优选为24h～48h。

菌种发酵时间对发酵液风味值及游离氨基态氮含量的影响如图7所示，由图7可知，随着发酵时间的增大，合浦珠母贝肉酶解液的风味值呈现先增加后降低的趋势。在总发酵时间为80h时，贝肉酶解液的风味值达到最高值，在增加或缩短发酵时间时，风味值都将有所降低。但随着发酵时间的增大，游离氨基态氮含量却呈上升趋势，但在80h后，游离氨基酸含量上升幅度不再随时间的增加而大幅增大。

步骤(4)中所述助干剂优选为麦芽糊精，所述麦芽糊精的添加量优选为合浦珠母贝肉发酵液总质量的10％～20％。

步骤(4)中喷雾干燥时，进料流量优选为3ml/min～6ml/min，进料温度优选为40℃～60℃，出口温度优选为160℃～180℃，喷雾压力优选为15mpa～30mpa。

本发明具有如下优点：

(1)本发明将酶解与菌种发酵相结合，促进合浦珠母贝肉的水解，水解度达到25％～40％，游离氨基态氮含量达到2g/l～4g/l；

(2)采用本发明方法制备获得的浦珠母贝肉调味基料，风味成分分析显示，合浦珠母贝肉酶解液经发酵后挥发性风味成分更加丰富，令人愉悦性风味成分增加，得到多种醛类、醇类、酮类、酸类、含硫类等风味成分，合浦珠母贝肉经发酵后得到具有特殊生理功能和活性的氨基酸肽段长度集中在3kda以下，特别是<1kda的含量占总肽含量的70％～80％；

(3)本发明方法采用喷雾干燥获得的合浦珠母贝肉调味基料产品为淡黄色粉末，复水性好；

(4)本发明加工方法工艺简单，酶解与菌种发酵制得的合浦珠母贝肉调味基料具有浓郁的海鲜风味，含有多种保健功能的多肽，氨基酸，牛磺酸等，有利于人体的吸收，而且可溶性好，食用方便，产品质量稳定，有利于工业化生产。

附图说明

图1是本发明不同料液比对水解效果的影响，图中a、b、c、d为差异显著性分析标准，标记相同字母表示差异不显著，标记不同字母表示差异显著；

图2是本发明不同加酶量对水解度值的影响，图中a、b、c、d为差异显著性分析标准，标记相同字母表示差异不显著，标记不同字母表示差异显著；

图3是本发明不同酶解时间对酶解效果的影响，图中a、b、c、d为差异显著性分析标准，标记相同字母表示差异不显著，标记不同字母表示差异显著；

图4是本发明不同酶解温度对酶解效果的影响，图中a、b、c、d为差异显著性分析标准，标记相同字母表示差异不显著，标记不同字母表示差异显著；

图5是本发明菌种接种量对发酵液风味值及游离氨基态氮含量的影响；

图6是本发明菌种比例对发酵液风味值及游离氨基态氮含量的影响；

图7是本发明菌种发酵时间对发酵液风味值及游离氨基态氮含量的影响；

图8是本发明合浦珠母贝肉酶解液发酵前后挥发性风味成分总离子流图，其中a图为发酵前，b图为发酵后。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的利用菌种发酵制备合浦珠母贝肉调味基料的加工方法，包括以下步骤：

(1)原料预处理：合浦珠母贝，取肉、洗净、匀浆，按原料与水质量比为1∶1制备成合浦珠母贝肉匀浆液；

(2)酶解液制备：在合浦珠母贝肉匀浆液中加入复合蛋白酶进行酶解，酶用量为3000u/g(原料)、酶解温度30℃，添加蛋白酶后放置于恒温搅拌锅中进行酶解3h后冷却，在转速为6000r/min的离心机中离心15min；

(3)酶解液发酵：取离心后的上清液接种发酵菌种米曲霉和鲁氏酵母菌进行发酵：添加2％(占酶解液总质量)菌体浓度为2×10⁸cfu/g的米曲霉发酵36h后，再添加3％(占酶解液总质量)菌体浓度为1×10⁸cfu/g的鲁氏酵母菌发酵24h；

(4)喷雾干燥：在合浦珠母贝肉发酵液中添加10％的麦芽糊精为助干剂进行喷雾干燥，进料流量4ml/min，进料温度控制在55℃，出口温度170℃，喷雾压力16mpa。

在本工艺生产中，经检测发现，合浦珠母贝肉匀浆液的水解度为40％，酶解液游离氨基态氮含量达到4g/l。合浦珠母贝肉调味基料终产品低分子肽段(<1kda)的含量占总肽含量的80％。

水解度(dh)的测定参照以下方法：

dh＝(an-an0)/n×100％

式中：an，合浦珠母贝肉酶解液中游离氨基氮的含量(g/100g)；an0，合浦珠母贝肉糜液酶解前氨基氮的含量(g/100g)；n，合浦珠母贝肉中总蛋白氮的含量(g/100g)。

游离氨基氮含量的测定采用甲醛电位滴定法，测定方法：zbx66038—1987氨基态氮测定法[s].北京:中华人民共和国商业部副食品局,1987。

本发明合浦珠母贝肉酶解液发酵前后挥发性风味成分总离子流图如图8中所示，其中a图为发酵前，b图为发酵后，并在感官评定中表现出良好的，令人愉悦的风味。

采用hs-spme法和gc-ms法联用技术测定样品中挥发性风味成分，具体检测方法如下：

吸取5ml的样品置于顶空瓶中，将萃取头，在温度为250℃老化30min后，然后于55℃恒温下将针插入顶空瓶上方吸附40min，随后将萃取头取出插入气相色谱进样口等待下一步的分析检测。

当萃取头在进口温度250℃，解吸10min后取出。气相色谱条件为：采用db-5ms(30m×0.25mm，0.25μm)色谱柱；程序升温：柱初温35℃，保持1min，以5℃/min的速度升温到60℃保持1min，再以6℃/min上升到140℃保持1min，最后以8℃/min升温到230℃，保持5min；载气：氦气；流量1.0ml/min。

质谱条件：离子源温度为200℃；电子能量70ev；质量扫面范围m/z35-350。

表1合浦珠母贝肉酶解液发酵前后挥发性成分组成

注：“--”表示未检测出

发酵前后酶解液里挥发性风味成分变化表现如下，合浦珠母贝肉酶解液未发酵前共测得29种挥发性成分，其中各类挥发性组分占总挥发性成分含量为醛类0.3％、醇类11.08％、烃类0.57％、酮类0.14％、酸类8.13％、含氮类1.9％、含硫类4.23％、杂环类15.58％。经过发酵后，挥发性成分增加至56种，风味成分更加丰富和复杂，其中各类组分占总挥发性成分含量变为醛类12.85％、醇类6.22％、烃类0.16％、酮类3.1％、酸类6.45％、含氮类0.66％、含硫类3.12％、杂环类2.84％。

实施例2

本实施例采用原料为冷冻合浦珠母贝肉，包括以下步骤：

(1)原料预处理：合浦珠母贝，取肉、洗净、匀浆，按原料与水质量比为1∶2制备成合浦珠母贝肉匀浆液；

(2)酶解液制备：在合浦珠母贝肉匀浆液中加入复合蛋白酶进行酶解，酶用量为5000u/g(原料)、酶解温度38℃。添加蛋白酶后放置于恒温搅拌锅中进行酶解4h后冷却，在转速为7500r/min的离心机中离心20min；

(3)酶解液发酵：取离心后的上清液接种发酵菌种米曲霉和鲁氏酵母菌进行发酵：添加1.5％(占酶解液总质量)菌体浓度为1.5×10⁸cfu/g的米曲霉发酵28h后，再添加3％(占酶解液总质量)菌体浓度为2×10⁸cfu/g的鲁氏酵母菌发酵24h；

(4)喷雾干燥：在合浦珠母贝肉发酵液中添加15％的麦芽糊精为助干剂进行喷雾干燥，进料流量3ml/min，进料温度控制在50℃，出口温度165℃,喷雾压力20mpa。

按本工艺生产中，合浦珠母贝肉匀浆液的水解度为32％，酶解液游离氨基态氮含量达到3.2g/l。合浦珠母贝肉调味基料终产品低分子肽段(<1kda)的含量占总肽含量的76％。合浦珠母贝肉酶解液发酵前后挥发性成分组成见表1，共检出多种风味成分如醛类、醇类、烃类、酮类、酸类、含氮类、含硫类和杂环类等，并在感官评定中表现出良好的，令人愉悦的风味。

实施例3

本实施例采用的原料为鲜合浦珠母贝肉，包括以下步骤：

(1)原料预处理：合浦珠母贝，取肉、洗净、匀浆，按原料与水质量比为1∶3制备成合浦珠母贝肉匀浆液；

(2)酶解液制备：在合浦珠母贝肉匀浆液中加入复合蛋白酶进行酶解，酶用量为6000u/g(原料)、酶解温度45℃。添加蛋白酶后放置于夹层锅中进行酶解5h后冷却，在转速为9000r/min的离心机中离心30min；

(3)酶解液发酵：取离心后的上清液接种发酵菌种米曲霉和鲁氏酵母菌进行发酵：添加3％(占酶解液总质量)菌体浓度为4×10⁸cfu/g的米曲霉发酵48h后，再添加3％(占酶解液总质量)菌体浓度为4×10⁸cfu/g的鲁氏酵母菌发酵24h；

(4)喷雾干燥：在合浦珠母贝肉发酵液中添加20％的麦芽糊精为助干剂进行喷雾干燥，进料流量6ml/min，进料温度控制在60℃，出口温度180℃,喷雾压力30mpa。

按本工艺生产中，合浦珠母贝肉匀浆液的水解度为25％，酶解液游离氨基态氮含量达到2g/l。合浦珠母贝肉调味基料终产品低分子肽段(<1kda)的含量占总肽含量的70％。合浦珠母贝肉酶解液发酵前后挥发性成分组成见表1，共检出多种风味成分如醛类、醇类、烃类、酮类、酸类、含氮类、含硫类和杂环类等，并在感官评定中表现出良好的，令人愉悦的风味。

本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。