用于抑制青少年口腔异味的银荷果口嚼片的制作方法

本发明属于食品领域，涉及一种用于抑制青少年口腔异味的银荷果口嚼片。

背景技术：

导致口腔异味的主要原因是口腔内的产臭菌(胡赟,胡德渝,郑雷蕾,等.口臭研究模型的建立及其对口腔致臭菌的确定[j].华西口腔医学杂志,2007,25(03):226-229.doi:doi:10.3321/j.issn:1000-1182.2007.03.006)。目前抑制口腔异味一般使用抗菌的化学药物或含漱剂，有一定副作用，而且细菌容易产生耐药性，长期效果不佳(范亚贤,王者玲,杨圣辉,等.口臭与主要产臭菌的相关性分析[j].北京口腔医学,2005,13:221-223.doi:doi:10.3969/j.issn.1006-673x.2005.04.005；范亚贤,王者玲,杨圣辉.口源性口臭患者主要厌氧菌的分布[j].中国微生态学杂志,2006,01期:37-38.doi:doi:10.3969/j.issn.1005-376x.2006.01.015)。专家提示我们，一些具有抑菌等作用的药食同源的中草药可能对抑制口腔异味具有良好的效果，并能避免化学药的缺点。但目前使用中草药抑制口腔异味的产品，多数是利用中药汤剂或利用中药单体进行抑菌研究，口感不佳，配方复杂，剂型也不适于青少年使用。目前还缺乏针对青少年口腔异味的天然植物配方和剂型。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于抑制青少年口腔异味的银荷果口嚼片。

本发明提供的提取液，包括如下三种原料的水提液：金银花、藏青果和薄荷。

具体的，所述提取液也可只由如下三种原料的水提液组成：金银花、藏青果和薄荷。

上述提取液中，所述金银花、藏青果、薄荷的质量比为4-6:1:1，具体为5:1:1。

所述水提液均为按照如下方法制得：将原料和水混合进行旋转蒸发；

所述旋转蒸发步骤中，温度为100℃；转速为120转/min；

所述金银花与用于旋转蒸发的水的质量比为1：16。

本发明还提供了口嚼片，该口嚼片含有前述本发明提供的提取液浓缩所得浸膏。

所述口嚼片还可包括辅料；所述辅料具体为甘露醇、一水柠檬酸、阿斯巴甜和硬脂酸镁。

所述口嚼片中，所述提取液浓缩所得浸膏与甘露醇的质量比为1：100；

所述甘露醇、一水柠檬酸、阿斯巴甜和硬脂酸镁的质量比为500：0.5：0.1：5。

另外，上述本发明提供的提取液或口嚼片在抑制口腔异味中的应用，也属于本发明的保护范围。具体的，该口嚼片一次食用两片，即可产生即可的口腔异味抑制作用。

此外，本发明还要求保护上述本发明提供的提取液或口嚼片在制备抑制牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌的产品中的应用以及活性成分为所述提取液或口嚼片的抑制牙龈卟啉单胞菌和/或具核梭杆菌的产品。

本发明首次针对青少年口腔异味自主设计了一种口嚼片，其剂型、口感和规格尤其适用于青少年，该口嚼片一次食用两片银荷果口嚼片可产生即刻的口腔异味抑制作用，而且作用缓释、效果较持久，价格低廉、易于推广。

金银花、藏青果、薄荷的质量比为5:1:1的银荷果提取液对口腔异味主要致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌均有明显的抑菌效果。

2)银荷果提取液的最小抑菌浓度为6.25％。

3)银荷果口嚼片口感良好、食用方便安全，易于推广。

4)，并且效果具有一定的持续性。

附图说明

图1为两种厌氧菌镜下形态(1000倍)；a为牙龈卟啉菌pg，b为具核梭杆菌fn。

图2为提取后的银荷果浸膏和制成的银荷果口嚼片。

图3为银荷果提取液对两种细菌的抑菌效果；a为牙龈卟啉菌pg，b为具核梭杆菌fn。

图4为银荷果提取液对不同细菌的抑菌环直径(cm)。

图5为不同药物配比银荷果提取液的抑菌效果。

图6为不同浓度银荷果浸膏的抑菌效果。

图7为咀嚼前后唾液细菌菌落生长情况。

图8为咀嚼前后唾液抑菌效果。

图9为咀嚼前h2s重复测定结果。

图10为银荷果口嚼片咀嚼前后口腔中h2s含量的变化。

图11为咀嚼前后口腔异味人群比例的变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

实施例1、

2.实验材料及方法

2.1实验材料

供试材料：

金银花、薄荷，采集于北京市第一〇一中学和圆明园。

藏青果，购买于同仁堂药店。

口嚼片辅料(甘露醇，一水柠檬酸，阿斯巴甜，硬脂酸镁)

cdc培养基(胰蛋白胨，大豆蛋白胨，酵母提取物，氯化钠，l-半胱氨酸，琼脂，氯化血红素，维生素k1，无菌脱纤维羊血)

供试菌种：

牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)，具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)，由北京口腔医学研究所提供。

实验仪器：

旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)

zdhv型5000ml电热套(北京中兴伟业仪器有限公司)

精密电子天平fa1204b(上海精科天美贸易有限公司)

中药研磨机(广州市旭朗机械设备有限公司)

超净工作台(北京半导体设备一厂)

spx-150b型生化培养箱(上海跃进医疗器械厂)

dp-30型单冲压片机(国药龙立制药机械有限公司)

热风循环烘箱(江阴市康和机械制造有限公司)

搅拌器(苏海供热设备有限公司)

oc-132口气测定仪(北京天跃环保科技有限公司)

实验用具：

圆底烧瓶、套袋、不锈钢锅、量筒、培养皿、称量纸、药勺、移液器、移液管、接种环、厌氧罐。

2.2实验方法

称重法、旋蒸提取法、压片法、培养基制作、观察法、测量法、自身前后对照法、统计法

3.实验过程

3.1银荷果口嚼片的制备

3.1.1银荷果浸膏的制备

设置三种原料配比比例(4:1:1、5:1:1、6:1:1)，分别称取晒干金银花、薄荷和干藏青果，破碎机破碎藏青果，加入蒸馏水用旋转蒸发仪旋蒸两次，然后将金银花和薄荷放入套袋内旋蒸，得三种提取液进行抑菌实验选择最佳比例。旋蒸仪设置温度100℃，转速120转/min。最后，按照得出的最佳比例5:1:1，称取金银花7.5斤、薄荷1.5斤和干藏青果15斤和水120斤混合进行旋蒸，得混合提取液20l，在2000w电磁炉上继续加热蒸发成浸膏，测定密度。4°冰箱冷藏备用。

3.1.2银荷果口嚼片的制备

称取银荷果浸膏和辅料，将辅料甘露醇500mg、一水柠檬酸0.5mg、阿斯巴甜0.1mg分别过80目筛备用，再过40目筛混合3次。加入银荷果浸膏5mg，混合搅拌制备软材，至可手握成团一碰即散时过20目筛制粒，烘干、加入5mg硬脂酸镁，压片而得。

3.2银荷果口嚼片的抑菌效果实验

3.2.1培养基制备

制备cdc培养基培养细菌。其组成为：蒸馏水1000ml，胰蛋白胨15g，大豆蛋白冻胨5g，酵母提取物5g，氯化钠5g，l-半胱氨酸400mg，琼脂16g，氯化血红素5mg，维生素k110mg，无菌脱纤维羊血50ml。naoh调ph值至7.0-7.5，180℃高压灭菌20min。

取1000ml蒸馏水于锥形瓶中，按上述配方称取各种药依次加入锥形瓶中，搅拌均匀，270℃水浴至完全熔化，灭菌后取出冷却至50℃，按15ml/皿倒在培养皿中。

3.2.2实验菌株培养

将保种的pg菌株、fn菌株取出，与生理盐水混匀后，用接种环将菌株涂布于cdc培养基上，标记菌株名称，置于厌氧罐中，密封，抽出氧气，充入氮气、氢气与二氧化碳混合气，37℃恒温培养，进行细菌复苏。5天后取出，选取少量细菌，接种在新培养基上三线法接种于培养基上厌氧传代培养，5天后显微镜下根据形态确定所培养细菌再传代培养一次。5天后再从固体培养基上取菌落少许，置于离心管液体培养基中，进行细菌液体培养，37℃厌氧培养48h。

采用比浊法调整两种细菌悬液的浓度，调整至浊度为0.5麦氏单位(1-2×10⁸cfu/ml)，并将细菌浓度稀释为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²cfu/ml梯度。以去离子水为对照组，用移液器吸取不同浓度的两种细菌悬液各0.1ml，无菌涂布于培养基上，将分别浸泡不同药物配比的银荷果提取液和去离子水的滤纸片贴在培养皿上，置于厌氧罐中37℃培养5天，观察抑菌环情况。

采用连续稀释法将每种药物配比的银荷果提取液稀释为6个浓度梯度。两种细菌悬液各取0.1ml，分别涂布于培养基上，将浸泡过不同浓度药液的滤纸片贴在培养皿上，每个培养基上置6个，重复三个培养皿，厌氧培养，观察滤纸片周围是否形成抑菌环，如图1所示两种厌氧菌镜下形态(1000倍)，其中，a为牙龈卟啉菌pg，b为具核梭杆菌fn。

3.2.3体内抑菌实验

观察实验中所有受试者，在咀嚼前、咀嚼后即刻、咀嚼后1小时，采用自然流取法分别收集自然混合唾液各5ml，稀释后均匀涂布于cdc培养基上，每个标本重复两次，厌氧培养48小时。

3.3银荷果口嚼片的应用效果实验

试验设计为自身前后对照试验。

3.3.1研究人群

在学校初一年级内随机抽取男女生共54人进行测试。要求受试者全身健康，无广泛口腔疾病。

3.3.2实验前准备

受试者签署知情同意书。晨起不刷牙漱口、不进食；勿咀嚼口香糖、除臭剂、芳香剂等。培训使用口气测定仪方法及试验要求。

3.3.3银荷果口嚼片咀嚼前后口腔异味检测

测试时先闭口两分钟，调试机器，志愿者口含圆管，屏气。到机器数值开始稳步下降时记录数据。重复三次，观察测量稳定性，取平均值作为咀嚼前口气基线数值。然后每人发两颗口嚼片，在规定时间2分钟内食用完毕，立即测试口气，记录即刻数值。一小时后再次测定。

3.3.4统计分析

采用excel软件建立观察实验数据库，采用方差分析、秩和检验、配对t检验进行统计分析。

4.结果与分析

4.1银荷果口嚼片制备

图2是利用金银花、藏青果和薄荷叶提取有效成分后所得的银荷果浸膏，以及加入辅料压片而成的银荷果口嚼片。片重为500±25mg，压片硬度为10-15kgf。口感酸甜，易崩解。

提取后得到25l银荷果原液，加热至达到可以压片要求的性状时测定密度。采用中华药典中金银花主要成分含量测算方法，利用重量与体积比计算，取200ml浸膏测重124g，计算得出密度0.6g/ml。控制在此密度水平，按比例加入辅料，使每粒口嚼片有效成分含量为5mg，每片有效成分浓度为1％。控制最小抑菌浓度和密度，能达到抑菌效果的最小有效成分含量为7.5mg，即食用方法为一次两片。

本发明开发口嚼片时充分考虑了青少年特殊的年龄和行为特征。青少年由于处于集体环境中，且不易坚持，难以长期配合复杂治疗。口嚼片可在口腔内嚼碎后咽下，质量稳定、服用方便。嚼碎后便于吞服，表面积增大，起效快，在咀嚼时间中，大多数药物保留在口内，作用范围大。对于难崩解的药物，制成口嚼片可加速其崩解，提高药效，优于中药汤剂、茶、漱口水、口香糖等方法。

4.2抑菌效果实验研究

4.2.1银荷果提取液体外抑菌效果实验研究

表1、银荷果提取液抑菌效果

+表示有抑菌环出现，-表示无抑菌环

如图3所示，涂有两种细菌的培养基上，含药液滤纸片周围都形成了抑菌环，去离子水浸泡过的滤纸片周围没有抑菌环出现。

表2、不同配比银荷果提取液对不同浓度牙龈卟啉单胞菌(pg)的抑菌环直径(cm)

表3、不同配比银荷果提取液对不同浓度具核梭杆菌(fn)的抑菌环直径(cm)

在细菌浓度为10⁴、10⁵、10⁶cfu/ml时，不同药物配比的银荷果提取液对两种细菌的抑制效果较明显。

如图4和图5所示，在药物配比为5:1:1时，所有样本银荷果提取液对两种细菌产生的抑菌环直径均比相同条件下药物配比为4:1:1、6:1:1的银荷果提取液产生的抑菌环大，从而确定5:1:1为最佳配比。

4.2.2银荷果浸膏的最小抑菌浓度测定

表4、不同浓度银荷果浸膏(5:1:1)抑菌环的直径(cm)

如图6所示，5:1:1的银荷果浸膏对两种细菌能够产生抑制作用的最小浓度为6.25％，低于此浓度则未见有抑菌环产生。

4.2.3银荷果口嚼片体内抑菌效果实验研究

表5、咀嚼银荷果口嚼片前后细菌菌落数

秩和检验：三组p<0.05，两组间p均<0.01。

对不同时刻唾液样本稀释接种的培养基进行菌落计数，如图7和图8结果显示，与咀嚼前相比，咀嚼后即刻和咀嚼1小时后，菌落数均明显减少，其中咀嚼后即刻菌落生长抑制最明显，差异具有统计学意义(p<0.01)。

4.3银荷果口嚼片抑制口腔异味观察实验

4.3.1受试人群基本情况：

受试者54人，年龄12-14岁，男20人，女34人。

4.3.2银荷果口嚼片咀嚼前后口气测定

在咀嚼前重复测定口气值三次，结果无统计学差异。说明仪器性能稳定，受试者掌握吹气方法良好，测定结果可靠。

表6、咀嚼银荷果口嚼片前后口气值的变化

口气测定仪利用化学反应的原理，以数字的方式表示口腔中h2s的ppb浓度，从而反应有无口气。当口气值大于100ppb时，就可闻到口腔异味，而大于150ppb时则可闻到明显的口腔异味。咀嚼银荷果口嚼片后，口气值显著下降近50％，差异具有明显统计学意义。随着时间延长，口气值虽在缓慢回升，但在1小时后再行检测，口气值仍维持100ppb以内，与咀嚼前相比，下降仍具有显著统计学差异，说明银荷果口嚼片的抑菌作用仍在持续。

如图9-图11所示，在所有54名受试人群中，咀嚼前49人口气值在100ppb以上，可以闻到口腔异味存在，占90.7％。而其中30人的口气值在150ppb以上，可以明显闻到口腔异味，占55.6％，11人更是高达200ppb以上。说明口腔异味在青少年群体中是一常见问题。而咀嚼银荷果口嚼片后，口气值超过100ppb的人数百分比迅速下降至22.2％，只有1人仍可闻及明显口腔异味，但也较其基线值明显下降。1小时后口气值超过100ppb的人群比例增加至44.4％，但仍然明显低于咀嚼前水平，差异仍有显著统计学意义，原因可能是由于银荷果口嚼片的有效成分在口腔内停留的时间较长所致。

5.研究结论

1)金银花、藏青果、薄荷的质量比为5:1:1的银荷果提取液对口腔异味主要致病菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌均有明显的抑菌效果。

2)银荷果提取液的最小抑菌浓度为6.25％。

3)银荷果口嚼片口感良好、食用方便安全，易于推广。

4)一次食用两片银荷果口嚼片可产生即刻的口腔异味抑制作用，并且效果具有一定的持续性。