半胱氨酸作为肠道必需营养素在动物健康维护中的应用的制作方法

本发明属于畜牧养殖和饲料加工工艺领域，涉及半胱氨酸作为肠道必需营养素在动物健康维护中的应用。

背景技术：

传统上认为蛋氨酸是人和动物的必需氨基酸，蛋氨酸在体内除了履行自身生理功能之外，还可以转化为半胱氨酸，并进而通过脱氢反应合成胱氨酸。半胱氨酸和胱氨酸在机体内可以相互转化，但不能转化为蛋氨酸。半胱氨酸、胱氨酸可以蛋氨酸为前体物转化而来，因此也称为半必需氨基酸。目前在动物饲养中，通常是通过在日粮中添加蛋氨酸来弥补半胱氨酸的缺乏。

动物消化道时常遭受各种应激(如断奶应激、换料应激、气温变化引起的应激)、病原微生物和霉菌毒素的侵袭，甚至因感染而发生炎症反应，引起食欲不振，腹泻、消化道功能紊乱等，对动物健康和生长有重大打击，因此如何配合临床手段快速恢复动物消化道健康和正常生理功能具有重要的经济价值和动物福利意义。特别是刚断奶的仔猪往往会发生许多消化道疾病，通过营养措施促进肠道发育，对于改善仔猪的生长性能，提高生产效率尤为重要。

外部原因引起动物腹泻、炎症或应激反应，消化道出现功能障碍，临床上通常需要快速检查日粮，去除可能有毒或有害的饲料原料，并给动物肠道提供抑制微生物的药物，给肠道消炎、补充能量物质和恢复离子平衡的治疗措施来治疗肠道疾病。研究表明，半胱氨酸间接参与谷胱甘肽、牛磺酸等含硫生物活性物质的合成。但是，半胱氨酸在猪生产中的研究较少，并且半胱氨酸对仔猪生长性能以及肠道发育的影响还未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种动物肠道保健的新方法和一种半胱氨酸的新用途。

具体而言，本发明提供的以下几方面应用均属于本发明的保护范围：

第一，半胱氨酸或者半胱氨酸制剂作为肠道必需营养素在动物健康维护中的应用。所述半胱氨酸制剂的主要成分为半胱氨酸或者在消化道内能够转化为半胱氨酸的物质。

其中，所述动物肠道必需营养素用于补充动物肠道所缺半胱氨酸。

第二，半胱氨酸或者半胱氨酸制剂在作为或制备如下任一产品中的应用：动物肠道保健产品、用于动物消化道疾病治疗的辅助产品、用于动物消化道术后恢复的辅助产品。所述半胱氨酸制剂的主要成分为半胱氨酸或者在消化道内能够转化为半胱氨酸的物质。

其中，所述产品用于补充动物肠道所缺半胱氨酸。

第三，半胱氨酸或者半胱氨酸制剂在作为或制备如下任一产品中的应用：用于促进动物肠道发育的产品、用于促进动物生长的产品、用于维护动物健康的产品。所述半胱氨酸制剂的主要成分为半胱氨酸或者在消化道内能够转化为半胱氨酸的物质。

其中，所述产品用于补充动物肠道所缺半胱氨酸。

另外，本发明还保护如下两种方法：

第一，一种补充动物肠道所缺半胱氨酸的方法，是通过在动物饲料或日粮中添加半胱氨酸或者半胱氨酸制剂来实现的；而不是通过在动物饲料或日粮中添加蛋氨酸来实现。本发明方法弥补了传统方法通过在动物饲料或日粮中添加蛋氨酸无法满足肠道对半胱氨酸的需求。

第二，一种缓解动物肠道细胞因半胱氨酸缺乏所引起的活力下降的方法，是通过向所述动物肠道细胞的培养体系中加入半胱氨酸或者半胱氨酸制剂或谷胱甘肽来实现的；而不是通过向所述动物肠道细胞的培养体系中加入蛋氨酸或丙酮酸钠来实现。

在上述两种方法中，所述半胱氨酸制剂的主要成分均为半胱氨酸或者在消化道内能够转化为半胱氨酸的物质。

在上述各应用和方法中，所述在消化道内能够转化为半胱氨酸的物质为任何能够在消化道内能够转化为半胱氨酸的物质，如半胱氨酸盐、胱氨酸或胱氨酸盐等。

在上述各应用和方法中，所述动物包括但不限于猪，如断奶仔猪。在本发明的一个实施例中，所述动物肠道细胞具体为猪肠道上皮细胞，更加具体的，如IPEC-J2细胞。

另外，本发明还要求保护一种用于饲养猪的饲料或日粮及其配制方法。

在所述用于饲养猪的饲料或日粮中，标准回肠可消化(Standardized Ileal Digestible,SID)半胱氨酸含量大于等于0.32％。其中，％表示质量百分含量。

进一步，在所述用于饲养猪的饲料或日粮中，SID蛋氨酸含量为0.36％，SID半胱氨酸含量为0.32％。其中，％表示质量百分含量。

本发明首先用猪肠道上皮细胞IPEC-J2细胞模型证明了半胱氨酸是肠道的必需氨基酸，半胱氨酸缺乏造成上皮细胞活力下降，培养基中补充蛋氨酸不能缓解半胱氨酸缺乏引起的细胞活力下降，但是补充半胱氨酸代谢物谷胱甘肽能够缓解上述效应，该结果表明半胱氨酸是通过合成谷胱甘肽来发挥其促进肠道发育和维持肠道上皮细胞活力的功能，并且肠道上皮细胞不能利用蛋氨酸转化为半胱氨酸。因此我们认为，当日粮中半胱氨酸不足时，动物肠道所需要的半胱氨酸是由肝脏将蛋氨酸转化为半胱氨酸，因为肝脏有蛋氨酸转硫基作用相关酶。随后，我们设计、配制了包含不同水平蛋氨酸和半胱氨酸的日粮，来饲喂仔猪。发现当日粮中蛋氨酸和半胱氨酸水平分别为美国科学研究委员会(2012)(National Research Council,NRC 2012)猪营养需要推荐量时，仔猪平均日增重最高，并且一定水平的半胱氨酸添加有增加采食量的效果。从而证明了半胱氨酸作为猪肠道必需氨基酸能够提高动物生长性能。本发明提示了半胱氨酸/胱氨酸作为肠道必需氨基酸的作用，为维护动物肠道健康和正常生理功能提供了有效的营养技术措施；本发明提供了一种比在日粮中利用蛋氨酸补充动物对半胱氨酸/胱氨酸需要更有效的日粮配制技术，为高效、健康的养猪生产提供了科学依据。

附图说明

图1为半胱氨酸缺乏和蛋氨酸添加对猪空肠上皮细胞活力的作用。结果表示以对照组作为参照的相对水平。结果由平均值±标准误差表示，n＝8。a-b：不同组均值具有不同肩标视为差异显著(P<0.05)。处理一：培养基中缺乏半胱氨酸和胱氨酸；处理二：在处理一中添加0.2mmol/L蛋氨酸；处理三：在处理一中添加0.4mmol/L蛋氨酸；处理四：在处理一中添加0.8mmol/L蛋氨酸；处理五：在处理一中添加1mmol/L蛋氨酸。

图2为半胱氨酸缺乏和相关代谢产物添加对猪空肠上皮细胞活力的作用。结果表示以对照组作为参照的相对水平。结果由平均值±标准误差表示，n＝8。a-b：不同组均值具有不同肩标视为差异显著(P<0.05)。处理一：培养基中缺乏半胱氨酸和胱氨酸；处理二：在处理一中添加0.2mmol/L谷胱甘肽；处理三：在处理一中添加0.2mmol/L丙酮酸钠；处理四：在处理一中添加0.3mmol/L丙酮酸钠；处理五：在处理一中添加0.4mmol/L丙酮酸钠。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％如无特殊说明均为质量百分含量。

DMEM-F12培养基、抗生素、胰蛋白酶和PBS、胎牛血清(Gibco公司，美国)。

细胞培养板(Corning公司，美国)。

不含非必需氨基酸的DMEM培养基(US biological公司，美国)。

细胞计数试剂盒(CCK-8，日本同仁)。

氨基酸、谷胱甘肽、丙酮酸钠(Sigma，美国)。

猪空肠上皮细胞IPEC-J2(DSMZ公司，德国)。

玉米，去皮豆粕，膨化大豆，小麦麸，鱼粉，乳清粉，碳酸氢钙，石粉，食盐，仔猪用预混料：购自北京同力兴科农业科技有限公司。

饲用氨基酸：购自北京嘉康源科技发展有限公司。

二氧化碳培养箱(MCO-175)：Sanyo公司，日本。

多功能酶标仪(SpectraMax M3)：Molecular Devices公司，美国。

实施例1、半胱氨酸缺乏降低猪空肠上皮细胞IPEC-J2的活力

一、IPEC-J2细胞的培养

接种5,000～10,000IPEC-J2细胞于96孔板中，每孔加入100μL DMEM-F12完全培养基(Gibco的DMEM-F12培养基，添加10％的胎牛血清和1％的抗生素)，于37℃5％CO₂培养箱中培养，隔天换液，设置空白对照。

二、IPEC-J2细胞培养试验

当细胞生长至70％融合时，进行以下处理：(1)培养基中缺乏半胱氨酸和胱氨酸(相比前文所说的“DMEM-F12完全培养基”仅缺乏半胱氨酸和胱氨酸)处理24h，(2)在缺乏半胱氨酸和胱氨酸培养基中添加0.2,0.4,0.8,1mmol/L蛋氨酸处理24h，(3)在缺乏半胱氨酸和胱氨酸培养基中添加0.2mmol/L谷胱甘肽或0.2,0.3,0.4mmol/L丙酮酸钠处理24h。每组设计8个重复，每孔加入10μL CCK-8试剂，于37℃5％CO₂培养箱中反应3h，酶标仪450nm下测定吸光度值，该指标与细胞活力呈正相关。

三、试验结果

如图1和图2所示，缺乏半胱氨酸显著降低了猪肠道上皮细胞的活力，在半胱氨酸缺乏的情况下添加不同浓度的蛋氨酸不能缓解半胱氨酸缺乏引起的IPEC-J2细胞活力的下降，但是添加谷胱甘肽能够弥补半胱氨酸缺乏引起的效应。说明半胱氨酸为猪肠道上皮细胞的必需氨基酸，不能通过补充蛋氨酸来补充其生理功能。并且当补充半胱氨酸代谢物谷胱甘肽和丙酮酸钠时，仅在补充谷胱甘肽时能够缓解半胱氨酸缺乏引起的猪肠道上皮细胞活力下降。因此，半胱氨酸是肠道上皮细胞的必需氨基酸，并且半胱氨酸对肠道细胞生长的作用主要通过合成谷胱甘肽来实现。

实施例2、日粮半胱氨酸水平影响断奶仔猪的生长

试验选用96头初始体重为11±0.28kg的断奶仔猪，随机分为4组，每组24头。四个处理分别为：(1)对照组，日粮SID蛋氨酸为0.48％，SID半胱氨酸为0.21％；(2)处理组一到三，日粮SID蛋氨酸为0.36％(NRC 2012推荐量)，SID半胱氨酸分别为0.21％、0.32％(NRC 2012推荐量*)及0.43％。日粮配制参照NRC(2012)，并且保持日粮中所有必需氨基酸标准回肠消化率含量、代谢能和电解质的平衡。试验动物自由采食与饮水，试验周期为28天。试验日粮组成见表1，营养水平见表2。

注：*NRC 2012标准中推荐了“SID蛋氨酸的需要量”和“SID蛋氨酸与半胱氨酸的总需要量”，但是没有推荐“SID半胱氨酸的量”，将NRC 2012推荐的SID蛋氨酸与半胱氨酸的总量减去NRC 2012推荐的SID蛋氨酸的量后为0.32％，故而在本实施例中称“0.32％为NRC 2012推荐的SID半胱氨酸的量”。

表1试验日粮组成(饲喂基础)

注：¹每千克全价料提供10000IU维生素A，1500IU维生素D3，30IU维生素E，2.5mg维生素K3，1.5mg维生素B1，10mg维生素B2,10mg维生素B6，0.05mg维生素B12，1mg叶酸，0.5mg生物素，30mg烟酸，20mg泛酸，20mg铜，100mg铁，110mg锌，40mg锰，0.3mg硒，0.54mg碘，100mg甜味剂，500mg香味剂，100mg植酸酶。

表2日粮营养水平

注：¹STTD，标准全肠道消化率。

如表3，处理二(SID半胱氨酸为0.32％)的平均日增重和末重均为最高，说明蛋氨酸和半胱氨酸分别满足各自需要量时效果最理想；并且一定水平的半胱氨酸添加有增加采食量的效果；耗料增重比在各组之间没有显著变化。说明传统方法在动物日粮中添加蛋氨酸无法满足动物对半胱氨酸的需求。

表3回肠标准可消化半胱氨酸水平对断奶仔猪生长性能的影响

注：¹处理是指多重比较的结果，线性和二次指日粮标准回肠可消化半胱氨酸水平的效应；同行肩标不同表示差异显著(P＜0.05)，n＝6。

综合实施例1和实施例2的结果，可见：半胱氨酸是猪肠道上皮细胞的必需氨基酸，当半胱氨酸和胱氨酸缺乏时，肠道上皮细胞活力下降。补充蛋氨酸不能缓解半胱氨酸和胱氨酸缺乏引起的细胞活性的下降，但是补充半胱氨酸代谢物谷胱甘肽能够缓解上述效应。与传统配合饲料蛋氨酸弥补半胱氨酸的缺乏相比，蛋氨酸和半胱氨酸分别为NRC 2012推荐量时，断奶仔猪的平均日增重和终体重均为最佳，说明半胱氨酸作为营养性必需氨基酸能够提高断奶仔猪的生长性能。