本发明属于发酵食品工程领域，具体涉及一种火龙果酵素的制备方法。
背景技术：
火龙果（pitaya）在广西、广东、海南等地有一定规模的种植，近几年，浙江省果农引进优质火龙果品种，杭州、嘉兴、台州、金华等地已有大片火龙果生产基地。火龙果营养丰富，富含多酚、黄酮、维生素、膳食纤维、蛋白质和各种微量元素，还含有一般水果少有的植物性白蛋白和特有的花青素成分，属于高维生素、低糖、低脂的“一高两低”功能食品，在抗氧化、抗癌、抑菌、调节机体免疫功能等方面具有良好功效。火龙果中富含原花青素、原儿茶酸、香草酸等多酚类物质，也含有苹果酸、柠檬酸等酸类物质，具有较强的抗氧化活性，可以清除人体过剩的自由基，缓解人体器官的衰老。火龙果花富含植物蛋白、低聚糖、水溶性膳食纤维、花青素和多种维生素等，具有预防高血压等多种功效。
食用植物酵素（edibleplantsourcejiaosu）是以一种或多种新鲜蔬菜、水果和谷豆类、海洋本草类、食药两用本草类、菌菇类等食材为原料，加（或不加）糖类物质，在较低温度下，经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性微生物发酵产品，拥有丰富的代谢产物功能成分、植物本身营养成分和益生菌本身功能成分等，特别是富有小分子功能成分，研究表明该类产品具有抗衰老、抗菌消炎、净化血液、增强机体免疫能力及解毒抗癌等多种保健功能。以火龙果为原料进行火龙果食用植物酵素的制备，有利于保持火龙果的营养成分，同时发酵过程中的功能性成分如有机酸和蛋白质、氨基酸等也能够较好地保持。
市场上火龙果基本以鲜销为主，其精深加工和规模化生产产品较少，关于火龙果酵素的研究报道较少。中国发明专利cn201610524958.x公开了一种红心火龙果酵素及其制备方法，以火龙果、冰糖、甜酒粉、水、花生末、香草粉、香蕉汁为原料，通过洗净去皮、切块丁、发酵、沉淀过滤、冷藏等步骤制得。中国发明专利cn201610524772.4公开了一种酸甜火龙果酵素及其制备方法，以火龙果、青柠檬片、红枣、冰糖、甜酒粉、水、芝麻粉、薄荷粉、青苹果汁为原料，通过洗净去皮、切块丁、发酵、沉淀过滤、冷藏等步骤制得。中国发明专利cn201510983121.7公开了一种火龙果酵素的制作方法，以火龙果、红糖和柠檬为原料（重量比为1:1:0.3），室内常温条件下密封发酵2个月制得。中国发明专利cn201710285375.0公开了火龙果酵素原浆及其制备方法，分别通过酵母发酵、醋酸菌发酵和乳酸菌发酵制得。目前在火龙果酵素制备上的研究报道还只限于少于半年的短期发酵，而且极少有关于营养型和功能型火龙果酵素产品的报道，对于火龙果酵素的功能性成分分析也鲜有报道。
技术实现要素：
为了弥补现有发明技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种火龙果酵素的制备方法，本方法可良好地保留火龙果原料中的功能性营养成分，充分发挥火龙果的营养价值，生产工艺易行，适用于工业化大规模生产。
本发明的另一个目的是提供一种功能性的火龙果植物酵素产品，该火龙果酵素富含丰富的有机酸、氨基酸、gaba（γ-氨基丁酸）、蛋白质和多糖等功能性成分，营养成分结构合理，且具有良好的生物生理学活性。
为解决上述技术问题，本发明包括以下步骤：
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）原料的挑选和预处理：挑选无腐烂、无异味的火龙果、火龙果花或与水果的混合物，用自来水除去火龙果、火龙果花果实表面上的灰尘等杂物，经自然晾干，或切片、切块、破碎，或打浆得到浆液，得到预处理后的火龙果原料物料，备用；
（2）原料混合：将步骤（1）中预处理后的物料中加入糖类物质，搅拌均匀备用；或将步骤（1）中预处理后的物料中加入糖类物质、酵素菌原液或酵素菌粉末，搅拌均匀备用；
（3）分阶段发酵：将步骤（2）中所得的原料混合物搅拌混合均匀后进行自然发酵、或外接菌种发酵、或自然发酵与外接菌种发酵的组合发酵，将发酵得到的火龙果原液，经固液分离后，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，得到的火龙果酵素发酵液或浓缩原浆进行螯合陈化，得到火龙果酵素原液；
（4）液体酵素产品制备：将步骤（3）得到的火龙果酵素原液制成火龙果酵素液体口服液，或火龙果酵素胶囊，或经过低温浓缩、喷雾干燥、造粒后得到火龙果酵素原液粉末，或经过配伍后得到复配火龙果酵素产品；
（5）酵素固体剩余物再利用：将步骤（3）得到的酵素固体剩余物经过真空冷冻干燥、粉碎、造粒后得到火龙果酵素固体剩余物粉末。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（1）中水果为瓜类水果、浆果类水果、柑橘类水果、核果类水果、仁果类水果、菠萝、芒果、栗子、椰子、奇异果、芭乐、榴莲、香蕉、甘蔗、百合、莲子、石榴、核桃、拐枣、酸果蔓、接骨木红、黑加仑、诺丽果或莲雾中的一种或多种。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中糖类物质为蔗糖、果糖、蜂蜜、葡萄糖、黑糖、红糖、冰糖、纤维二糖、l-阿拉伯糖、果葡糖浆、麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水苏糖、棉籽糖、低聚壳聚糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇中的一种或多种或配成糖浆液。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中糖类物质中固体糖重量占物料重量的20～80%。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中酵素菌原液为发酵180d~1000d的不同植物酵素发酵液中的一种或几种，酵素菌粉末为发酵180d~1000d的不同植物酵素发酵液中的一种或几种，经真空冷冻干燥后得到的菌粉。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（2）中酵素菌原液或酵素菌粉末占物料重量的0.5%~50%。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中自然发酵条件为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中进行三阶段发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到火龙果酵素原液。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中外接菌种发酵条件为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中接入0.2%～10%的高活性菌种进行三阶段发酵，第一阶段发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到火龙果酵素原液。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的步骤（3）中自然发酵与外接接种发酵的组合发酵为：将混合物料置于经灭菌处理后的发酵容器中进行三阶段发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量0~80%，搅拌转速0~200rpm，发酵温度10～40℃，发酵时间1～6个月；第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0~0.2mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间6～36个月；第三阶段发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆中加入0.2%~10%高活性菌种，进行厌氧发酵，并螯合陈化，发酵容器压力维持在0~0.2mpa，发酵温度10～40℃，发酵时间1～36个月，得到火龙果酵素原液。
所述的一种火龙果酵素的制备方法，其特征在于所述的高活性菌种为鲁氏接合酵母cgmcc12131、双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、丙酸杆菌属、明串球菌属、酵母菌、片球菌属、醋酸菌、米曲霉、黑曲霉、红茶菌、冠突散囊菌、纳豆菌或红曲菌中的一种或多种。
所述的一种火龙果酵素及其制备工艺，其特征在于，所述的鲁氏接合酵母cgmcc12131为从树莓酵素中分离出来的酵母菌，该菌可耐ph2.5，可在900g/l的葡萄糖浓度下生长，所述的菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc12131，其基因序列已上传到genbank数据库，编号为kt956240。
所述的一种火龙果酵素及其制备工艺，其特征在于复配火龙果酵素产品为：自然发酵火龙果酵素原液或浓缩原浆与天然植物活性提取物、微量元素、天然维生素、有机酸、氨基酸、低聚糖、多酚、多糖中的一种或一种以上原辅料进行复配，得到复合火龙果酵素。
所述的一种火龙果酵素及其制备工艺，其特征在于分离发酵液后得到的酵素固体剩余物经过真空冷冻干燥、粉碎、造粒后得到火龙果酵素固体剩余物粉末。
本发明中鲁氏接合酵母cgmcc12131为从树莓酵素中分离出来的酵母菌，该菌可耐ph2.5，可在900g/l的葡萄糖浓度下生长，所述的菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏号为cgmcc12131，其基因序列已上传到genbank数据库，编号为kt956240。
本发明中复配火龙果酵素产品为：自然发酵火龙果酵素原液或浓缩原浆与植物活性萃取物、微量元素、天然维生素和氨基酸、低聚糖中的一种或一种以上原辅料进行复配，得到复合火龙果酵素。
本发明中水果具体可为西瓜、美人瓜、甜瓜、香瓜、黄河蜜、哈密瓜、木瓜、宣木瓜、乳瓜等瓜类水果。草莓、蓝莓、黑莓、树莓、桑葚、覆盆子、葡萄、青提、红提、水晶葡萄、马奶子等浆果类水果，蜜橘、砂糖橘、金橘、越橘、蜜柑、甜橙、脐橙、西柚、柚子、葡萄柚、柠檬、文旦、香泡、莱姆等柑橘类水果。桃（油桃，蟠桃，水蜜桃，黄桃）、李子、樱桃、杏、火龙果、杨梅、西梅、乌梅、大枣、沙枣、海枣、蜜枣、酸枣、金丝小枣、橄榄、荔枝、龙眼（桂圆）、槟榔等核果类水果。苹果（红富士，红星，国光，秦冠，黄元帅）、梨（砂糖梨，黄金梨，莱阳梨，香梨，雪梨，香蕉梨）、蛇果、海棠果、沙果、柿子、山竹、黑布林、枇杷、杨桃、山楂、圣女果、无花果、白果、罗汉果、火龙果、猕猴桃等仁果类水果。菠萝、芒果、栗子、椰子、奇异果、芭乐、榴莲、香蕉、甘蔗、百合、莲子、石榴、核桃、拐枣、酸果蔓、接骨木红、黑加仑、诺丽果、莲雾中的一种或多种。
本发明的有益效果：
（1）本发明采用了自然发酵、或外接菌种发酵、或自然发酵与外接菌种发酵相结合，经过较长时间发酵，使得火龙果原料中的营养物质充分溶出，经过微生物代谢作用形成特殊风味代谢产物。
（2）本发明的制备方法所得到的火龙果酵素有效保留了火龙果和火龙果花中的有机酸、氨基酸、gaba（γ-氨基丁酸）和蛋白质等功能性营养成分，具有良好的抗氧化活性，最终获得的成分或风味得到改善的具有特殊营养和保健功能的食用产品。
（3）本发明通过多阶段发酵，既充分保障了微生物的自身生长，又有利于功能性微生物代谢产物的积累。
附图说明
图1为火龙果酵素发酵过程中abts自由基清除能力变化；
图2为火龙果酵素发酵过程中还原力变化；
图3为火龙果酵素发酵过程中总多酚含量变化；
图4为火龙果酵素发酵过程中总酸含量变化；
图5为火龙果酵素发酵过程中有机酸变化，注：1.草酸（oxalicacid）2.l-酒石酸（l-tartaricacid）3.l-苹果酸（l-malicacid）4.莽草酸（shikimicacid）6.乳酸（lacticacid）7.醋酸（aceticacid）9.柠檬酸（citricacid）11.琥珀酸（succinicacid）；
图6为火龙果酵素发酵过程中氨基酸含量变化，图中（a）1：天冬氨酸（asp）；2：苏氨酸（thr）；3：丝氨酸（ser）；4：谷氨酸（glu）；5：脯氨酸（pro）；6：甘氨酸（gly）；（b）7：丙氨酸（ala）；8：半胱氨酸（cys）；9：缬氨酸（val）；10：蛋氨酸（met）；11：异亮氨酸（ile）；12：亮氨酸（leu）；（c）13：酪氨酸（tyr）；14：苯丙氨酸（phe）；15：γ-氨基丁酸（gaba）；16：赖氨酸（lys）；17：组氨酸（his）；18：精氨酸（arg）（d）发酵过程中氨基酸总量变化（不含gaba）；（e）发酵过程中18种氨基酸含量变化汇总图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步的解释，但并不用于限制本发明。
实施例1
一种火龙果酵素及其制备工艺，包括以下制备步骤：挑选无腐败、无异味、无机械损伤的火龙果5kg，火龙果花0.1kg，葡萄1kg，用自来水除去火龙果和葡萄果实表面上的灰尘等杂物，再用无菌水反复冲洗火龙果、火龙果花和葡萄表面，经打浆得到浆液，得到预处理后的火龙果、火龙果花和葡萄原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入0.5%的植物酵素菌菌粉，浓度为30%的蔗糖5kg，搅拌均匀，接入总质量为10%的酵母菌、乳酸菌、醋酸菌和双歧杆菌的混合菌种，进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量80%，搅拌转速200rpm，发酵温度40℃，发酵时间6个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.2mpa，发酵温度40℃，发酵时间36个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0.2mpa，发酵温度40℃，发酵时间36个月，得到火龙果酵素原液。
上述的火龙果酵素原液制成火龙果酵素液体口服液，或火龙果酵素胶囊，或经过低温浓缩、喷雾干燥、造粒后得到火龙果酵素原液粉末，或经过配伍后得到复配火龙果酵素产品；上述的酵素固体剩余物再利用：将步骤（3）得到的酵素固体剩余物经过真空冷冻干燥、粉碎、造粒后得到火龙果酵素固体剩余物粉末。
实施例1中蔗糖糖浆液可以替换为蜂蜜、果糖、葡萄糖、红糖、冰糖、纤维二糖、l-阿拉伯糖、果葡糖浆、麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、水苏糖、棉籽糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇中的一种或多种或配成糖浆液。葡萄可替换为西瓜、美人瓜、甜瓜、香瓜、黄河蜜、哈密瓜、木瓜、宣木瓜、乳瓜等瓜类水果。草莓、蓝莓、黑莓、树莓、桑葚、覆盆子、葡萄、青提、红提、水晶葡萄、马奶子等浆果类水果，蜜橘、砂糖橘、金橘、越橘、蜜柑、甜橙、脐橙、西柚、柚子、葡萄柚、柠檬、文旦、香泡、莱姆等柑橘类水果。桃（油桃，蟠桃，水蜜桃，黄桃）、李子、樱桃、杏、火龙果、杨梅、西梅、乌梅、大枣、沙枣、海枣、蜜枣、酸枣、金丝小枣、橄榄、荔枝、龙眼（桂圆）、槟榔等核果类水果。苹果（红富士，红星，国光，秦冠，黄元帅）、梨（砂糖梨，黄金梨，莱阳梨，香梨，雪梨，香蕉梨）、蛇果、海棠果、沙果、柿子、山竹、黑布林、枇杷、杨桃、山楂、圣女果、无花果、白果、罗汉果、火龙果、猕猴桃等仁果类水果。菠萝、芒果、栗子、椰子、奇异果、芭乐、榴莲、香蕉、甘蔗、百合、莲子、石榴、核桃、拐枣、酸果蔓、接骨木红、黑加仑、诺丽果、莲雾中的一种或多种。
实施例2
一种火龙果酵素及其制备工艺，包括以下制备步骤：挑选无腐败、无异味、无机械损伤的火龙果5kg，火龙果花0.2kg，用自来水除去火龙果果实和火龙果花表面上的灰尘等杂物，再用无菌水反复冲洗火龙果果实和火龙果花表面，经切片、切块，得到预处理后的火龙果果实和火龙果花原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入0.5%的植物酵素菌菌粉、浓度为80%的蔗糖糖浆液5kg，适当搅拌，进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量40%，搅拌转速100rpm，发酵温度25℃，发酵时间3.5个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1mpa，发酵温度25℃，发酵时间21个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1mpa，发酵温度25℃，发酵时间18个月，得到火龙果酵素原液。
实施例3
一种火龙果酵素及其制备工艺，包括以下制备步骤：挑选无腐败、无异味、无机械损伤的火龙果5kg，火龙果花0.1kg，蓝莓1kg，用自来水除去火龙果、火龙果花和蓝莓果实表面上的灰尘等杂物，再用无菌水反复冲洗火龙果、火龙果花和蓝莓表面，经自然晾干，打浆得到浆液，得到预处理后的火龙果、火龙果花和蓝莓原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入0.5%的植物酵素菌原液，浓度为40%的冰糖糖浆液5kg，适当搅拌。进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量20%，搅拌转速0rpm，发酵温度10℃，发酵时间1个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0mpa，发酵温度10℃，发酵时间6个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0mpa，发酵温度10℃，发酵时间1个月，得到火龙果酵素原液。
实施例4
一种火龙果酵素及其制备工艺，包括以下制备步骤：挑选无腐败、无异味、无机械损伤的火龙果100kg，火龙果花10kg，用自来水除去火龙果和火龙果花表面上的灰尘等杂物，再用无菌水反复冲洗火龙果表面，经自然晾干，打浆得到浆液，得到预处理后的火龙果和火龙果花原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入浓度为30%的异麦芽低聚糖5kg和5%的植物酵素菌原液，搅拌均匀，接入总质量为10%的鲁氏接合酵母cgmcc12131、乳酸菌和双歧杆菌的混合菌种，适当搅拌，进行第一阶段发酵，第一阶段发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量40%，搅拌转速100rpm，发酵温度25℃，发酵时间3.2个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段发酵，第二阶段发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1mpa，发酵温度25℃，发酵时间21个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段自然发酵，第三阶段自然发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆再进行螯合陈化，厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1mpa，发酵温度25℃，发酵时间18.5个月，得到火龙果酵素原液。
实施例5
一种火龙果酵素及其制备工艺，包括以下制备步骤：挑选无腐败、无异味、无机械损伤的火龙果50kg，火龙果花2kg，用自来水除去火龙果和火龙果花表面上的灰尘等杂物，再用无菌水反复冲洗火龙果表面，经自然晾干，切片后得到预处理后的火龙果和火龙果花原料物料，放入已消毒的清洁干燥容器内，加入浓度为50%的葡萄糖5kg，0.5%的酵素菌菌粉，搅拌均匀。进行第一阶段自然发酵，第一阶段自然发酵条件为：采用有氧和机械搅拌控制条件下发酵，溶氧量80%，搅拌转速100rpm，发酵温度40℃，发酵时间6个月；再将发酵容器密封，进行第二阶段自然发酵，第二阶段自然发酵条件为：厌氧环境，发酵容器压力维持在0.1mpa，发酵温度25℃，发酵时间36个月；再将发酵容器密封，进行第三阶段发酵，第三阶段发酵条件为：将发酵物进行固液分离，得到火龙果酵素发酵液或浓缩原浆、酵素固体剩余物，火龙果酵素发酵液或浓缩原浆中加入5.1%的米曲霉、酵母菌、乳酸菌和醋酸菌混合菌种，进行厌氧发酵，并螯合陈化，发酵容器压力维持在0.1mpa，发酵温度25℃，发酵时间30个月，得到火龙果酵素原液。
下面以清除abts自由基、还原力的能力，进一步说明实施例1-5提供的火龙果酵素的抗氧化作用。以总酚、总酸、有机酸、氨基酸和蛋白质的营养来评价火龙果酵素的功能性。
试验例
1材料和方法
1.1材料
本发明实施例1-5提供的火龙果酵素
1.2方法
1.2.1abts清除率的测定
称取38.41mgabts和6.62mg过硫酸钾，用ph7.45mmol/l的pbs定容至10ml，室温下黑暗放置反应12-16h，使用前用上述pbs缓冲液稀释，使其在734nm下吸光度为0.70±0.02。取10μl样品，加pbs缓冲溶液至300μl，加入5ml上述稀释液，混匀，30℃下反应1h。以去离子水为参比溶液，在734nm下测定吸光度。计算abts自由基清除能力。
1.2.3还原力
取70μl样品，加0.2mol/l，ph6.6的磷酸缓冲液至2.5ml，与2.5ml1%铁氰化钾（w/v）混合均匀后，50℃下反应30min，加入10%三氯乙酸（w/v）2.5ml，混合均匀，静置10min，取2.5ml上清液，与2.5ml去离子水和0.5ml0.1%三氯化铁（w/v）充分混合，以去离子水为参比溶液，在700nm下测定。吸光度值越高，说明其还原力越强。
1.2.4发酵过程中总多酚含量变化
参照gb/t31740.2-2015茶多酚的检测方法，取适量样品，加水至1ml，加入5ml10%福林酚试剂，混匀，反应3min后，加入4ml7.5%na2co3溶液，混匀，25℃反应60min。以样品空白为参比溶液，在765nm处测吸光值。以没食子酸为标品，绘制标准曲线。
1.2.5发酵过程中总酸含量变化
根据gb/t12456-2008食品中总酸的测定方法进行检测。
1.2.6有机酸分析
取发酵液，10000r/min高速离心10min后，取上清液，用0.01mol/lkh2po4溶液（用磷酸调ph至2.7）稀释5倍，过0.22μm的微孔滤膜，用于有机酸分析。火龙果原料与水按1:1混合，打浆后，10000r/min高速离心取上清液备用。色谱柱：agilenttcc18柱（250mm*4.6mmi.d.，5微米）；检测波长：210nm，流动相为甲醇：kh2po4（0.01mol/l，ph2.7）=2∶98（v/v），流速1ml/min，柱温：20℃。
1.2.7氨基酸分析
参考国标gb/t5009.124-2003，取1ml发酵液于水解管中，加入6mol/lhcl10ml，重蒸酚3～4滴，冷却5min，在氮吹仪上充入高纯氮气，将已封口的水解管放在干燥箱内110℃水解22h后，取出。冷却后小心打开水解管，将水解液全部转移至25ml容量瓶中，用去离子水多次冲洗水解管，定容，过滤。取1ml滤液，用真空干燥器在45±5℃干燥，残留物加1ml水溶解，再干燥，用1ml流动相溶解，过0.22μm的水相微孔滤膜，上机进样，进样量20μl，脯氨酸在440nm处测定，其余17种氨基酸在570nm处测定。
1.2.8火龙果酵素中蛋白质营养评价
采用aas、cs、rc三种评价体系，选取发酵前期、中期和后期3个时间点发酵液与原料进行分析，计算公式如下：
其中raa为氨基酸比值。当比值系数等于1时，说明食物中氨基酸组成与模式一致；比值系数大于1，表示该氨基酸相对过剩；小于1，表示该氨基酸相对不足。比值系数最小的氨基酸为限制性氨基酸。
2结果与分析
实施例1中火龙果酵素清除abts自由基的实验结果见图1所示。从图中可以看出随着发酵时间的延长，火龙果酵素发酵液对abts自由基清除能力呈缓慢增加的趋势，经487d的发酵，清除能力从发酵初期的37.85%增加至53.90%，增加了42.4%。
实施例2中火龙果酵素还原力的实验结果见图2所示。从图中可以看出火龙果酵素发酵过程中，经487d发酵，还原力从发酵初期的0.291增加到0.356，增加了22.34%。
实施例1中火龙果酵素总多酚的实验结果如图3所示。随着发酵时间的延长，火龙果酵素液总多酚含量呈缓慢增加的趋势，发酵487d，从最初321.65μg/ml增加至433.33μg/ml。
实施例2中火龙果酵素总酸的实验结果如图4所示。火龙果酵素发酵过程中总酸含量呈缓慢增加的趋势，经487d的发酵，发酵液中总酸含量从0.067mol/l增加至0.133mol/l，增加了0.99倍。
实施例3中火龙果酵素有机酸的实验结果如图5所示。经过487d的发酵，火龙果酵素中乳酸和醋酸的含量分别增加了49.17%和81.70%。与原料相比，火龙果酵素在发酵过程中，发酵液中新检测到莽草酸。
实施例4中火龙果酵素氨基酸的实验结果如图6所示。火龙果酵素发酵液中氨基酸含量由高到低依次为：glu＞arg＞pro＞asp＞ala＞val＞gly＞lys＞phe＞gaba＞ser＞thr＞leu＞ile＞his＞cys＞met＞tyr，其中glu、arg和pro的含量较高；发酵过程中处gaba的含量缓慢降低外，其它氨基酸含量均有所增加，发酵液中蛋白质类氨基酸总量（不含gaba）从发酵初期的0.777mg/ml增加到1.661mg/ml，增长了113.77%。
实施例5中火龙果酵素氨基酸的含量实验结果如表1所示。可以看出，火龙果原料及火龙果酵素的e/t值、e/n值，发酵后与原料相比，e/t值、e/n值均高于原料，且在发酵过程中，发酵液的e/t值、e/n值逐渐增加。
表1不同发酵时间火龙果酵素中氨基酸的含量
注：表中*：必需氨基酸，t：氨基酸总量（不含gaba），e：人体必须氨基酸总量，ce：儿童必需氨基酸总量，n：非必须氨基酸，σa为鲜味氨基酸含量（asp+glu），σb为甜味氨基酸含量（ala+gly+pro+ser）σc为芳香族氨基酸含量（phe+tyr）
实施例5中火龙果酵素不同发酵时间aas的实验结果如表2所示。火龙果原料中leu为第一限制氨基酸，ile的aas值接近100%，其它几种氨基酸的aas值均大于100%；火龙果酵素发酵过程中，发酵50d的发酵液中ile、leu分别为第一、第二限制氨基酸，其它几种氨基酸的aas值介于34%～44%之间；发酵295d的发酵液中，ile为第一限制氨基酸，其它几种氨基酸的aas值均高于100%；发酵487d后，发酵液中各种氨基酸的aas值均高于100%。
表2不同发酵时间火龙果酵素的aas
注：#：第一限制氨基酸，*：第二限制氨基酸
实施例4中火龙果酵素不同发酵时间cs实验结果如表3所示。火龙果酵素发酵过程中，发酵50d的发酵液中ile、leu分别为第一、第二限制氨基酸，其它几种氨基酸的cs值介于22.68%~38.23%之间；发酵295d的发酵液中，ile、phe+tyr分别为第一、第二限制氨基酸，thr、lys、val的cs值在100%左右，其它几种氨基酸的aas值介于77.84%~83.91之间；发酵487d后，发酵液中leu的cs值接近100%，其它几种氨基酸的cs值均高于100%。
表3不同发酵时间火龙果酵素的cs
注：#：第一限制氨基酸，*：第二限制氨基酸
实施例3中火龙果酵素不同发酵时间rc实验结果如表4所示。火龙果原料中ile分别为第一限制氨基酸；火龙果酵素发酵过程中，发酵50d的发酵液中，ile、leu分别为第一、第二限制氨基酸；发酵295d的发酵液中，ile为第一限制氨基酸；发酵487d后，发酵液leu为第一限制氨基酸；发酵50d、295d、487d的火龙果酵素发酵液的src值分别为72.27，74.92和76.34，均高于火龙果原料的src值（54.93）。说明随着发酵时间的延长，火龙果酵素的营养价值逐渐升高。
表4不同发酵时间火龙果酵素的rc
注：#：第一限制氨基酸，*：第二限制氨基酸
实施例5中的火龙果酵素进行降血糖功效评价，结果表明对α-淀粉酶的抑制率为68.8%，可见火龙果酵素具有明显的血糖抑制能力。