一种“核－壳”结构的花青素纳米复合物及其制备方法与流程

本发明公开了一种具有“核-壳”结构的花青素纳米复合物的制备方法，属于食品纳米技术领域。

背景技术：

花青素是一类广泛存在于植物花瓣、果实和块茎中的水溶性天然色素，常以花色苷的形式存在。花青素是迄今为止发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂，并且具有改善视力和记忆力、降低罹患心血管疾病风险等功能。然而，花青素的稳定性较差，对温度、ph、光、金属离子、维生素c等因素敏感，在贮存、运输以及加工过程中易收到外界环境的影响而降解，从而极大的限制了其在食品体系中的应用。通过纳米技术构建蛋白质-多糖复合物用于包封花青素，是保护花青素不受外界不利因素的干扰、提高其化学稳定性的极佳途径。另外，纳米复合物的尺寸小，对组织的附着能力强，可以有效延长花青素在胃肠到中的滞留时间，提高其输送效率。

通过调控食源生物大分子组装构建纳米复合物用于活性分子的递送是目前食品纳米技术领域的研究热点之一。首先，食源生物大分子如蛋白质、多糖等具有来源广泛、生物相容性高、环境友好等特点；另外，纳米复合物的组装条件相对温和，避免了高能量输入(如高压均质、高速匀浆)过程导致的成本增加和芯材的降解，具有广阔的应用前景。在“核-壳”结构的纳米复合物中，蛋白质通过氢键、范德华力、以及疏水相互作用等与花青素分子结合，起到花青素载体的作用；而多糖链通过静电相互作用缠绕在蛋白质内核表面，形成多糖吸附层，从而有效阻止外界环境中不利因素的渗透，提高花青素稳定性。

技术实现要素：

本发明针对花青素在贮藏、加工、运输过程中容易氧化降解的缺陷，提供了一种具备“核-壳”结构的花青素纳米复合物及其制备方法。该纳米复合物可以有效减少光、热等敏感因素对花青素稳定性的影响，有利于拓展其在食品工业中的应用。

一种“核-壳”结构的花青素纳米复合物，所述的纳米复合物中，蛋白质在热处理条件下变性聚集，组装成“内核”用于荷载花青素；而多糖通过静电沉积作用缠绕在蛋白质内核表面，形成“外壳”，起到对纳米体系的稳定与保护作用。

所述纳米复合物对花青素的包封率为40-70％，水动力学直径介于200-300nm，ζ-电势介于-30-50mv，分散性系数pdi小于0.20。

本发明涉及的花青素纳米复合物有效减少外界敏感因素对花青素的影响，提高其生化稳定性；该纳米复合物以天然生物大分子为壁材，生物降解性好，对人体无毒副作用；该纳米复合物的尺寸小，对消化道组织的吸附能力强，可以显著延长花青素在人体内的滞留时间，提高其生物利用度。

上述技术方案，进一步地，所述蛋白质为卵白蛋白或牛血清白蛋白中的任意一种；所述多糖为海藻酸钠或果胶中的任意一种。

一种“核-壳”结构的花青素纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将粉末状蛋白质或者多糖样品加入双蒸水中，室温下充分搅拌至溶解，并在4℃冰箱中放置过夜以确保水化完全，过滤后备用；

(2)将得到的蛋白质溶液进行热处理并冷却至室温，随后将粉末装花青素加入热处理后的蛋白质溶液中，待充分溶解后，将蛋白质-花青素复合溶液与相同体积的多糖溶液混合、酸化，室温条件下搅拌至蛋白质与多糖结合完全；

(3)将混合溶液转移至超滤离心管中，离心浓缩去除未包封花青素，浓缩液干燥后得到花青素纳米复合物。

进一步地，步骤(1)中，所述蛋白质与多糖溶液的质量浓度分别是2.0％和1.0％(w/w)。

进一步地，步骤(1)中，所述蛋白质溶液的过滤装置为水系针头式过滤器，孔径为450nm。

进一步地，步骤(1)中，所述多糖溶液的过滤装置为中速滤纸。

进一步地，步骤(2)中，所述加热条件为70-90℃水浴中加热10-15min，该条件可以有效促进蛋白质的变性、聚集和凝胶化，形成纳米复合物的“内核”。

进一步地，步骤(2)中，所述花青素质量为蛋白质的质量的1.0-5.0％。

进一步地，步骤(2)中，所述的酸化是采用1m醋酸将混合溶液调制ph4.2-4.5，

进一步地，步骤(2)中，所述的搅拌条件是在转速400-600rpm下磁力搅拌2-4h，从而确保多糖通过静电相互作用沉积在蛋白质内核表面形成“外壳”结构。

进一步的，步骤(3)中，所述超滤离心管截留分子量为5-10kda；所述的离心条件是4000-6000g离心力条件下离心10-30min。

进一步的，步骤(3)中，所述干燥条件是在-80℃下预冷24h后在冷冻干燥机中冷冻干燥。

有益效果

与现有技术相比，本发明的制备工艺简单可行、设备要求低，且反应条件温和可控；采用的试剂、原料安全性高，对人体无毒副作用；制备得到的纳米复合物尺寸小、电势高、粒度分布均匀，可以有效提高花青素的输送以及吸收效率；纳米复合物具备“核-壳“结构，并将芯材花青素包封于蛋白质内核中，可以有效提高其生化稳定性；在肠道环境下(中性)，纳米复合物因多糖与蛋白质之间的静电斥力而解离，从而可以实现花青素的肠道靶向释放。

附图说明

图1“核-壳”结构花青素纳米复合物的透射电镜图像

图260℃条件下纳米复合物中花青素的降解情况

图30.1％维生素c条件下纳米复合物中花青素的降解情况

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明作进一步说明。

本发明的具体实施例中，收集步骤(3)中超滤离心得到的滤液，采用紫外-分光光度法测定未包埋花青素的含量。

花青素浓度的计算公式具体如下：

花青素浓度

aph1.0是ph1.0条件下花青素在520nm处的吸光值，aph4.5是ph4.5条件下花青素在700nm处的吸光值；

mw：花青素的相对分子质量[484.84g/mol为花青素中含量最高的矢车菊素-3-o-葡萄糖苷单体的相对分子质量]；

df：稀释因子；

ε：摩尔消光系数(26900l·cm^-1·mol^-1)；

ι：光程(1.0cm)。

通过如下公式计算花青素包埋率：

花青素包封率(％)＝(c×v)/m式(2)；

c：花青素浓度；

v：超滤液总体积；

m：纳米复合物制备过程中花青素添加的总质量。

实施例1

1、准确称取1.0g卵白蛋白分散于50ml双蒸水中，室温下充分搅拌至溶解，并在4℃冰箱中放置过夜确保水化完全，用450nm孔径的针头过滤器过滤后备用；

2、准确称取0.5g海藻酸钠置于50ml双蒸水中，室温下充分搅拌至溶解，并在4℃冰箱中放置过夜确保水化完全，中速滤纸过滤后备用；

3、将卵白蛋白溶液置于80℃水浴中加热15min，并在冰浴中冷却至室温；

4、准确称取20mg黑米花青素粉末与上述热处理后的卵白蛋白溶液混合(花青素质量为蛋白质质量的2.0％)，并快速搅拌至溶解完全；

5、将上述溶液与海藻酸钠溶液混合均匀，并使用1m醋酸将混合溶液酸化至ph4.2，400rpm转速条件下磁力搅拌4h，确保海藻酸钠通过静电相互作用充分吸附在卵白蛋白表面；

6、测得花青素纳米复合物粒径为232.34±11.34nm，ζ-电势为-42.34±3.42mv，pdi为0.132±0.011；

7、将混合溶液转移至截留分子量为10kda的超滤离心管中，4000g条件下离心30min，并测定滤液中的花青素浓度，计算包埋率为63.22％；

8、收集浓缩液，在-80℃条件下预冷24h后在冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到花青素纳米复合物冻干粉。

实施例2

1、准确称取0.50g牛血清白蛋白分散于25ml双蒸水中，室温下充分搅拌至溶解，并在4℃冰箱中放置过夜确保水化完全，用450nm孔径的针头过滤器过滤后备用；

2、准确称取0.25g海藻酸钠溶于25ml双蒸水中，室温下充分搅拌至溶解，并在4℃冰箱中放置过夜确保水化完全，中速滤纸过滤后备用；

3、将卵白蛋白溶液置于90℃水浴条件下加热10min，并在冰浴中冷却至室温；

4、准确称取25mg黑米花青素粉末与热处理后的卵白蛋白溶液混合(花青素质量为蛋白质质量的5.0％)，并快速搅拌至溶解完全；

5、将上述溶液与果胶溶液均匀混合，使用1m醋酸将混合溶液酸化至ph4.5，600rpm转速条件下磁力搅拌3h，确保果胶通过静电相互作用充分吸附在牛血清白蛋白表面；

6、测得花青素纳米复合物粒径为265.34±14.21nm，ζ-电势为-35.62±5.19mv，pdi为0.122±0.081；

7、将混合溶液转移至截留分子量为5kda的超滤离心管中，5000g条件下离心20min，并测定滤液中的花青素浓度，计算包埋率为41.89％；

8、收集浓缩液，在-80℃条件下预冷24h后在冷冻干燥机中冷冻干燥，得到花青素纳米复合物冻干粉。

性能测试

采用透射电镜观察纳米复合物的表观形貌。取一滴实施例1中样品置于覆有支持膜的铜网上(200目)，自然晾干后，用醋酸双氧铀或者磷钨酸染液对载有样品的铜网复染2min。用滤纸吸走多余的液体后，将样品置于透射电镜下观察、拍照。如图1所示，花青素纳米复合物并形成了以蛋白质为“内核”、海藻酸钠为“外壳”的结构。

将花青素粉末和实施例1中的纳米花青素复合物分别溶解于磷酸盐缓冲液(10mm，ph5.0)，使最终花青素浓度达到0.2mg/ml，随后将溶液置于60℃水浴中孵育，每隔12h取样检测花青素的保留率；向上述溶液中分别添加维生素c溶液使最终维生素c浓度达到1.0mg/ml，将溶液在室温条件下避光放置，每隔12h取样检测花青素保留率。如图1、2所示，纳米包埋后，花青素在高温环境下和高维生素c浓度条件下得到了大幅度提高，有利于促进花青素的综合开发利用。