一种平板脉冲超声强化豆粕发酵的方法与流程

本发明属于食品发酵研究领域，具体涉及一种平板脉冲超声强化豆粕发酵的方法。

背景技术

我国大豆种植广泛，豆粕年产量可达5000万吨以上。并且豆粕营养价值及经济价值高，但是我国豆粕深加工程度很低。目前豆粕在我国主要用于饲料的配置与酱油的制作，豆粕利用率总体较低，豆粕资源迫切需要扩展并运用到其他领域来最大化地提高其潜在附加值。因此，豆粕如何高效地用作蛋白及多肽生产原料的研究逐渐成为学者们的研究热点。

水解蛋白制备多肽是目前豆粕多肽工业化生产最主要的方式。其中包括直接酶解法和菌种发酵法。直接酶解法水解时间短，效率高，但要先对豆粕原料进行蛋白提取，使用酶的范围窄，成本高，且得到的多肽有苦味，脱苦步骤繁琐。而菌种发酵法可直接利用原料进行自然发酵，代谢过程中产酶、酶解及脱苦步骤同步进行，大大简化生产工艺，并且还能充分降解豆粕中的抗营养因子。

传统微生物发酵法存在发酵效率较低的问题。于是本发明尝试在豆粕发酵过程中引入超声波技术，旨在刺激发酵微生物的生长，提高发酵效率，增加发酵产物得率。有相关研究表明，合适的超声波刺激能够改变细胞膜的通透性，增强物质运输，加速细胞代谢生长，刺激酶分泌，同时提高酶解的反应效率。超声波通过强化发酵液的微搅拌，改善其传质效果。现有技术中超声技术在发酵饲料上的应用较多，但是一些研究中并没有明确先定功率(有机肥发酵剂及其制备方法和使用方法，廖庄旺，cn201710523409.5)和频率(一种复合菌种发酵酒糟制备风味蛋白饲料的方法，关统伟，cn201710584855.7)。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题提供一种平板脉冲超声强化豆粕发酵的方法，并以生物量、多肽和可溶性蛋白指标来优化整个超声发酵过程。

本发明的技术方案是：一种平板脉冲超声强化豆粕发酵的方法，包括以下步骤：

步骤s1、菌种活化与豆粕发酵；

步骤s2、取所述步骤s1中接种后的发酵液进行平板脉冲超声处理，超声处理的条件为：发酵液至于超声波水浴中，超声波水浴温度为28～36℃，设定超声脉冲间歇比，超声施加阶段为豆粕发酵的第2d、3d或4d，超声处理时间为1～3h，功率密度为0.04～0.14w/ml，频率28～40khz。

优选地，所述超声脉冲间歇比为超声10s/空歇5s。

所述菌种为枯草芽孢杆菌或菌种为热带假丝酵母等菌种。

当所述菌种为枯草芽孢杆菌时，优选地，所述超声波水浴温度为36℃，超声施加阶段为豆粕发酵的第3d，所述超声处理时间为1h，所述功率密度为0.08w/ml，所述频率为33khz。

当所述菌种为热带假丝酵母时，优选地，所述超声波水浴温度为28℃，超声施加阶段为豆粕发酵的第2d，所述超声处理时间为2h，所述功率密度为0.14w/ml，所述频率为33khz。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用平板脉冲超声波设备进行豆粕发酵强化，以发酵液生物量、可溶性蛋白和多肽含量为发酵效果评价指标，筛选出了枯草芽孢杆菌最佳超声强化发酵工艺：所述超声波水浴温度为36℃、所述超声脉冲间歇比为超声10s/空歇5s、所述超声施加阶段为豆粕发酵的第3d、所述超声处理时间为1h、所述功率密度为0.08w/ml、所述频率为33khz，在最优参数条件下，经超声波强化豆粕发酵后，枯草芽孢杆菌生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量分别提高141.97％、15.06％和24.42％；筛选出了热带假丝酵母在所述超声波水浴温度为28℃，超声施加阶段为豆粕发酵的第2d，所述超声处理时间为2h，所述功率密度为0.14w/ml，所述频率为33khz条件下，发酵结束后的热带假丝酵母生物量提高207.22％，超声强化效果显著。

附图说明

图1平板脉冲超声波设备；

图2超声施加时间对豆粕发酵效果的影响；

图3超声时间对豆粕发酵效果的影响；

图4超声功率密度对豆粕发酵效果的影响；

图5超声频率对豆粕发酵效果的影响；

图6超声频率对豆粕发酵中热带假丝酵母生物量的影响；

表1枯草芽孢杆菌最优超声组与未超声组发酵效果对比；

表2热带假丝酵母最佳超声频率下发酵液生物量与未超声组对比。

图中，1、电脑；2、超声发生器；3、超声振板；4、水槽；5、三角瓶。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明所使用的平板脉冲超声波设备如图1所示。电脑1可以数字化控制超声发生器2的工作功率、频率和时间，超声振板3可以产生超声波并作用于水槽4中三角瓶5内的发酵液。三角瓶5放置于超声振板3中心位置，三角瓶5外的水为超声波的传递提供介质环境，保持瓶外介质液面位置至少高于瓶内液面。

本发明采用枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和热带假丝酵母(candidatropicalis)均购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)，编号分别为atcc10160和cicc1254。

步骤s1、菌种活化与豆粕发酵：

枯草芽孢杆菌：挑取一环保存于无菌牛肉膏蛋白胨(lb)固体斜面培养基中上的枯草芽孢杆菌bacillussubtilis至lb液体培养基中，在36℃下活化至对数生长期(8-10h)。然后，按5％接种量(v/v)接种于已含有100ml无菌种子液培养基(玉米黄粉10g/l、酵母膏10g/l、kh2po410g/l和ph自然)的250ml三角瓶中，摇床转速设为160～180rpm，于36℃下培养时间24h。之后，再按10％接种量(v/v)加入含有100ml无菌液态发酵培养基(豆粕200g/l、玉米黄粉20g/l、kh2po410g/l和ph7.0)的250ml三角瓶中，摇床转速设为180～200r/min，发酵温度36～38℃，发酵3～4d。

热带假丝酵母candidatropicalis：使用麦芽汁培养基活化。

步骤s2、取所述步骤s1中接种后的发酵液进行平板脉冲超声处理，超声处理的条件为：

发酵液至于超声波水浴中，水浴温度控制为28～36℃，设定超声脉冲间歇比为超声10s/空歇5s，超声施加阶段为豆粕发酵的第2d、3d或4d，超声处理时间为1～3h，功率密度为0.04～0.14w/ml，频率28～40khz。超声结束后立即将三角瓶取出并放回恒温摇床继续培养至发酵结束。

本发明以发酵液生物量、可溶性蛋白质和多肽含量为评价指标，其具体步骤如下：

对照例1

枯草芽孢杆菌豆粕发酵全过程无超声强化处理。4d发酵结束后，取1ml发酵液进行梯度稀释，取50μl一定稀释度的发酵液进行固体培养基涂布，将涂布好的培养基平板转移至恒温培养箱中于36℃培养48h，计算原发酵液中枯草芽孢杆菌生物量；将三角瓶中剩余发酵液转移2个50ml离心管中5000rpm离心10min，取上清液后用福林酚法测定可溶性蛋白含量以及用双缩脲法测定多肽含量。结果显示，发酵液生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量分别为19.30×10⁸cfu/ml、72.46mg/ml和18.26mg/ml。

对照例2

热带假丝酵母豆粕发酵全过程无超声强化处理。4d发酵结束后，取1ml发酵液进行梯度稀释，取50μl一定稀释度的发酵液进行固体培养基涂布，将涂布好的培养基平板转移至恒温培养箱中于28℃培养48h，计算发酵液中热带假丝酵母生物量。结果显示，无超声处理的发酵液生物量为227.50×10⁵cfu/ml。

实施例1

对接种后的枯草芽孢杆菌发酵液于第2d、3d、4d中的同一时间点取出施加超声1h，设置超声功率密度0.12w/ml，频率28khz。发酵结束后对枯草芽孢杆菌生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量进行测定，测定结果如图2所示。由图看出，于第3天施加超声后，发酵效果较显著，发酵液生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量分别为211.00×10⁸cfu/ml、83.13mg/ml和23.16mg/ml。

实施例2

接种后第3天对枯草芽孢杆菌发酵液进行超声处理，功率密度0.12w/ml，频率28khz，超声时间分别为1h、2h和3h。发酵结束后对枯草芽孢杆菌生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量进行测定，测定结果如图3所示。由图看出，超声时间1h发酵效果较好，发酵液生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量分别为134.67×10⁸cfu/ml、85.98mg/ml和28.77mg/ml。

实施例3

接种后第3天对枯草芽孢杆菌发酵液进行超声处理，超声时间1h，频率28khz，功率密度0.04w/ml、0.08w/ml和0.12w/ml。第四天发酵结束后对枯草芽孢杆菌生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量进行测定，测定结果如图4所示。由图看出功率密度为0.08w/ml时发酵效果较好，发酵液生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量分别为23.00×10⁸cfu/ml、76.20mg/ml和20.48mg/ml。

实施例4

接种后第3天对枯草芽孢杆菌发酵液进行超声处理，超声时间1h，功率密度0.08w/ml，频率28khz、33khz和40khz。发酵结束后对枯草芽孢杆菌生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量进行测定，测定结果如图5所示。由图5看出超声频率为33khz时发酵效果较好，发酵液生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量分别为40.33×10⁸cfu/ml、81.83mg/ml和21.02mg/ml。

实施例5

超声最佳实施条件为接种后第3天对枯草芽孢杆菌发酵液进行超声处理，超声时间1h，功率密度0.08w/ml，频率33khz。在该条件下超声发酵与未超声相比的发酵效果如表1所示。超声强化组枯草芽孢杆菌生物量、可溶性蛋白含量以及多肽含量分别提高141.97％、15.06％和24.42％，超声强化枯草芽孢杆菌豆粕发酵效果较好。

表1枯草芽孢杆菌最优超声组与未超声组发酵效果对比

实施例6

接种后第2天对热带假丝酵母发酵液进行超声处理，功率密度0.14w/ml，频率28khz，超声处理1h、2h和3h。4d发酵结束后对热带假丝酵母生物量进行测定，发酵液生物量分别为288.73×10⁵cfu/ml、361.95×10⁵cfu/ml和281.64×10⁵cfu/ml如图6所示。结果显示超声2h效果较好。

实施例7

接种后第2天对热带假丝酵母发酵液进行超声处理，功率密度0.14w/ml，频率33khz，超声处理1h、2h和3h。4d发酵结束后对热带假丝酵母生物量进行测定，发酵液生物量分别为432.94×10⁵cfu/ml、698.92×10⁵cfu/ml和468.03×10⁵cfu/ml如图6所示。结果显示超声2h效果较好。

实施例8

接种后第2天对热带假丝酵母发酵液进行超声处理，功率密度0.14w/ml，频率40khz，超声处理1h、2h和3h。4d发酵结束后对热带假丝酵母生物量进行测定，发酵液生物量分别为381.92×10⁵cfu/ml、427.06×10⁵cfu/ml和319.43×10⁵cfu/ml如图6所示。结果显示超声2h效果较好。

表2热带假丝酵母最佳超声频率下发酵液生物量与未超声组对比。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。