一种调节母猪肠道健康的复合生物制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及饲料技术领域，具体地，本发明涉及一种调节母猪肠道健康的复合生物制剂及其制备方法和应用方法，该复合生物制剂可有效提高母猪采食量，提高饲料利用率，抑制有害微生物的生长，促进益生菌在肠道中的增殖，维持母猪肠道健康。

背景技术：

肠道是动物的重要消化和免疫器官，具有消化食物，吸收所需营养成分及屏障免疫等功能。畜牧养殖以追求动物高生产性能为目标，母猪的健康状况和生产性能是猪场经济效益的主要影响因素，维护母猪肠道健康是获得高生产效益的基础。采取合理的营养调控措施来提高母猪妊娠后期和哺乳期的采食量，改善围产期便秘情况，从而提高母猪的生产性能，是现代养猪业亟需解决的问题。

肠道微生物菌群的建立和维持对于动物肠道健康具有重要作用，可以提高母猪繁殖性能，提高断奶仔猪重量，改善饲料转化率，促进肠道蠕动性能，减少母猪便秘，控制后肠道的有害菌群的过度发酵和增殖，有利于促进肠道有益菌群健康发酵，减少后肠道的不良发酵，降低粪便以及养殖舍内氨气、硫化氢的浓度和臭味，改善舍内环境，减少污染，促进养殖业的健康和可持续发展。

近年来，微生物制剂和酶制剂作为安全的新型饲料添加剂成为国内外学者的研究热点。微生物菌种中的芽孢杆菌可分泌蛋白酶、淀粉酶等消化酶，促进动物肠道营养吸收，提高饲料利用率。同时，由于能够形成芽孢，具有耐高温、耐酸碱等抗逆性，便于生产和贮存，是目前使用最普遍的微生物饲料添加剂菌种之一。乳酸菌可在动物肠道内定植并迅速增殖，产生有机酸，能够有效抑制病原微生物的生长，维护肠道菌群平衡。酶制剂中的甘露聚糖酶可以分解豆粕等饲料原料中的甘露聚糖，消除其抗营养作用，降低肠道食糜的黏度，促进肠道消化吸收。此外，酶解产生的甘露寡糖经过肠道到达盲端，可以为乳酸菌、双歧杆菌等有益微生物的繁殖提供食物，增加有益微生物数量，抑制病原菌的生长，改善动物肠道健康。本发明将微生物制剂中的芽孢杆菌、乳酸菌与酶制剂中的甘露聚糖酶进行科学配伍，充分发挥益生菌的肠道调控功能，维护母猪肠道健康。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种由地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌和甘露聚糖酶复配制成的复合生物制剂，将特定功能的有益微生物菌种与甘露聚糖酶进行科学配伍使用，维护母猪肠道健康，解决畜牧生产中母猪采食量低、便秘等问题。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种调节母猪肠道健康的复合生物制剂，主要由地衣芽孢杆菌(保藏编号为cgmccno.14441)、屎肠球菌(保藏编号为cgmccno.9666)、植物乳杆菌(保藏编号为cgmccno.14459)和甘露聚糖酶等有效成分组成。

优选的，所述复合生物制剂中地衣芽孢杆菌的活菌数为1.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/g。

优选的，所述复合生物制剂中屎肠球菌的活菌数为1.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/g。

优选的，所述复合生物制剂中植物乳杆菌的活菌数为1.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/g。

优选的，所述复合生物制剂中甘露聚糖酶的酶活为1000-10000u/g。

一种调节母猪肠道健康的复合生物制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：按照不同的添加量将地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌和甘露聚糖酶等有效成分与沸石粉等载体混合均匀即可。

一种调节母猪肠道健康的复合生物制剂在饲料中的应用，所述应用为将调节母猪肠道健康的复合生物制剂按照饲料重量的0.05-0.2％添加量加入到日粮饲料中，混合均匀后饲喂即可。

本发明中的地衣芽孢杆菌高产中性蛋白酶和淀粉酶，可有效提高母猪繁殖期采食量，提高饲料利用率。屎肠球菌和植物乳杆菌可迅速增殖，产生有机酸，有效抑制有害微生物的生长。甘露聚糖酶可分解饲料中的甘露聚糖产生甘露寡糖，甘露寡糖可促进益生菌在动物肠道中的增殖，进而调节动物肠道健康，降低母猪便秘率。

本发明将特定功能的有益微生物和甘露聚糖酶制剂进行了科学组合、协同应用，能够充分发挥有益微生物对动物肠道的调节作用，可有效提高母猪采食量，提高饲料利用率，抑制有害微生物的生长，促进益生菌在肠道中的增殖，降低母猪便秘率，维持母猪肠道健康。

附图说明

图1为产蛋白酶菌株筛选的培养菌落；

图2为淀粉酶产生菌株筛选的培养菌落。

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明的技术方案：

实施例1产蛋白酶、淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选及鉴定

1试验方法

1.1产蛋白酶菌株的筛选

初筛：采用酪蛋白平板水解透明圈法，将分离纯化后的菌株点种于酪蛋白培养基平板，于恒温箱内培养48h，挑取产生水解透明圈的菌落(如图1所示)，测定l值(l值＝透明圈直径/菌落直径)后，4℃保存备用。

复筛：经初筛得到产生透明圈的菌株，吸取1ml菌悬液(10⁸cfu/ml)接种于发酵培养基中，混合均匀，自然ph值，于37℃的培养箱中培养24h后测定蛋白酶活力。

酶活力测定：取待测酶液。40℃恒温水浴2min，加入酪素2ml(摇匀)，40℃恒温水浴10min，然后加入三氯乙酸4ml(摇匀)，离心取上清液，测275nm吸光值。同时作空白对照。

1.2α-淀粉酶产生菌株的筛选

初筛：把菌株接种到已灭菌的淀粉琼脂培养基上，37℃静置培养24h后，转接入装有25ml该培养基的液体三角瓶中，以37℃、220r/min摇床培养24h。取1ml培养液用无菌水梯度稀释，各取0.15ml菌悬液分别涂布于平板分离培养基，37℃培养24h，在平板上喷洒碘液，将有透明圈的单菌落挑出(如图2所示)，进一步划线分离后，挑至斜面保藏培养基上，37℃培养24h，于4℃下保存。

复筛：取1环初筛菌种接入种子培养基，于37℃、220r/min摇床培养24h。取1ml接入固态产酶培养基，于30℃恒温培养72h后测定α-淀粉酶酶活，并于4℃下保存活性最佳的菌种。

酶活的测定方法：取底物5ml在40℃水浴预热10min，加入0.5ml酶液，准确保温5min，取0.5ml混合液加入5ml0.1mol/l的h2so4终止反应，从中取0.5ml加入5ml稀碘液显色，在660nm处测定吸光值。以0.5ml缓冲液代替0.5ml的酶液为对照，以蒸馏水作为比色的空白。

2实验结果

2.1初筛

从30株细菌中初筛得到产生酪蛋白水解圈菌株共15株，占全部测试菌株的50％。初步测定其l值(见表1)，数据显示，其中菌株y27的l值最大，为3.01。

表1产蛋白酶菌株初筛

2.2复筛及酶活测定

将挑选出l值较大的5株菌，发酵培养后测定其蛋白酶活性(见表2)，5株菌中，l值和酶活都较大的菌株是y27，其l值为3.01，蛋白酶活是324.72u/ml。

表2菌株的复筛

2.3α-淀粉酶产生菌株的筛选

经产淀粉酶实验发现，共有9株菌产α-淀粉酶，占测试菌株的30％。进一步复筛发现，y8、y20和y27产α-淀粉酶活力较好，其中y27菌株产酶较高，酶活达到225.76u/g，其中酶活较低的是y30菌株，酶活为67.9u/g，结果见表3。综合比较供试菌株的产酶能力，则蛋白酶和α-淀粉酶活性最高的是菌株y27。

表3α-淀粉酶活性测定结果

2.4菌株的鉴定

通过gyrb基因序列鉴定，y27菌株的基因序列(seqidno.1)与地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)的相似性为99％，确定为地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)。菌株于2017年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为cgmccno.14441。

实施例2甘露寡糖对屎肠球菌和植物乳杆菌生长的影响

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种

屎肠球菌enterococcusfaecium(菌株于2014年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.9666)、植物乳杆菌lactobacillusplantarum(菌株于2017年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.14459)。

1.1.2培养基

(1)种子活化培养基(mrs培养基)

蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，蒸馏水(ddh2o)1000ml，121℃，灭菌30min。

(2)无碳源培养基

蛋白胨10g，酵母提取物5g，吐温-801ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，蒸馏水(ddh2o)1000ml，121℃，灭菌30min。

(3)发酵培养基

在无碳源培养基的基础上加入不同量的甘露寡糖，以2％浓度葡萄糖处理为对照，为避免葡萄糖和甘露寡糖高温损失，采用0.22μm过滤器过滤除菌。

1.1.3无菌水等其它材料

无菌水(9ml)、1ml移液管、培养皿等实验器材并于121℃高压灭菌30min。

1.2试验方法

1.2.1种子液活化

用接种环分别挑取屎肠球菌和植物乳杆菌菌苔接种到种子活化培养基中，37℃，静置培养18h。

1.2.2接种

分别吸取1ml屎肠球菌和植物乳杆菌种子液(1％体积比，接种到不同浓度的葡萄糖和甘露寡糖为碳源的培养基中。

1.2.3培养

37℃，静置培养18h。

1.2.4活菌计数

(1)准确吸取待测发酵菌液1ml，移入装有9ml无菌水的试管中，震荡15s，让菌液混合均匀，即成10^-1稀释液；以此类推，连续稀释，制成10^-6、10^-7稀释菌液。

(2)混合平板

将无菌培养皿编号，每一稀释度设置三组平行，用无菌移液管严格按无菌操作要求准确吸取1ml某一稀释度的菌液，分别放入三组平行的培养皿中。然后在培养皿中倒入已融化并冷却至50℃左右的营养琼脂培养基。轻轻转动平板100次，使菌液与培养基混合均匀。

(3)培养

待混合平板培养基冷凝后倒置，在37℃培养箱中培养48h。

(4)计数

计算公式：每ml发酵液的菌数＝同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数。

2试验结果与分析

2.1甘露寡糖对屎肠球菌生长的影响

从表4可以看出，发酵液中屎肠球菌活菌数随着甘露寡糖添加量的提高而增加，当添加量大于1％后，增加幅度变小。添加不同浓度甘露寡糖为碳源的处理中，发酵活化液中屎肠球菌的活菌数均高于以2％葡萄糖为碳源的处理，说明甘露寡糖对屎肠球菌的生长具有促进作用。

表4甘露寡糖对屎肠球菌生长的影响

2.2甘露寡糖对植物乳杆菌生长的影响

从表5可以看出，发酵液中植物乳杆菌活菌数随着甘露寡糖添加量的提高而增加，当添加量大于1％后，增加幅度变小。添加不同浓度甘露寡糖为碳源的处理中，发酵活化液中植物乳杆菌的活菌数均高于以2％葡萄糖为碳源的处理，说明甘露寡糖对植物乳杆菌的生长具有促进作用。

表5甘露寡糖对植物乳杆菌生长的影响

3结论

不同种类碳源对比，以甘露寡糖为碳源的处理屎肠球菌和植物乳杆菌发酵液活菌数均高于以2％葡萄糖为碳源的处理。结果表明，甘露寡糖能够促进屎肠球菌和植物乳杆菌的生长。

实施例3调节母猪肠道健康的复合生物制剂的制备

复合生物制剂的生产方法包括如下步骤：

1.地衣芽孢杆菌的生产

(1)将地衣芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时。

(2)将斜面培养的地衣芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，装液量为50-150ml/500ml，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时。

(3)将地衣芽孢杆菌种子液以0.1-0.5％重量比接种于种子罐中，装液量为50-150l/500l，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时。

(4)将种子罐培养液以0.1-0.5％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05mpa，搅拌转速为120-180转/分，通风比为0.5-1：0.1-0.5(体积比)，发酵时间为12-24小时。

(5)采用喷雾干燥设备干燥，进风温度为140～160℃，出料口温度为60～70℃，最终物料水分在6％～10％(重量比)，获得地衣芽孢杆菌喷干粉。

上述步骤(1)中斜面培养基组成：牛肉浸膏1.0-5.0g，大豆蛋白胨5.0-15.0g，酵母膏1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-10.0g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，ph为7.0；

步骤(2)中种子培养基组成：蛋白胨5-15g，牛肉膏0.1-2g，氯化钠0.1-3g，蒸馏水1000ml，ph为7.4；

步骤(3)中种子罐培养基组成：玉米粉0.1-0.5％，葡萄糖0.1-1.0％，豆饼粉0.1-3％，鱼粉0.01-0.1％，碳酸钙0.1-2％，硫酸铵0.01-0.05％，磷酸氢二钾0.001-0.01％，硫酸镁0.001-0.01％和硫酸锰0.001-0.01％；

步骤(4)中发酵培养基组成：酵母粉0.1-3％、0.1-3％的豆粕水解液0.1-3％、葡萄糖0.1-1％、玉米淀粉0.1-1.5％、碳酸钙0.1-0.5％，ph为7.0-7.5。

2.屎肠球菌和植物乳杆菌的生产

(1)将屎肠球菌或植物乳杆菌接种于mrs固体斜面培养基，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时。

(2)将斜面培养的屎肠球菌接种于种子培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时。

(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐，在30-40℃有氧或兼性条件培养12-24小时。

(4)将步骤(3)获得的屎肠球菌或植物乳杆菌发酵菌液进行离心收集菌体，离心回收得率大于85％。

(5)将步骤(4)离心完的菌泥称重后，将菌泥与保护剂按照体积质量比5:1混合均匀，于-70℃预冻2-3h，预先开启冷冻干燥机，待冷冻温度降至-40℃，迅速将预冻好的菌体放入冷冻8h，冻干后屎肠球菌存活率在90-95％之间，获得屎肠球菌或植物乳杆菌的冻干粉。

其中所述保护剂配方为：脱脂奶粉14％、蔗糖10％、低聚果糖16％和谷氨酸钠10％，无菌水1l。

以上所述步骤(1)中mrs斜面培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml，121℃，灭菌30min。步骤(2)中种子培养基为上述mrs斜面培养基中去除琼脂粉。步骤(3)中改良mrs培养基组成：大豆蛋白胨5-30g，葡萄糖1-10g，酵母粉1-10g，乙酸钠1-10g，拧檬酸二胺0.1-8g，tween800.1-5g，磷酸氢二钾0.1-5g，硫酸镁0.05-lg，硫酸锰0.001-0.2g，碳酸钙1-30g，蒸馏水1000ml，调节ph值5.5-7.5。

3.甘露聚糖酶的生产步骤：

产酶菌种经过一级种子接种和培养、二级种子的接种和培养、发酵、絮凝、压滤、超滤、精滤、喷雾干燥和筛分，从而得到固体甘露聚糖酶制剂。

4.按照复合生物制剂中的地衣芽孢杆菌活菌数为1.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/g，屎肠球菌活菌数为1.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/g，植物乳杆菌活菌数为1.0×10⁸-1.0×10¹⁰cfu/g，甘露聚糖酶酶活为1000-10000u/g，将地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、植物乳杆菌和甘露聚糖酶产品与沸石粉等载体进行混合均匀即可制成调节母猪肠道健康的复合生物制剂。

实施例4复合生物制剂对繁殖母猪生产性能、粪便形态及粪便微生物的影响

1材料与方法

1.1试验动物及分组

本试验选取120头配种时间接近、胎次大致相同、体重接近、健康状况良好的妊娠60天的长×大二元妊娠母猪，随机分为四组。对照组饲喂基础日粮，试验i组在基础日粮中添加0.5kg/吨的复合生物制剂，试验ii组在基础日粮中添加1kg/吨的复合生物制剂，试验iii组在基础日粮中添加2kg/吨的复合生物制剂，每组30头母猪。试验过程中保证两组试验母猪及其所产仔猪的饲养条件一致，母猪从试验开始至妊娠第90天饲喂妊娠期日粮，妊娠90天至试验结束饲喂哺乳期日粮，试验时间为妊娠60天至断奶28天。

1.2饲养管理

按猪场常规方法进行饲养管理，妊娠猪限位栏饲养，每日喂2次(08：00和l6：30)，每次以基本吃完为准，自由饮水。供试母猪在分娩前1周迁移至产仔舍，母猪在哺乳期间自由采食。

1.3测定指标及方法

1.3.1母猪生产性能指标测定

在整个试验期间，观察对照组和试验组母猪及所产仔猪的健康状况，分别记录2组母猪的平均日采食量，测定窝产仔数、平均初生重、断奶仔猪平均窝重等。

1.3.2母猪粪便形态及粪便微生物指标测定

观察母猪粪便形态，并按粪便形态评分标准计分(见表6)。

表6粪便形态评分标准

试验结束当天，分别随机选取8头哺乳母猪，采集其新鲜粪便，置于冷藏盒中保存，分别测定粪便中乳酸菌和大肠菌群的活菌数。

2试验结果

2.1复合生物制剂对母猪生产性能的影响

由表7可以看出，试验组母猪平均日采食量显著高于对照组，平均日采食量提高280g以上。各组之间窝产仔数和平均初生重没有显著差异，试验组断奶仔猪平均重较对照组增加了90g以上，显著高于对照组。结果表明，添加复合生物制剂能够提高母猪的采食量和生产性能，提高断奶仔猪平均体重。

表7复合生物制剂对母猪生产性能的影响

注：同行数据后标有不同字母者表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p＞0.05)。结果以平均数±标准差表示，下同。

2.2复合生物制剂对母猪粪便形态和粪便微生物的影响

由表8可知，粪便形态得分试验组与对照组之间差异显著，试验组母猪便秘率较对照组降低10个百分点以上(p<0.05)。此外，试验组母猪粪便中乳酸菌含量显著高于对照组，试验组母猪粪便中大肠菌群含量显著低于对照组，降低4.74％以上。试验结果表明，饲喂复合生物制剂能够明显改善母猪肠道菌群，提高有益菌数量，降低有害菌数量，降低母猪便秘率。

表8复合生物制剂对母猪粪便形态及粪便微生物的影响

3结论

母猪日粮中添加0.05-0.2‰的复合生物制剂，能够显著提高母猪的生产性能，明显改善母猪肠道菌群，提高有益菌数量，降低有害菌数量，降低母猪便秘率。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>北京科为博生物科技有限公司

<120>一种调节母猪肠道健康的复合生物制剂及其制备方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1113

<212>dna

<213>地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)

<400>1

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