本发明涉及饲料领域，特别涉及一种饲料添加剂及其制备方法。
背景技术：
益生菌(probiotics)是一类对宿主有益的活性微生物，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。国内外水产养殖业应用的益生菌种类主要有乳酸杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、酵母菌和肠球菌等。益生菌在动物肠道酸性环境中具有较高的稳定性，能够抑制有害菌生长，提高机体免疫力，同时参与了机体的新陈代谢，提供营养物质，促进动物生长发育，已在水产养殖业中广泛使用。
中草药多糖作为中草药活性物质的主要组成成分之一，在水产动物营养与饲料领域中也得到广泛的关注和应用。玉屏风多糖作为水产饲料添加剂或免疫增强剂，已证实具有改善肠道形态结构、提高机体免疫力，促进动物生长发育和健康的作用。
乌鳢俗称黑鱼，属鲈形目、鳢科、鳢属，凶猛的肉食性鱼类，其肉味鲜美，且具祛瘀活血、怯寒调养、生肌补血等多种药理作用，具有较高经济价值与营养医学价值。在抗生素滥用导致水环境恶化、水产动物疾病频发的现今，寻求新的绿色环保的抗生素替代品成为水产领域的研究热点。已有研究证实，两种或两种以上的不具拮抗作用的益生菌混合而成的复合益生菌其作用效果明显优于单一益生菌。
然而，关于复合益生菌和中草药多糖联合使用对水产动物的影响的研究报道甚少，尚未知晓复合益生菌与中草药多糖在饲料添加剂中的联合使用会产生拮抗作用还是会带来更完善的有益效果。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种复合饲料添加剂，同时提供该添加剂的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：一种复合饲料添加剂，其包括复合益生菌和玉屏风多糖，所述复合益生菌与玉屏风多糖按原料质量份计比例为1:1，所述复合益生菌由乳酸菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌按原料质量份计比例为1:1:1混合而成。
作为上述方案的进一步改进，所述复合益生菌中乳酸菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌的有效活菌量均≥1.0×109cfu/ml。
一种如上所述的一种复合饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括如下工艺步骤：
1)取玉屏风药渣按料液比为1:10～15置于去离子水中浸泡20～60min，后置于100℃水中水浴回流提取1～1.5h，重复两次后合并滤液，滤液冷却后重复真空抽滤两次，再加热浓缩至原体积的0.4倍，冷却得浓缩液；
2)浓缩液中加入95～98％的酒精，搅拌，于0～8℃条件下静置10～14h，过滤得沉淀物，将沉淀物干燥，即得粉末状的玉屏风多糖，备用；
3)在无菌环境条件下分别对乳酸菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌进行分离纯化、液体培养和发酵培养，将乳酸杆菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵产物分别置于38℃下烘干至水含量为7％，按原料质量份计比例为1:1:1混合，得复合益生菌，备用；
4)将步骤2)所得的玉屏风多糖与步骤3)所得的复合益生菌按原料质量份计比例为1:1混合，得成品。
作为上述方案的进一步改进，步骤3)中所述分离纯化的具体工艺步骤为：乳酸杆菌和双歧杆菌选用mrs固体培养基，其按质量百分含量计成分包括1％蛋白胨、0.8％牛肉膏、0.4％酵母膏、2％葡萄糖、0.2％磷酸二氢钾、0.2％柠檬酸氢二铵、0.5％乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.004％硫酸锰、0.1％吐温80、1.4％琼脂，调节mrs固体培养基ph值为6.3～6.7，121℃下高压灭菌15min后进行培养，培养温度为30～37℃，培养时间20～24h；枯草芽孢杆菌选用含有可溶性淀粉的lb培养基，其按质量百分含量计成分包括1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、0.5％氯化钠、1％可溶性淀粉，1.5％琼脂，调节lb培养基ph值为7.1～7.5，121℃下高压灭菌15min后进行培养，培养温度为30～37℃，培养时间20～24h。
作为上述方案的进一步改进，步骤3)中所述液体培养的具体工艺步骤为：将分离纯化后的乳酸杆菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌分别进行液体培养，其中乳酸杆菌和双歧杆菌的液体培养基按质量百分含量计成分包括1％蛋白胨、2％酵母膏、2％葡萄糖、0.2％磷酸二氢钾、0.2％柠檬酸氢二铵、0.5％乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.005％硫酸锰、0.1％吐温80，调节ph值为6.3～6.7，121℃下高压灭菌15min后进行培养，培养温度为30～37℃，培养时间20～24h；枯草芽孢杆菌的液体培养基按质量百分含量计成分包括豆饼粉5％，玉米粉7％，0.5％na2hpo4，0.4％(nh4)2so4，0.2％nh4cl，0.2％cacl2，调节ph值为7.1～7.5，121℃下高压灭菌15min后进行培养，培养温度为30～37℃，培养时间20～24h。
作为上述方案的进一步改进，步骤3)中所述发酵培养的具体工艺步骤为：将液体扩容培养后的乳酸杆菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌分别进行液体培养，其中乳酸杆菌和双歧杆菌的发酵培养基按质量百分含量计成分包括1％蛋白胨、2％酵母膏、2％葡萄糖、0.2％磷酸二氢钾、0.2％柠檬酸氢二铵、0.5％乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.005％硫酸锰、0.1％吐温80，调节ph值为6.3～6.7，121℃下高压灭菌15min后进行培养，培养温度为30～37℃，培养时间20～24h，所得乳酸杆菌的发酵产物和双歧杆菌的发酵产物的有效活菌量均≥1.0×109cfu/ml；枯草芽孢杆菌的发酵培养基按质量百分含量计成分包括5％豆饼粉，7％玉米粉，0.5％na2hpo4，0.4％(nh4)2so4，0.2％nh4cl，0.2％cacl2，调节ph值为7.1～7.5，121℃下高压灭菌15min后进行培养，培养温度为30～37℃，培养时间20～24h，所得枯草芽孢杆菌的发酵产物的有效活菌量≥1.0×109cfu/ml。
本发明的有益效果是：
本发明将玉屏风多糖与特定的复合益生菌复配，并限定复配的比例，使其对水产动物具有平衡肠道菌群的作用，从而有效增强水产动物对营养物质的消化和吸收，改善水产动物肠道形态结构，并在促进水产动物生长发育的同时有效提高水产动物免疫细胞的活性，进一步提高水产动物机体的免疫力和抵抗力。
本发明的制备方法工艺简单，操作性强，有利于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1
一种复合饲料添加剂，其包括复合益生菌和玉屏风多糖，所述复合益生菌与玉屏风多糖按原料质量份计比例为1:1，所述复合益生菌由乳酸菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌按原料质量份计比例为1:1:1混合而成。
制备方法：
1)取玉屏风药渣按料液比为1:14置于去离子水中浸泡30min，后置于100℃水中水浴回流提取1.2h，重复两次后合并滤液，滤液冷却后重复真空抽滤两次，再加热浓缩至原体积的0.4倍，冷却得浓缩液；
2)浓缩液中加入98％的酒精，搅拌，于3℃条件下静置12h，过滤得沉淀物，将沉淀物干燥，即得粉末状的玉屏风多糖，备用；
3)在无菌环境条件下分别对乳酸菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌进行分离纯化、液体培养和发酵培养，将乳酸杆菌、双歧杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵产物分别置于38℃下烘干至水含量为7％，按原料质量份计比例为1:1:1混合，得复合益生菌，备用；
4)将步骤2)所得的玉屏风多糖与步骤3)所得的复合益生菌按原料质量份计比例为1:1混合，得实施例1成品。
实施例2：相关试验
1、试验材料
对照组为100％的基础饲料，其组成成分及营养成分如下表1所示。试验组为在基础饲料中添加0.8％的实施例1成品。
表1基础饲料组成成分及营养成分(风干基础)
2、试验管理
选取平均体重为(23±0.15)g的健康乌鳢120尾随机分成2组，即对照组和试验组，每组3重复，每重复20尾。预试期7d，正式期56d，试验期间保持24h充氧，水温为28±0.5℃，定点投喂(8:00和16:00)，日投喂量为总体重的2～4％，根据摄食情况适当调整投喂量。
3、试验方法
3.1生长性能
试验正式开始和试验结束(第56天)，对禁食24h后的乌鳢进行称重和计数，并准确记录采食量、体重等指标，计算增重率、特定生长率、饵料系数和成活率。
3.2肠道形态测定
试验结束后(第56d)，无菌环境下解剖乌鳢，选取长度约1cm的中肠。采用carnoy’s固定液固定肠道12～24h后，石蜡包埋，切片，常规苏木精-伊红(he)染色，并用image-pro6.0图像处理软件测定绒毛高度、隐窝深度和肌层厚度，计算绒腺比。
3.3血清生化指标性测定
试验结束后(第56d)，对禁食24h后的乌鳢进行尾静脉采血，室温下静置一段时间后，于4℃、3000r/min离心5min，移取分装上层血清。测定总超氧化物歧化酶(t-sod)和溶菌酶(lsz)的活性，均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
3.4mhci相对表达量测定
试验结束后(第56天)，解剖分离鱼体肝脏、肾脏、鳃丝和肌肉，参照primescripttmrtreagentkit(takara公司)的说明书进行总rna的提取与cdna反转录。
根据ncbi上乌鳢mhci(genebank：acf74832.1)基因序列设计引物，其中上游引物的序列如seqidno1，下游引物的序列如seqidno2，pcr目的基因引物序列信息如下表2所示。
表2目的基因引物序列
采用takara
4、数据处理与分析
所有数据均以“均值±标准差”表示，采用spss19.0进行单因素方差分析和duncan's氏法进行多重比较分析试验结果的差异显著性，显著水平为p<0.05。
5、试验结果
5.1对乌鳢生长性能的影响
对乌鳢生长性能的影响如下表3所示。由表3可知，直至试验结束，没有鱼只出现死亡。试验组的增重率和特定生长率显著高于对照组(p<0.05)，饲料系数则显著降低(p<0.05)。
表3对乌鳢生长性能的影响
注：同行肩标不同小写字母者表示差异显著(p＜0.05)
5.2对乌鳢肠道形态结构的影响
对乌鳢肠道形态结构的影响如下表4所示。由表4可知，试验组对肠绒毛高度、隐窝深度和肌层厚度有一定的作用，试验组的肠绒毛高度较对照组显著提高了17.0％(p＜0.05)，隐窝深度与对照组无显著性差异(p＞0.05)，绒腺比表现为试验组＞对照组，有显著性差异(p＜0.05)。与对照组相比，试验组的肌层厚度提高13.1％，有显著性差异(p＜0.05)。
表4对乌鳢肠道形态结构的影响
注:同行肩标不同小写字母者表示差异显著(p＜0.05)
5.3对乌鳢血清生化指标的影响
对乌鳢肠道形态结构的影响如下表5所示。由表5可知，经过56d的饲养，血清溶菌酶(lsz)活性表现为试验组显著高于对照组34.02％(p＜0.05)。与lsz结果基本一致，试验组血清总超氧化歧化酶(t-sod)活性较对照组显著提高了40.3％(p＜0.05)，试验组间无显著性差异(p＞0.05)。
表5对血清生化指标的影响
注:同行肩标不同小写字母者表示差异显著(p＜0.05)
5.4对乌鳢mhci相对表达量的影响
对乌鳢肠道形态结构的影响如下表6所示。由表6可知，mhci在乌鳢肾脏、肝脏、鳃丝和肌肉中均有不同程度的表达，以肾脏mhci的表达量最高，肝脏、鳃丝次之。另一方面，肾脏、肝脏、肌肉和鳃丝中mhci表达量以试验组较高。
表6mhci在乌鳢不同组织中的相对表达量
江:同行肩际不同小写字母者表示奉异显著(p＜0.05)
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
sequencelisting
<110>佛山科学技术学院
<120>一种复合饲料添加剂及其制备方法
<130>2018.11.1
<160>2
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工合成
<400>1
agtggctgaagaagtatgtg20
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工合成
<400>2
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