一种聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的制备方法及其应用与流程

本发明涉及饲料添加剂领域，一种聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的制备方法及其应用。

背景技术：

硒和锌是动物机体必需的微量元素之一，可促进仔猪生长，降低其腹泻率，在动物的生长、繁殖、免疫、抗氧化和抗炎症方面起着重要的作用。动物生长过程中的每个细胞，组织，器官，腺体和免疫系统均需要一些微量元素才能维持正常的代谢平衡，其中锌和硒主要从饲料中吸收，对生长过程至关重要。缺乏这些元素会导致代谢异常，出现生长不良甚至诱发疾病。由于我国约有72％的地区低硒或缺硒，同时天然饲料无法提供足够的锌硒元素，所以通过饲料补硒补锌成为了一种必要措施。然而，目前在饲料使用高剂量的亚硒酸钠、硫酸锌添加存在许多缺陷，其负面效果包括：饲料使用的亚硒酸钠、硫酸锌原料常含重金属，大量饲用增加了肉类制品的毒性，也是环境的安全隐患。目前饲料中所采用的添加量在短期内能够促进仔猪生长，但长期饲喂会使仔猪的采食量下降、并降低其他营养素的效价，其毒性还诱发仔猪贫血等症状。相比于亚硒酸钠，有机硒生物利用率高、毒性小，能显著提高动物组织、奶和蛋中的硒水平，提高动物的生产性能，蛋白硒作为一种较为理想的有机硒制剂，在动物饲养方面具有广阔的应用前景。另外，不同微量元素在仔猪体内的吸收水平也具有差别，各种微量元素的添加量与比例也是控制饲料添加剂添加量的难题。因此，目前亟待解决的问题是如何提高饲料中锌和硒的生物利用率，从而降低用量，为广大民众提供安全绿色的肉类制品。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的制备方法，将此脂质体作为饲料添加剂；本发明脂质体表面通过聚乙二醇修饰从而提高纳米脂质体在体内的循环时间，本发明还得到了包封率高、稳定性好以及具有体内长循环的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

本发明为解决上述技术问题，提供的技术方案为：一种聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的制备方法，其特征在于：其步骤为：在以大豆卵磷脂和胆固醇为活性剂，无水乙醇为有机溶剂的反胶束体系内；按比例添加蛋白硒与硫酸锌的水溶液，完成活性剂对蛋白硒与硫酸锌的包封，随后蒸发掉无水乙醇，然后再次添加大量的聚乙二醇，利用超声仪内进行超声分散完成聚乙二醇对脂质体的修饰，随后分离聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

进一步的技术方案在于：其包括如下步骤：

(1)将大豆卵磷脂与胆固醇按比例溶解于无水乙醇，随后超声处理，使其充分溶解，使溶液透明；

(2)按比例称取蛋白硒和硫酸锌，添加水，进行超声处理完成溶解分散；随后将其添加至步骤(1)中的溶液，在惰性气体的环境下完成以大豆卵磷脂与胆固醇为活性剂对蛋白硒与硫酸锌的包封；

(3)在旋转蒸发仪上对步骤(2)得到的产品进行室温减压蒸发，完成无水乙醇的去除；

(4)在步骤(3)减压蒸发过程中发现形成一种高粘度的凝胶，几乎完全粘附在圆底烧瓶的玻璃表面时，加入大量聚乙二醇，随后超声分散；

(5)将步骤(4)得到的产品进行聚乙二醇减压蒸发处理，除去痕量的聚乙二醇，随后透析及过sepharose4b柱，分离脂质体和未包封的物质，得到高纯度、粒度分布均匀在100～200nm以及高包封率的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

进一步的技术方案在于：步骤(1)中，大豆卵磷脂为30～50mg，胆固醇为5～10mg，无水乙醇为3～6ml，超声处理后制得脂相；步骤(2)中，蛋白硒为3～5mg，硫酸锌为3～5mg，溶解于1～2ml水中，制得水相；在完成以大豆卵磷脂与胆固醇为活性剂对蛋白硒与硫酸锌的包封处理过程中，水相与脂相的比例为1～2:3～6。

进一步的技术方案在于：上述所述制备方法制备的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体作为饲料添加剂的应用。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.本发明将作为饲料添加剂的蛋白硒和硫酸锌包覆至纳米脂质体内部，能够在动物体内缓慢释放蛋白硒和硫酸锌，促进了两种元素的吸收，进而制备的纳米脂质体可以在减少蛋白硒和硫酸锌的用量的同时实现更好的作用效果，极大地缓解了蛋白硒和硫酸锌给动物机体带来的毒性，减轻了金属元素对环境的影响；

2.本发明通过聚乙二醇对蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的修饰，延长了纳米脂质体在体内的循环时间，增加了动物对硒锌元素的吸收，可以进一步提高这两种元素在体内循环时的生物相容性和生物利用率；

3.本发明制备的纳米脂质体生物相容性好，包封率高，且其粒度分布在100～200nm，不易被脾脏及肝脏吞噬；

4.本发明基于蛋白硒与硫酸锌在仔猪体内的吸收水平，确定了最佳的硒锌含量配比并包覆于脂质体中，能够在仔猪体内完成最佳的硒与锌的吸收；

5.本发明在温和的条件下完成，制备方法简单，反应易控制，重复性高，利于实现大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1获得的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的tem图。

图2为本发明实施例2获得的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的粒径分布图。

图3为本发明实施例3获得的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的电位图。

图4为本发明实施例2获得的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的蛋白硒释放图。

图5为本发明实施例3获得的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的硫酸锌释放图。

具体实施方式

本发明阐述了一种聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的制备方法，其步骤为：

在以大豆卵磷脂和胆固醇为活性剂，无水乙醇为有机溶剂的反胶束体系内；按比例添加蛋白硒与硫酸锌的水溶液，完成活性剂对蛋白硒与硫酸锌的包封，随后蒸发掉无水乙醇，然后再次添加大量的聚乙二醇，利用超声仪内进行超声分散完成聚乙二醇对脂质体的修饰，随后分离聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

本发明实施例中，其包括如下步骤：

(1)将大豆卵磷脂与胆固醇按比例溶解于无水乙醇，随后超声处理，使其充分溶解，使溶液透明；

(2)按比例称取蛋白硒和硫酸锌，添加水，进行超声处理完成溶解分散；随后将其添加至步骤(1)中的溶液，在惰性气体的环境下完成以大豆卵磷脂与胆固醇为活性剂对蛋白硒与硫酸锌的包封；

(3)在旋转蒸发仪上对步骤(2)得到的产品进行室温减压蒸发，完成无水乙醇的去除；

(4)在步骤(3)减压蒸发过程中发现形成一种高粘度的凝胶，几乎完全粘附在圆底烧瓶的玻璃表面时，加入大量聚乙二醇，随后超声分散；

(5)将步骤(4)得到的产品进行聚乙二醇减压蒸发处理，除去痕量的聚乙二醇，随后透析及过sepharose4b柱，分离脂质体和未包封的物质，得到高纯度、粒度分布均匀在100～200nm以及高包封率的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

本发明实施例中，步骤(1)中，大豆卵磷脂为30～50mg，胆固醇为5～10mg，无水乙醇为3～6ml，超声处理后制得脂相；步骤(2)中，蛋白硒为3～5mg，硫酸锌为3～5mg，溶解于1～2ml水中，制得水相；在完成以大豆卵磷脂与胆固醇为活性剂对蛋白硒与硫酸锌的包封处理过程中，水相与脂相的比例为1～2:3～6。

本发明实施例中，制备的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体作为饲料添加剂的应用。

本发明实施例中，其步骤为：

(1)将30～50mg大豆卵磷脂，5～10mg胆固醇置于圆底烧瓶中，加入3～6ml无水乙醇，超声将其充分溶解，使溶液透明无沉淀；

(2)称取3～5mg蛋白硒以及3～5mg硫酸锌混合物，按照3:5～5:3的比例溶解于1～2ml水，超声使其充分溶解，随后将其加入上述无水乙醇溶液中，并使体系始终处于惰性气体环境中，注意维持水相与脂相的比例为1～2:3～6，以得到最大的包封率；

(3)为了形成反胶束，将两相体系置于水浴式超声仪中进行超声，直至混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止。通常超声2～5min即可。关键在于使反胶束的均匀分散体在有机相中保持稳定，即超声后至少20～30min不分层，保持超声温度低于5～10℃；

(4)将混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发除去有机溶剂(无水乙醇)，转速约为75～95r/min。在溶剂蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾，一旦出现起泡或沸腾的现象，立即降低真空度，将有机相除尽大约需要20～30min；

(5)随着大部分溶剂的蒸发，混合物形成一种高粘度的凝胶，几乎完全粘附在圆底烧瓶的玻璃表面。当达到某一个临界点，凝胶塌陷，且在5～10min内变为水浑浊液。此时，加入过量的聚乙二醇溶液(5～10mg/ml)，超声分散；

(6)在进一步减压的条件下，将混合物再旋转蒸发15～20min，除去痕量的有机溶剂；通过透析以及过sepharose4b柱，分离脂质体和未包封的物质，得到高纯度、粒度分布均匀以及高包封率的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

利用上述方法，进行下述具体实施例：

实施例1

将30mg大豆卵磷脂(购于沈阳天峰生物有限公司)，5mg胆固醇(购于天津市大茂化学仪器供应站)置于圆底烧瓶中，加入3ml无水乙醇，超声将其充分溶解，使溶液透明无沉淀；称取3mg蛋白硒(购于河南永顺化工有限公司)以及5mg硫酸锌(购于天津市鼎盛鑫化工有限公司)混合物，溶解于1ml水，超声使其充分溶解，随后将其加入上述无水乙醇溶液中，并使体系始终处于惰性气体环境中，注意维持水相与脂相的比例为1:3，以得到最大的包封率。为了形成反胶束，将两相体系置于水浴式超声仪中进行超声，直至混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止。通常超声2min即可。关键在于使反胶束的均匀分散体在有机相中保持稳定，即超声后至少20min不分层，保持超声温度低于5℃；

将混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发除去有机溶剂(无水乙醇)，转速约为75r/min。在溶剂蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾，一旦出现起泡或沸腾的现象，立即降低真空度，将有机相除尽大约需要20min。随着大部分溶剂的蒸发，混合物形成一种高粘度的凝胶，几乎完全粘附在圆底烧瓶的玻璃表面。当达到某一个临界点，凝胶塌陷，且在5min内变为水浑浊液。此时，加入过量的聚乙二醇溶液(5mg/ml)，超声分散。在进一步减压的条件下，将混合物再旋转蒸发15～20min，除去痕量的有机溶剂。通过透析、过sepharose4b柱或离心，分离脂质体和未包封的物质，得到高纯度、粒度分布均匀以及高包封率的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

应用透射电子显微镜对聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体进行形貌表征，如图1所示，从该图片可以看出，聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体为球形，粒径约为150nm左右，形貌规则，粒径均一。

实施例2

将40mg大豆卵磷脂(购于沈阳天峰生物有限公司)，8mg胆固醇(购于天津市大茂化学仪器供应站)置于圆底烧瓶中，加入8ml无水乙醇，超声将其充分溶解，使溶液透明无沉淀；称取4mg蛋白硒(购于河南永顺化工有限公司)以及4mg硫酸锌(购于天津市鼎盛鑫化工有限公司)混合物，溶解于2ml水，超声使其充分溶解，随后将其加入上述无水乙醇溶液中，并使体系始终处于惰性气体环境中，注意维持水相比与脂相的比例为1:4，以得到最大的包封率。为了形成反胶束，将两相体系置于水浴式超声仪中进行超声，直至混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止。通常超声3min即可。关键在于使反胶束的均匀分散体在有机相中保持稳定，即超声后至少25min不分层，保持超声温度低于10℃；

将混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发除去有机溶剂(无水乙醇)，转速约为85r/min。在溶剂蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾，一旦出现起泡或沸腾的现象，立即降低真空度，将有机相除尽大约需要25min。随着大部分溶剂的蒸发，混合物形成一种高粘度的凝胶，几乎完全粘附在圆底烧瓶的玻璃表面。当达到某一个临界点，凝胶塌陷，且在8min内变为水浑浊液。此时，加入过量的聚乙二醇溶液(10mg/ml)，超声分散。在进一步减压的条件下，将混合物再旋转蒸发20min，除去痕量的有机溶剂。通过透析、过sepharose4b柱或离心，分离脂质体和未包封的物质，得到高纯度、粒度分布均匀以及高包封率的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

应用激光粒度仪对聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的粒径进行分析，如图2所示，从该图可以看出，聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的粒径分布为100～200nm。应用icp-ms对聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体中蛋白硒和硫酸锌的释放进行研究，如图4所示，在24小时胃酸的环境中，蛋白硒的释放量在70％以上，说明聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体在胃酸环境下具有良好的蛋白硒缓释能力。

实施例3

将50mg大豆卵磷脂(购于沈阳天峰生物有限公司)，10mg胆固醇(购于天津市大茂化学仪器供应站)置于圆底烧瓶中，加入6ml无水乙醇，超声将其充分溶解，使溶液透明无沉淀；称取5mg蛋白硒(购于河南永顺化工有限公司)以及3mg硫酸锌(购于天津市鼎盛鑫化工有限公司)混合物，溶解于1ml水，超声使其充分溶解，随后将其加入上述无水乙醇溶液中，并使体系始终处于惰性气体环境中，注意维持水相比与脂相的比例为1:6，以得到最大的包封率。为了形成反胶束，将两相体系置于水浴式超声仪中进行超声，直至混合物变为澄清的单相分散体或有乳光的均匀分散体为止。通常超声5min即可。关键在于使反胶束的均匀分散体在有机相中保持稳定，即超声后至少30min不分层，保持超声温度低于10℃；

将混合物置于旋转蒸发仪中，室温，减压蒸发除去有机溶剂(无水乙醇)，转速约为95r/min。在溶剂蒸发过程中，必须完全避免起泡或沸腾，一旦出现起泡或沸腾的现象，立即降低真空度，将有机相除尽大约需要30min。随着大部分溶剂的蒸发，混合物形成一种高粘度的凝胶，几乎完全粘附在圆底烧瓶的玻璃表面。当达到某一个临界点，凝胶塌陷，且在10min内变为水浑浊液。此时，加入过量的聚乙二醇溶液(10mg/ml)，超声分散。在进一步减压的条件下，将混合物再旋转蒸发20min，除去痕量的有机溶剂。通过透析、过sepharose4b柱或离心，分离脂质体和未包封的物质，得到高纯度、粒度分布均匀以及高包封率的聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体。

应用激光粒度仪对聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的zeta电位进行分析，如图3所示，从该图可以看出，空白纳米脂质体的zeta电位约为-25mv，聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体的zeta电位约为-30mv，聚乙二醇修饰后zeta电位约为-33mv，三者相差不大，说明包覆蛋白硒和硫酸锌以及聚乙二醇的修饰不会对纳米脂质体的电位造成影响。应用icp-ms对聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体中蛋白硒和硫酸锌的释放进行研究，如图4，图5所示，在24小时胃酸的环境中，硫酸锌的释放量在80％左右，说明聚乙二醇修饰的蛋白硒-硫酸锌纳米脂质体在胃酸环境下具有良好的硫酸锌缓释能力。